CN112730695A - 一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法，包括如下步骤：①配制18种氨基酸的标准溶液；②样品处理：③高效液相色谱分析；④计算求得样品中的各氨基酸的含量。本发明的方法简单，适用于新鲜烟叶中18种游离氨基酸的含量分析。

Description

一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法
技术领域
本发明属于烟草技术领域，具体涉及一种自动衍生高效液相色谱法测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法。
背景技术
氨基酸是烟草中一类重要化合物，在烟草生长、调制、醇化、加工直至成品卷烟抽吸过程中，氨基酸与烟草中的还原糖发生非酶棕化反应，生成多种香味前体物质，某些氨基酸如苯丙氨基酸还可以自身分解成香味化合物，对形成优美的烟草香气和吸味有重要贡献。因此分析烟草中氨基酸含量，对烟草品质评价及卷烟配方设计等均有重要意义。
烟草氨基酸的分析方法有直接测定法和间接测定法，直接测定法有离子色谱-脉冲安培检测法和液相色谱-串联质谱法。间接测定法有柱前衍生和柱后衍生法。柱后衍生稳定好，行业标准YC/T 282-2009即采用柱后衍生法，但柱后衍生法需要专用的衍生设备，分析耗时，且仪器用途单一；柱前衍生则无需专用的反应装置，使用更为灵活广泛。测定烟草氨基酸的柱前衍生法主要有邻苯二醛(OPA)法、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)法、4-硝基苯甲酰氯法。OPA法操作简便，但无法测定二级氨基酸；AQC法能同时与一级和二级氨基酸迅速反应，但操作过于繁琐；4-硝基苯甲酰氯法也能同时测定一级和二级氨基酸，但色谱分离困难，必须使用液相色谱串联质谱的多反应监测模式分析，对仪器配置要求很高。
异硫氰酸苯酯(PITC)法分析氨基酸具有反应快速、产物单一稳定、操作相对简单、与一级、二级氨基均可反应等特点，已应用于食品、中药材、饲料等领域氨基酸的分析。但因为氨基酸成分多，极性相近，分离比较困难，因此一些专业公司开发了配套的专用色谱柱，如SMA氨基酸色谱柱、Venusil AA氨基酸色谱柱、Ultimate Amino Acid氨基酸色谱柱等，这些氨基酸色谱柱价格相对较高，色谱条件相对苛刻。
为解决上述问题提出本发明。
发明内容
本研究采用异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生试剂、使用自动样品处理台自动柱前衍生、常规液相色谱柱分离，建立了新鲜烟叶中18游离氨基酸的分析方法，以期为烟草品质评价和代谢研究提供技术支持。
本发明的技术方案如下：
一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法，包括如下步骤：
①配制18种氨基酸的标准溶液；
②样品处理：称取一定量冻干的新鲜烟叶粉末加入水中超声提取、过滤，得到的滤液进一步处理后用于分析；
③高效液相色谱分析：分析条件为：色谱柱：Waters SunFire C18，规格：4.6×150mm，5μm；流动相：A为0.1mol/L乙酸钠水溶液、pH 6.50，B为80％(V/V)乙腈；洗脱程序：0-5min，100％A；5-13.5min，100％-94％A；13.5-18min，94％-84％A；18-25min，84％-72％A；25-28min，72％-0A；28-32min，0A；32-33min，0-100％；33-40min，100％。流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：254nm；
④计算：采用外标法进行定量分析，即以步骤①的18种氨基酸不同浓度对应峰面积进行回归分析，得到标准曲线，使得相关系数不小于0.99；对步骤②进一步处理后的滤液进行测定，测得各氨基酸的峰面积，代入标准曲线求得样品中的各氨基酸的含量。
优选地，步骤①中18种氨基酸分别为丙氨酸(alanine)、天冬氨酸(asparticacid)、精氨酸(arginine)、胱氨酸(cystine)、甘氨酸(glycine)、谷氨酸(glutamic acid)、组氨酸(histidine)、异亮氨酸(isoleucine)、亮氨酸(leucine)、赖氨酸(lysine)、甲硫氨酸(methionine)、苯丙氨酸(phenylalanine)、脯氨酸(proline)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、色氨酸(tryptophan)、酪氨酸(tyrosine)和缬氨酸(valine)。
