CN110836945A - 一种烟碱中次级生物碱含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种烟碱中次级生物碱含量的测定方法，采用液相色谱‑多级质谱联用的方法对所述高纯度烟碱中低含量的次级生物碱含量进行准确测定，其中次级生物碱包括麦斯明、可的宁、2S‑尼古丁‑1‑氧化物、R,S‑降烟碱、R,S‑新烟草碱、S‑假木贼碱及二烯烟碱中的一种或几种。本发明提供的测定方法，适用于高浓度甚至是高纯度烟碱中次级生物碱含量的测定，通过液相色谱对高浓度烟碱以及含量低的次级生物碱进行分离，再通过质谱对生物碱进行定性和定量的分析，检测结果准确有效。

Description

一种烟碱中次级生物碱含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种生物碱的测定方法，特别涉及一种烟碱中次级生物碱含量的测定方法。

背景技术

烟草制品呈现多元化发展态势，特别以电子烟为代表的新型烟草制品在世界范围内的市场规模不断扩大，具有广阔的应用前景。

烟碱是烟草和烟气中含量最丰富的生物碱，可作用于中枢神经系统，是烟草最重要的生理性活性成分，也是人们消费烟草以达到生理和心理满足感的最重要的原因。因此，为达到与真实卷烟相近的生理感受，电子烟中往往含有不同浓度的烟碱(即尼古丁)。烟碱纯度会在不同程度上影响电子烟的感官感受，采用不同的原料、不同的提取方式会使不同杂质残留在高纯度的烟碱中，如低含量的吡啶类、吡嗪类、中性香味物质，从而使电子烟的感官发生变化。

烟碱纯度的不同可直接影响电子烟的感官感受。烟碱在存放过程中会发生降解，可能会转化成次级生物碱，如降烟碱等，降烟碱的含量对烟草品质具有负面影响。

现有技术中较多地关注于对于固态烟草中次级生物碱的定性和定量的测定，对于液态烟碱中次级生物碱含量的测定较少。检测手段也是大多采用经典的液相色谱分离，并结合紫外检测技术进行定性分析，然而这样的检测技术也不准确。

为了保障产品的可靠性和稳定性，必须建立起对烟碱中次级生物碱的品控方法，这对于电子烟烟碱原料的选择、吸味品质的控制及产品稳定性都具有重要的理论意义和实用价值。

发明内容

本发明提出一种烟碱中次级生物碱含量的测定方法，用以解决上述问题。

本发明提供一种烟碱中次级生物碱含量的测定方法，采用液相色谱-多级质谱联用的方法对所述高纯度烟碱中低含量的次级生物碱含量进行准确测定，其中次级生物碱包括麦斯明、可的宁、2S-尼古丁-1-氧化物、R,S-降烟碱、R,S-新烟草碱、S-假木贼碱及二烯烟碱中的一种或几种。

进一步地，液相色谱的分析条件为：

选用C18反相色谱柱；流动相A为乙酸铵溶液，其pH为8～10.5；流动相B为x和y两种有机物混合的有机溶剂，其中x为甲酸或乙酸，y为甲醇或乙腈，x在有机溶剂中的体积比为0.025％～0.5％；采用梯度洗脱，该梯度洗脱的条件为：0～3分钟流动相A体积比保持在100％；3～23分钟流动相A体积比由100％下降至30％～40％；23～25分钟流动相A体积比由30％～40％下降至4％～6％；25～35分钟流动相A体积比保持在4％～6％；35～35.1分钟流动相A体积比由4％～6％上升至90％～100％；35.1～40分钟流动相A体积比保持在90％～100％。

C18反相色谱柱适用于烟碱液体中次级生物碱的分离。将流动相A设为乙酸铵溶液，将其pH设定为8～10.5，有利于杂质(即次级生物碱)呈现分子态。进一步地乙酸铵溶液的pH设定为10。另外，乙酸铵溶液的浓度可根据仪器或实际分析条件等因素进行选择，本发明可将乙酸铵溶液浓度设为10-30mmol/L。

