CN101275935A

CN101275935A - 烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法

Info

Publication number: CN101275935A
Application number: CNA2008100276938A
Authority: CN
Inventors: 黄翼飞
Original assignee: China Tobacco Guangdong Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Guangdong Industrial Co Ltd
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2008-10-01
Anticipated expiration: 2028-04-25
Also published as: CN101275935B

Abstract

本发明公开了一种烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法，包括制备待测样品提取液；在HyPURITY C₁₈反相色谱柱上以A相99％水－1％乙腈－0.1％九氟戊酸和B相10％水－90％乙腈－0.1％九氟戊酸作为流动相梯度洗脱分离。针对现有液相色谱分析烟草及其制品中所含氨基酸含量的方法的不足，精确的限定了液相色谱分析的条件，提供了一个整体的完整的实验方案，获得良好的色谱峰形以及适宜的色谱运行时间，并且可使氨基酸同分异构体达到基线分离。本发明提供的色谱分离方法结合质谱检测能获得准确的烟草及其制品氨基酸含量的分析结果。

Description

烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法。

背景技术

氨基酸是烟叶中的重要组成部分，与烟气质量和卷烟品牌特征密切相关；氨基酸参与烟叶中的非酶棕色反应，即美拉德反应，此反应可产生多种重要的致香成分。因此，研究烟草中的氨基酸，对于配方研制、工艺生产和品质控制都有十分重要的意义。

由于烟草中的氨基酸种类较多，且具有酸性、中性和碱性三种不同的化学性质，加上烟草基质复杂，因此对烟草中多种氨基酸的同时测定具有一定难度。目前，液相色谱(LC)法是较多使用的氨基酸测定方法之一。由于氨基酸不具有紫外和荧光检测所需的发色基团，若用液相色谱法进行检测，则必须对氨基酸进行柱前或柱后衍生。衍生化操作步骤繁琐，耗时耗力，而且衍生化合物的稳定性难以直观的评判，某些氨基酸衍生反应的完全程度也难以保证，同时衍生反应还可能生成非目标衍生物，这些都会影响氨基酸的准确测定。自动氨基酸分析仪也存同样的衍生问题。烟草成分相当复杂，用LC、自动氨基酸分析仪、离子色谱(IC)和毛细管电泳(CE)等方法进行氨基酸分析往往需要对样品进行固相萃取等繁杂的前处理，以减少干扰。固相萃取等前处理会在一定程度上造成某些氨基酸(或氨基酸衍生物)的损失，而且有些干扰杂质也难以通过前处理消除。LC和IC等色谱方法主要通过保留时间来识别化合物，因此必须花费较多时间摸索色谱分离条件以及准确判定待测物，而且色谱方法都难以解决化合物共流出的问题，致使某些待测化合物和干扰物不能区分。

近年来，随着电喷雾离子化(ESI)和串联质谱(MS/MS)技术的发展，液相色谱和电喷雾串联质谱联用(LC-ESI-MS/MS)在复杂化合物分析中得到广泛的应用。但目前尚未见液相色谱和电喷雾串联质谱联用技术在烟草样品氨基酸分析中应用的相关报道。

液相色谱和电喷雾串联质谱联用，进行液相色谱分离操作时，条件的设置例如温度、流动相等条件的选择对分离的效果有着显著的影响。

目前未见关于上述色谱分离方法的完整技术方案的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确、简便的烟草及其制品中所含氨基酸的色谱分离方法。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供一种烟草及其制品中所含氨基酸的色谱分离方法，包括以下步骤：

(1)制备待测样品提取液；

(2)在HyPURITY C₁₈反相色谱柱上以99％水-1％乙腈-0.1％九氟戊酸(流动相A)和10％水-90％乙腈-0.1％九氟戊酸(流动相B)作为流动相梯度洗脱分离。

所述洗脱分离条件为：热电HyPURITY C₁₈色谱柱200mm×2.1mm，5μm；Eclipse XDB-C₈保护柱12.5×2.1mm，5μm；流速：200μL/min；柱温箱：25℃；样品盘温度：15℃；流动相A：99％水-1％乙腈-0.1％九氟戊酸，流动相B：10％水-90％乙腈-0.1％九氟戊酸。

所述二元流动相中流动相B所占的体积百分比小于25％。

为了保证良好的保留时间重现性，更方便的进行定性定量分析，在进样100针后，用100％乙腈冲洗色谱柱30min，洗脱过多积聚的NFPA，再用流动相平衡色谱柱后进样。