优选地，18种氨基酸的标准溶液的配制步骤为：分别称取18种氨基酸标准物质0.025g至25mL容量瓶中，精确至0.0001g，用0.01mol/L的HCl定容，配制成浓度为1000μg/mL的单一标准储备液；然后移取每种单一标准储备液各1mL至10mL容量瓶中，用0.01mol/L的HCl定容，得到每种氨基酸浓度为100μg/mL的混合储备液，4℃保存备用。
优选地，步骤②中样品处理的步骤为：准确称取粉碎后的冻干烟叶粉末0.2g于15mL离心管中，加入5mL水超声提取30min后过滤得到滤液；准确移取0.5mL得到的滤液于5mL离心管中，分别加入14％三乙胺-乙腈溶液和1.2％异硫氰酸苯酯(PITC)-乙腈溶液各0.5mL，混匀，室温静置30min后，加入1mL正己烷，旋涡振荡60s后，8000r/min高速离心5min，取上层清液用水稀释5倍，经0.45μm有机滤膜过滤后上机分析。
优选地，步骤④的18种标准氨基酸的定量限为0.03～0.10mg/g；每个浓度3次进样、平均校正，得到18种氨基酸的线性范围介于2～50μg/mL，相关系数不小于0.99。
优选地，步骤④的样品其中的天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸按0.05、0.10、0.20mg/g的3个水平添加；其中的精氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸按0.10、0.20、0.40mg/g的3个水平添加；每个水平重复6次。
本发明的有益效果如下：
1、新鲜烟叶中氨基酸成分多，极性相近，分离比较困难，因此一些专业公司开发了配套的专用色谱柱，价格相对较高，色谱条件相对苛刻。本发明使用的是实验室常见的色谱柱Waters SunFire C18，规格为4.6×150mm，5μm；色谱柱分离时间相对较短，色谱分离度较好，完全能满足分析效果。
2、本发明的方法首次采用PITC柱前衍生分析烟草游离氨基酸。
3、本发明的分析方法能简便地测定烟草氨基酸含量，特别是解决其他方法(如OPA法)难以测定脯氨酸(pro)的问题。
4、现有技术提取烟叶中氨基酸多使用醇提取或酸提取。本发明发现，使用乙醇提取，提取物颜色较深，分析干扰较大；使用水提取和酸提取没有本质差别，因本发明采用超纯水提取。
5、本发明18种氨基酸标准溶液在所述的色谱条件下进样分析，每个浓度3次进样、平均校正，得到18种氨基酸的线性范围介于2～50μg/mL，线性关系良好，决定系数均大于0.99。根据最小检测浓度的3倍相对标准偏差为仪器检出限、10倍相对标准偏差为仪器定量限，结合前处理的样品质量、提取体积和稀释倍数等计算，本方法对18种氨基酸的定量限为0.03～0.10mg/g，能满足18种氨基酸的含量分析要求。
附图说明
图1为18种氨基酸标准溶液PITC衍生物色谱图。
图2为新鲜烟叶样品中18种氨基酸PITC衍生物色谱图
附图标记为：1-天冬氨酸、2-谷氨酸、3-丝氨酸、4-甘氨酸、5-组氨酸、6-精氨酸、7-苏氨酸、8-丙氨酸、9-脯氨酸、10-酪氨酸、11-缬氨酸、12-甲硫氨酸、13-胱氨酸、14-异亮氨酸、15-亮氨酸、16-苯丙氨酸、17-色氨酸、18-赖氨酸。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
材料与试剂
18种氨基酸标准品购自sigma-aldrich公司，包括丙氨酸(alanine)、天冬氨酸(aspartic acid)、精氨酸(arginine)、胱氨酸(cystine)、甘氨酸(glycine)、谷氨酸(glutamic acid)、组氨酸(histidine)、异亮氨酸(isoleucine)、亮氨酸(leucine)、赖氨酸(lysine)、甲硫氨酸(methionine)、苯丙氨酸(phenylalanine)、脯氨酸(proline)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、色氨酸(tryptophan)、酪氨酸(tyrosine)、缬氨酸(valine)等18种氨基酸。
异硫氰酸苯酯(PITC)、三乙胺(TEA)，色谱纯，纯度均大于99.0％，购于sigma-aldrich公司。