本发明将流动相B设为由两种有机物x和y混合的有机溶剂。其中x为甲酸或乙酸，y为甲醇或乙腈。与单一成分的流动相B相比，在甲醇或乙腈溶剂中加入适量的甲酸或乙酸，在流动相B通过色谱柱时，可让待分离的次级生物碱解离成离子，有助于次级生物碱的分离，在质谱分析时峰形更好。对于混合有机溶剂含量的选择，本发明中x在混合溶剂中的体积百分比在0.025％～0.5％的范围内较为合适，进一步地可为0.1％。

洗脱条件对于各种次级生物碱以及烟碱的分离也起到重要的作用，洗脱前期主要是次级生物碱在色谱柱中的保留，后期在于对次级生物碱的洗脱。流动相A和流动相B在不同时间段的百分比的选择、流动相B含量的增加、减少以及含量变化的速度都会对次级生物碱以及烟碱的分离产生重要影响。

上述对于梯度洗脱条件，进一步为：0～3分钟流动相A体积比保持在100％；3～23分钟流动相A体积比由100％下降至37％；23～25分钟流动相A体积比由37％下降至5％；25～35分钟流动相A体积比保持在5％；35～35.1分钟流动相A体积比由5％上升至100％；35.1～40分钟流动相A体积比保持在100％。

进一步地，C18反相色谱柱的粒径为1.7～5μm，例如1.7μm，3μm，5μm，优选为1.7μm，粒径尺寸影响色谱柱的分离效率，对于次级生物碱的分离度有影响。

进一步地，C18反相色谱柱内径为2.1mm或4.6mm，优选为2.1mm；色谱柱的长度为50mm、100mm、150mm中的一种，优选为100mm。

进一步地，液相色谱的分析条件为以下(1)～(3)中的一种或几种：

(1)流速0.2～0.5mL/min；

(2)柱温：30～50℃；

(3)进样量：1μL～10μL。

进样量的增加可提高检测灵敏度，进样量过高会使峰宽变宽。

进一步地，利用所述多级质谱对待测样品进行测定的方法包括：

定量离子对选择：当待测样品中所述次级生物碱的第一离子对的峰至少部分地被待测样品中所述烟碱的离子对的峰覆盖或者干扰时，即无法准确获得关于第一离子对的峰的定量数据信息时，选择所述次级生物碱的第二离子对的峰。当所述第二离子对的峰不被所述烟碱的离子对的峰覆盖或者干扰时，或者说干扰较小时，即能够较为准确地获得关于第二离子对的峰的定量数据信息时，将所述第二离子对的峰对应的离子对作为所述次级生物碱的定量离子对。本发明关于定量离子对的选择方法能够进一步减少尼古丁的干扰，提高检测的灵敏度。

定量分析：通过所述次级生物碱的定量离子对对所述次级生物碱的含量进行分析。

进一步地，定量离子对的选择满足下述(1)～(7)中的一种或几种：

(1)可的宁m/z：177.1/98.2；(2)2S-尼古丁-1-氧化物m/z：179.1/96.1；(3)R,S-降烟碱m/z：149.1/132.1；(4)R,S-新烟草碱m/z：161.1/144.1；(5)麦斯明m/z：147.1/105.2；(6)S-假木贼碱m/z：163.1/146.2；(7)二烯烟碱m/z：159.1/144.1。

进一步地，对所述次级生物碱进行所述定量分析时选用的碰撞电压满足下述(1)～(7)条件中的一种或几种：

(1)可的宁：28V；(2)2S-尼古丁-1-氧化物：20V；(3)R,S-降烟碱：12V；(4)R,S-新烟草碱：12V；(5)麦斯明：32V；(6)S-假木贼碱：15V；(7)二烯烟碱：28V。

进一步地，利用多级质谱对所述待测样品进行测定的步骤还包括定性分析，所述定性分析包括定性离子对的选择，所述定性离子对的选择满足下述(1)～(7)中的一种或几种：

(1)可的宁m/z：177.1/80.2；(2)2S-尼古丁-1-氧化物m/z：179.1/84.2；(3)R,S-降烟碱m/z：149.1/80.1；(4)R,S-新烟草碱m/z：161.1/106.1；(5)麦斯明m/z：147.1/78.1；(6)S-假木贼碱m/z：163.1/118.3；(7)二烯烟碱m/z：159.1/117.1。