本发明的有益效果是：针对现有液相色谱分析烟草及其制品中所含氨基酸含量的方法的不足，精确的限定了液相色谱分析的条件，提供了一个整体的完整的实验方案，获得良好的色谱峰形以及适宜的色谱运行时间，并且可使同分异构体亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)和正缬氨酸(Nva)达到基线分离。本发明提供的色谱分离方法结合质谱检测能获得准确的烟草及其制品氨基酸含量的分析结果。

附图说明

图1 20种氨基酸和内标正缬氨酸的提取离子流图

图2加标前Ile和Leu提取离子流图

图3加标后Ile和Leu提取离子流图

图4加标前Val和Nva提取离子流图

图5加标后Val和Nva提取离子流图

图6氨基酸的二级质谱图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1

1、仪器、材料与试剂

美国热电公司LC-MS LTQ液相色谱-离子阱质谱仪，配备自动进样器、四元梯度质谱泵，LTQ离子阱质谱带电喷雾电离源(ESI)，Xcalibur 1.4SR1系统控制软件；意大利Claind N2LCMS氮气发生器；法国Millipore Element A10纯水机；美国Cole-Parmer 8892超声清洗器；Sartorious CP225D电子天平(Max 220g，d＝0.01mg(80g)，0.1mg(220g))；Whatman 0.2μm尼龙针式滤头；烟草粉末。混合氨基酸标准溶液(Fluka公司)，含17种氨基酸，浓度各为1mM；内标物L-正缬氨酸(上海丽珠东风生物技术有限公司)；天冬酰胺·水(上海伯奥生物科技有限公司)；色氨酸，脯氨酸和谷氨酰胺(国药集团化学试剂有限公司)；γ-氨基丁酸(Sigma公司)；L-哌啶-2-羧酸、九氟戊酸(NFPA)(Aldrich公司)；甲醇和乙腈(MERCK公司)；优级纯浓盐酸；Milli-Q级水，由Milliore Element A10制备，若不经特别说明，实验中用水均为Milli-Q级水。

2、实验方法

2.1样品处理

称取0.1～0.2g烟末置于锥形瓶中，加入20mL含正缬氨酸浓度为1.7μM的0.03MHCl溶液，超声震荡15min，摇荡锥形瓶片刻使溶液浓度分配均匀，经0.2μm滤膜过滤后直接进样。

2.2色谱条件热电HyPURITY C₁₈色谱柱(200mm×2.1mm，5μm)，安捷伦Reliance保护柱套和Eclipse XDB-C8保护柱(12.5×2.1mm，5μm)。进样方式：全环(5μL)；流速：200μL/min；柱温箱：25℃；样品盘温度：15℃；注射器冲洗体积(flush volume)：1000μL；洗针体积(wash volume)：800μL。流动相A：99％水-1％乙腈-0.1％NFPA；流动相B：10％水-90％乙腈-0.1％NFPA。流动相梯度见表1。

表1 流动相梯度

2.2质谱条件氮气压力：0.64MPa；氦气压力：0.38MPa；极性：正电离；扫描形式：全扫描；采集时间：40min；激活时间：30ms；吹扫气：0LTQ单位；喷雾电压：5kV；毛细管温度：350℃；扫描范围：标准；扫描速率：标准；分段、分段时间、分离宽度、归一化碰撞能量等设置见表2，其中第3分段的鞘气和辅助气分别为38LTQ单位和OLTQ单位，其余分段的鞘气和辅助气分别为46LTQ单位和19LTQ单位。其他参数由自动调谐确定或依照LTQ质谱的默认设置。

表2 分段、分段时间、分离宽度、归一化碰撞能量等条件设置

2.3标准曲线制作采用内标法定量。配制含内标正缬氨酸浓度为1.7μM的氨基酸混和标准溶液I(天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)、胱氨酸(Cys)、γ-氨基丁酸(Gaba)、哌啶酸(Pip)、缬氨酸(Val)、甲硫氨基酸(Met)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Try)的浓度均为50μM的0.03M HCl溶液)；配制含内标正缬氨酸浓度为1.7μM的氨基酸混和标准溶液II(脯氨酸(Pro)和天冬酰胺(Asn)的浓度分别为500μM的0.03M HCl溶液)。用含正缬氨酸浓度为1.7μM的0.03M HCl把标准溶液I和标准溶液II配成系列浓度，制作标准曲线。