仪器与设备
Agilent 1200高效液相色谱仪(配备二极管阵列检测器，美国Agilent公司)，JP-080超声波清洗机(深圳洁盟清洗设备有限公司)，Eppendorf5804台式离心机(德国Eppendorf公司)。
实施例
本实施例的测定新鲜烟叶中18种氨基酸的方法，包括以下步骤：
步骤一、标准溶液配置：
分别称取18种氨基酸标准物质0.025g至25mL容量瓶中，精确至0.0001g，用0.01mol/L的HCl定容，配制成浓度为1000μg/mL的单一标准储备液。然后移取每种单一标准储备液各1mL至10mL容量瓶中，用0.01mol/L的HCl定容，得到每种氨基酸浓度为100μg/mL的混合储备液，4℃保存备用。
步骤二、样品处理：
准确称取粉碎后的冻干新鲜烟叶样品0.2g于15mL离心管中，加入5mL超纯水超声提取30min，过滤。准确移取0.5mL滤液于5mL离心管中，分别加入14％三乙胺-乙腈溶液和1.2％异硫氰酸苯酯-乙腈溶液各0.5mL，混匀，室温静置30min后，加入1mL正己烷，旋涡振荡60s后，8000r/min高速离心5min，取上层清液用超纯水稀释5倍，经0.45μm有机滤膜过滤后上机分析。
步骤三、高效液相色谱分析：
分析条件如下：色谱柱：Waters SunFire C18(4.6×150mm，5μm)；流动相：A为0.1mol/L乙酸钠水溶液(pH 6.50)，B为80％(V/V)乙腈；洗脱程序：0～5min，100％A；5～13.5min，100％～94％A；13.5～18min，94％～84％A；18～25min，84％～72％A；25～28min，72％～0A；28～32min，0A；32～33min，0～100％；33-40min，100％。流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。
18种氨基酸的色谱图如图1所示，其中：1-天冬氨酸、2-谷氨酸、3-丝氨酸、4-甘氨酸、5-组氨酸、6-精氨酸、7-苏氨酸、8-丙氨酸、9-脯氨酸、10-酪氨酸、11-缬氨酸、12-甲硫氨酸、13-胱氨酸、14-异亮氨酸、15-亮氨酸、16-苯丙氨酸、17-色氨酸、18-赖氨酸
步骤四、计算：
以外标法进行定量分析，即以各氨基酸浓度对相应峰面积进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.99；对提取后的样品待测液进行测定，测得个氨基酸色谱峰面积，代入标准曲线求得样品中的各氨基酸的含量。
本实施例中，18种氨基酸标准溶液在上述的色谱条件下进样分析，每个浓度3次进样、平均校正，得到18种氨基酸的线性范围介于2～50μg/mL，线性关系良好，决定系数均大于0.99。根据最小检测浓度的3倍相对标准偏差为仪器检出限、10倍相对标准偏差为仪器定量限，结合前处理的样品质量、提取体积和稀释倍数等计算，本方法对18种氨基酸的定量限为0.03～0.10mg/g，能满足18种氨基酸的含量分析要求。
配制系列浓度的在3个水平上进行添加回收实验，每个水平6次重复。其中天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸按0.05、0.10、0.20mg/g的3个水平添加；其余氨基酸按0.10、0.20、0.40mg/g 3个水平添加。在3个加标水平上，18种氨基酸的平均回收率介于84.6％～105％，相对标准偏差(RSD)在1.7％～5.5％，说明本方法对18种氨基酸有较好的回收率和精密度。表1为方法的回收率、精密度与定量限。
表1方法的回收率、精密度与定量限
Figure BDA0002929805860000061
本实施例检测了50份新鲜烟叶样品中氨基酸的含量，结果如下：甘氨酸含量范围在8.64～363.75μg/g，平均含量105.49μg/g；脯氨酸含量范围在9.51～211.59μg/g，平均含量101.32μg/g；丙氨酸含量范围在6.45～211.43μg/g，平均含量83.43μg/g；苏氨酸含量范围在6.30～189.51μg/g，平均含量53.16μg/g；精氨酸含量范围在2.93～122.15μg/g，平均含量22.53μg/g；丝氨酸含量范围在3.80～58.32μg/g，平均含量14.04μg/g；亮氨酸含量范围在1.00～24.17μg/g，平均含量9.70μg/g；天冬氨酸含量范围在2.83～27.84μg/g，平均含量9.60μg/g；谷氨酸含量范围在1.44～21.06μg/g，平均含量6.80