进一步地，对所述次级生物碱进行所述定性分析时选用的碰撞电压满足下述(1)～(7)条件中的一种或几种：

(1)可的宁：36V；(2)2S-尼古丁-1-氧化物：20V；(3)R,S-降烟碱：32V；(4)R,S-新烟草碱：12V；(5)麦斯明：40V；(6)S-假木贼碱：15V；(7)二烯烟碱：40V。

进一步地，所述多级质谱的分析条件为：

扫描方式：正离子扫描；离子源：AJS-ESI；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度：100～300℃，例如200℃；干燥气流速：8～12L/min，例如为11L/min；雾化气压力：40～65psi，例如为60psi；鞘气温度：150～250℃，例如为200℃；鞘气流速：8～12L/min，例如为10L/min；毛细管电压：正0～3000V，例如正2000V；喷嘴电压：正500～3000V，例如为1000V。

质谱条件的选择也有利于提高检测的灵敏度。

进一步地，上述测定方法还包括将烟碱样品用水稀释并定容制成待测样品。采用稀释的方式可以进一步地降低高浓度烟碱的干扰。

进一步地，所述测定方法采用内标法对所述次级生物碱定量。

进一步地，内标物为氘代可的宁(可的宁-D₃)。

进一步地，还包括以下步骤：

标准溶液的配制：将需要测定的次级生物碱标准样品配置成不同梯度的标准溶液；

标准曲线的绘制：测定不同梯度的所述标准溶液和所述内标物的定量离子对的峰面积，将所述标准溶液的定量离子对的峰面积与所述内标物的定量离子对的峰面积之比与次级生物碱的浓度进行线性拟合，得到所述次级生物碱的一元线性回归方程；

次级生物碱含量的确定：将通过多级质谱测定的待测样品的数据代入所述一元线性回归方程中，计算得到所述待测样品中次级生物碱的含量。

进一步地，关于次级生物碱的标准溶液的线性浓度范围满足以下(1)～(7)中的一种或几种：

(1)麦斯明标准溶液浓度范围为：0.2μg/mL～20μg/mL；

(2)可的宁标准溶液浓度范围为：0.002μg/mL～2μg/mL；

(3)2S-尼古丁-1-氧化物标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL；

(4)R,S-降烟碱标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL；

(5)R,S-新烟草碱标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL；

(6)S-假木贼碱标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL；

(7)二烯烟碱标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL。

本发明提供的测定方法，适用于高浓度烟碱中低含量的次级生物碱的测定，通过液相色谱对高浓度烟碱以及含量低的次级生物碱进行分离，再通过质谱对生物碱进行定性和定量的分析，检测结果准确有效。

附图说明

下面将结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为实际样品中次级生物碱受到烟碱干扰的总离子流图；

图2为利用实施例1的方法获得的标样谱图；

图3为利用实施例1的方法获得的实际测定样品的谱图；

图4为利用实施例2的方法获得的实际测定样品的谱图；

图5为利用实施例3的方法获得的实际测定样品的谱图；

图6为利用对比例1的方法获得的实际测定样品的谱图；

图7为利用对比例2的方法获得的实际测定样品的谱图；

图8为利用对比例3的方法获得的实际测定样品的谱图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。虽然本发明的描述将结合较佳实施例一起介绍，但这并不代表此发明的特征仅限于该实施方式。恰恰相反，结合实施方式作发明介绍的目的是为了覆盖基于本发明的权利要求而有可能延伸出的其它选择或改造。为了提供对本发明的深度了解，以下描述中将包含许多具体的细节。本发明也可以不使用这些细节实施。此外，为了避免混乱或模糊本发明的重点，有些具体细节将在描述中被省略。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