3、实验结果

3.1色谱条件的确定

3.1.1氨基酸对温度的要求

温度较高时，氨基酸混标容易发生反应，使某些氨基酸含量降低。因此，所有氨基酸标准溶液在不使用时应及时保存在2℃以下，并且在分析样品时把样品盘设定在较低的温度15℃。为了避免柱温较高时氨基酸可能在柱内产生变化，把柱温箱设定在25℃。适当降低柱温的另一个好处是可以明显增加同分异构体亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)在色谱柱上的分离度(图1)。但柱温不宜设定过低，以免柱压过大，同时亦使Phe和Try出峰延迟，增加分析时间。

3.1.2色谱柱和流动相

本发明在C₁₈分析柱上试验过多种流动相，结果表明ThermoHyPURITY C₁₈配合99％水-1％乙腈-0.1％NFPA以及10％水-90％乙腈-0.1％NFPA作流动相可以获得良好的色谱峰形以及适宜的色谱运行时间，并且可使同分异构体Leu和Ile达到基线分离，见附图1。NFPA用作流动相改性剂。此外，NFPA还有利于增强电喷雾质谱对氨基酸的正电离检测信号。

乙腈容易洗脱NFPA，过多的NFPA容易增加背景干扰，影响检测灵敏度，因此，流动相B的使用比例不易过高，实验把流动相B的比例控制在25％以下，可达到良好分离检测的效果。需注意的是，NFPA会在色谱柱内不断积聚并慢慢改变固定相的性质，使氨基酸的出峰时间改变。为了保证良好的保留时间重现性，更方便的进行定性定量分析，在进样100针后，用100％乙腈冲洗色谱柱30min，洗脱过多积聚的NFPA，再用流动相平衡色谱柱后进样。

3.1.3内标物的选择

正缬氨酸不存于烟草氨基酸中，在本实验条件下稳定且能和其同分异构体缬氨酸在色谱上完全分离，且价格较低，是比较理想的内标物。

3.1.4氨基酸同分异构体的鉴别

亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)和正缬氨酸(Nva)互为同分异构体，二级质谱相似，无法单用质谱加以鉴定，因此需结合色谱分离进行区分。实验通过加标法，分别加入一定量的Ile和Val，对出峰顺序进行判断，Ile和Val的加入量按照实验室常规。加入Ile或Val标准后，前面流出的色谱峰高明显增高，峰面积明显增大，可以判定Ile和Val分别较Leu和Nva先流出，见附图2～附图5提取离子流图。

3.2质谱条件的确定

本发明在优化液相色谱条件的同时，结合质谱检测获得氨基酸的准确和高灵敏度分析结果，并对质谱分析条件进行恰当设置。实验对比了二级全扫描(Full MS2)和选择离子监测(SIM)两种扫描模式。二级全扫描能有效地降低背景干扰，获得更高的灵敏度，且选择性优于SIM，检测效果较佳，因此实验选择二级全扫描进行定量分析。在21种氨基酸的二级质谱中，见附图6，除Arg和Cys外，其余氨基酸主要的离子碎片均为脱羧基、脱羟基或脱氨基峰，即[M-HCOOH+H]⁺、[M-H₂O+H]⁺或[M-N₂H+H]⁺。定量离子的准确选择关系到质谱定量的特征选择性。定量离子优先选取相对丰度较大的特征子离子，以获得较好的灵敏度。对于Glu，因子离子m/z 130的特征性不强，有干扰峰重叠，因此选择相对丰度次强的脱羧基峰m/z 102。

不同的分段(Segment)可调用独立的调谐文件，有利于提高检测的灵敏度。实验根据色谱峰的保留时间间隔，划为4个分段。适当的扫描范围有利于降低背景噪音及杂质干扰，提高检测的灵敏度和准确度，实验对各氨基酸的扫描范围进行了优化设置，见表2所示。

3.3样品前处理条件的确定

3.3.1不同提取溶液对色谱峰形的影响

实验用不同浓度的酸性溶液对烟草中的氨基酸进行提取，包括甲酸、乙酸和盐酸溶液。实验发现，1mM乙酸提取溶液使Val、Nva、His、Ile和Leu等氨基酸的色谱峰分叉开裂，且随着浓度的提高，色谱峰分叉开裂的现象越为明显。甲酸提取溶液也有类似的现象。而HCl提取溶液则能在C₁₈柱上获得较好的峰形。