μg/g；苯丙氨酸含量范围在1.49～8.68μg/g，平均含量4.64μg/g；缬氨酸含量范围在1.06～9.43μg/g，平均含量4.28μg/g；酪氨酸含量范围在0.67～13.40μg/g，平均含量4.25μg/g；甲硫氨酸含量范围在0.86～6.26μg/g，平均含量3.83μg/g；色氨酸含量范围在1.25～7.45μg/g，平均含量3.05μg/g；胱氨酸含量范围在1.26～5.55μg/g，平均含量2.98μg/g；异亮氨酸含量范围在0.50～5.53μg/g，平均含量2.47μg/g；赖氨酸含量范围在0.52～6.31μg/g，平均含量2.33μg/g；组氨酸含量范围在0.10～2.12μg/g，平均含量1.01μg/g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
①配制18种氨基酸的标准溶液；
②样品处理：称取一定量冻干的新鲜烟叶粉末加入水中超声提取、过滤，得到的滤液进一步处理后用于分析；
③高效液相色谱分析：分析条件为：色谱柱：Waters SunFire C18，规格：4.6×150mm，5μm；流动相：A为0.1mol/L乙酸钠水溶液、pH 6.50，B为80％(V/V)乙腈；洗脱程序：0-5min，100％A；5-13.5min，100％-94％A；13.5-18min，94％-84％A；18-25min，84％-72％A；25-28min，72％-0A；28-32min，0A；32-33min，0-100％；33-40min，100％。流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：254nm；
④计算：采用外标法进行定量分析，即以步骤①的18种氨基酸不同浓度对应峰面积进行回归分析，得到标准曲线，使得相关系数不小于0.99；对步骤②进一步处理后的滤液进行测定，测得各氨基酸的峰面积，代入标准曲线求得样品中的各氨基酸的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①中18种氨基酸分别为丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，18种氨基酸的标准溶液的配制步骤为：分别称取18种氨基酸标准物质0.025g至25mL容量瓶中，精确至0.0001g，用0.01mol/L的HCl定容，配制成浓度为1000μg/mL的单一标准储备液；然后移取每种单一标准储备液各1mL至10mL容量瓶中，用0.01mol/L的HCl定容，得到每种氨基酸浓度为100μg/mL的混合储备液，4℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤②中样品处理的步骤为：准确称取粉碎后的冻干烟叶粉末0.2g于15mL离心管中，加入5mL水超声提取30min后过滤得到滤液；准确移取0.5mL得到的滤液于5mL离心管中，分别加入14％三乙胺-乙腈溶液和1.2％异硫氰酸苯酯-乙腈溶液各0.5mL，混匀，室温静置30min后，加入1mL正己烷，旋涡振荡60s后，8000r/min高速离心5min，取上层清液用水稀释5倍，经0.45μm有机滤膜过滤后上机分析。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤④的18种标准氨基酸的定量限为0.03～0.10mg/g；每个浓度3次进样、平均校正，得到18种氨基酸的线性范围介于2～50μg/mL，相关系数不小于0.99。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤④的样品其中的天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸按0.05、0.10、0.20mg/g的3个水平添加；其中的精氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸按0.10、0.20、0.40mg/g的3个水平添加；每个水平重复6次。
CN202110145273.5A 2021-02-02 2021-02-02 一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法 Pending CN112730695A (zh)

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