3.3.2不同提取溶液的提取效果

实验对比了几种较常用的提取溶液的提取效果，即70％甲醇溶液、80％乙醇溶液和0.1M HCl。称取等量的烟草样品，通过对比氨基酸色谱峰面积，来比较三种溶液的提取效果。由表3可见，80％乙醇提取的氨基酸含量最低，70％甲醇提取的Val、His、Tyr、Lys、Phe和Try等多种氨基酸含量均明显低于用0.1M HCl提取的。综合比较，0.1M的盐酸溶液的提取效果较好。

表3 不同提取溶液的提取效果对比

3.3.3不同浓度的HCl溶液的提取效果

称取等量烟末样品，对比不同浓度HCl提取溶液的提取效果(表4)。0.1M HCl对Ser、Glu、Lys和Arg的提取效果较差，0.05MHCl的对Lys和Arg的提取效果均不好。0.03M HCl对Lys的提取效果明显增加。综合比较，选用0.03MHCl作为提取溶液。

表4 不同浓度的HCl溶液的提取效果对比

3.3.4萃取时间

称取0.1g烟末，加入20mL萃取溶液，在超声震荡下分别萃取15min、30min、45min和60min，过0.2μm滤膜后进LC-MS分析。每个样品进两针，峰面积取平均值。实验发现，15min的提取时间已经能达到提取效果。由于称样量较少，萃取溶剂量大大超过称样量，而氨基酸能较快的溶解于盐酸溶液，因此能较快的达到溶解平衡。

3.4方法验证

20种待测氨基酸的在烟草中的含量相差悬殊，有的低于检测限，如Cys，有的则含量高达0.2％以上，如Pro。为了同时测定20种氨基酸，实验建立了两种不同浓度系列的标准曲线，即对含量较高的Pro和Asn建立一种浓度系列的标准曲线，对其他氨基酸建立另一种浓度系列的标准曲线。这样，一个样品一次进样便可得出所有氨基酸的测试数据，达到节约时间，提高效率的目的。

方法的检出限(S/N)通过实际测定系列低浓度的氨基酸标准样品，以S/N＝3来确定。方法检出限良好，在0.01～0.05μM(S/N＝3)之间，相关系数(r²)均大于0.9977，精密度在0.78～4.93RSD％之间。实验通过标准加入法确定方法的回收率。准确称取烟末204.09mg，用20mL萃取液提取，平行测定5次，取平均值作为回收率计算的依据。然后称取烟末三份，分别为191.60mg、209.80mg和159.33mg，根据2.1的样品处理方法，分别加标，使加标浓度分别为1μM、10μM和20μM。其中，对含量低于1μM的氨基酸，只进行1μM加标回收实验，对含量低于1.5μM的氨基酸，进行1μM和10μM加标实验，对于含量较高的Asn和Pro，进行10μM和20μM加标实验。氨基酸回收率基本在81～108％之间，Ile和Arg的回收率较低，分别为75％和53％。20种氨基酸的检出限、定量限、线性范围、相关系数、精密度和回收率见表5。

表5 20种氨基酸的检出限(LOD)、线性范围、相关系数(r²)、精密度

Claims

1、一种烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备待测样品提取液；

(2)在HyPURITY C₁₈反相色谱柱上以A相99％水-1％乙腈-0.1％九氟戊酸和B相10％水-90％乙腈-0.1％九氟戊酸作为流动相梯度洗脱分离。

2、根据权利要求1所述烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法，其特征在于所述洗脱分离条件为：热电HyPURITY C₁₈色谱柱200mm×2.1mm，5μm；Eclipse XDB-C₈保护柱12.5×2.1mm，5μm；流速：200μL/min；柱温箱：25℃；样品盘温度：15℃；流动相A：99％水-1％乙腈-0.1％九氟戊酸，流动相B：10％水-90％乙腈-0.1％九氟戊酸。

3、根据权利要求2或3所述烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法，其特征在于所述二元流动相中流动相B所占的体积百分比小于25％。

4、根据权利要求1所述烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法，其特征在于步骤(2)所述色谱分离流动相的梯度是：

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)

0.0 100 0；

8.0 100 0；

81 90 10；

25.0 90 10；

25.1 75 25；

32.0 80 20；

32.5 100 0；

40 100 0。

5、根据权利要求4所述烟草及其制品中所含氨基酸的液相色谱分离方法，其特征在于所述色谱洗脱是在进样100针后，用100％乙腈冲洗色谱柱30min，再用流动相平衡色谱柱。