现有技术中采用紫外检测技术对高浓度甚至高纯度烟碱中的次级生物碱进行定性定量分析，准确性较低。尤其对于在高浓度液体烟碱中测定次级生物碱的含量，目前鲜有采用液相色谱-质谱联用的方式进行测定。本发明提出一种测定方法，采用液相色谱-多级质谱联用的方法可对于高浓度烟碱中次级生物碱的含量进行测定，主要测定的次级生物碱例如有：麦斯明、可的宁、2S-尼古丁-1-氧化物、R,S-降烟碱、R,S-新烟草碱、S-假木贼碱及二烯烟碱中的一种或几种。可以知晓，本发明中所述的液相色谱，既包含传统的液相色谱，也包含高效液相色谱。即本发明既可以选用经典液相色谱-质谱联用仪(LC/MS-MS)，也可以采用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC/MS-MS)对烟碱中的次级生物碱的含量进行测定。先通过液相色谱对高浓度烟碱以及其中的次级生物碱进行分离，再利用多级质谱作定性和定量分析。相比于紫外检测技术，多级质谱检测结果更加精确。

上述提到的次级生物碱往往都是由烟碱转变而来，其性质相似，且烟碱溶液中主体烟碱的含量很高，因此需要通过设计液相色谱的分析条件完成对烟碱溶液中各物质的分离。例如本发明先准备待测样品，之后将待测样品打入LC/MS-MS或HPLC/MS-MS仪器中进行分离和测定。其中液相色谱的分析条件为：选用C18反向色谱柱，例如可选择型号为ACQUITYUPLC CSH C18或ACQUITY UPLC BEH C18等色谱柱，具体型号可根据检测的次级生物碱的种类、数量以及分析条件做选择；流动相A为10～30mmol/L的乙酸铵溶液，其pH为8～10.5，优选pH为10；流动相B为x+y两种有机物混合的有机溶剂，其中x为甲酸或乙酸，y为甲醇或乙腈，即流动相B可以为甲酸+甲醇、甲酸+乙腈、乙酸+甲醇、乙酸+乙腈。x占整个流动相B的体积分数为0.025％～0.5％，优选为0.1％。洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：0～3分钟流动相A体积比保持在100％，3～23分钟流动相A体积比由100％下降至30％～40％，优选下降至37％；23～25分钟流动相A体积比由30％～40％下降至4％～6％，优选下降至5％；25～35分钟流动相A体积比保持在4％～6％，优选保持在5％；35～35.1分钟流动相A体积比由4％～6％上升至90％～100％，优选上升至100％；35.1～40分钟流动相A体积比保持在90％～100％，优选为100％。关于C18色谱柱的型号、流动相A的pH值、流动相B的组成及比例、梯度洗脱条件都可以在本发明限定的范围内组合。

通过上述对于液相色谱的条件设定，实现了对烟碱和次级生物碱的良好分离，对于后期质谱的检测中次级生物碱产生的峰形情况、信噪水平以及检测的灵敏度都有明显的提高。

进一步地，选择C18色谱柱的粒径为1.7～5μm，进一步优选粒径为1.7μm。此外，C18反向色谱柱的内径设为2.1mm或4.6mm，优选为2.1mm；长度可以为50mm、100mm、150mm中的一种，优选为100mm。色谱柱粒径、内径和长度也可以在上述的范围内组合。对于粒径、内径的选择也能进一步提高检测的灵敏度。

此外，液相色谱的分析条件还可以设为满足以下的一种或几种：(1)流速0.2～0.5mL/min；(2)柱温：30～50℃；(3)进样量：1μL～10μL。

在质谱检测方面，由于烟碱本身浓度很高，通过色谱分离的手段降低烟碱对于次级生物碱的干扰，有时候形成的某些质谱峰中还会或多或少受到尼古丁产生的峰的影响。如图1所示，图1为实际样品的离子流图。图中最高的峰为尼古丁的峰，较小的峰为次级生物碱的峰。可以发现尽管尼古丁的峰与次级生物碱的峰的保留时间不同，但是由于尼古丁的浓度仍然较高，针对同一离子对进行检测，尼古丁产生的较强的峰会部分甚至全部覆盖次级生物碱产生的特征峰。还有一种情况就是尼古丁的峰很高，导致次级生物碱产生的峰检测不到或者无法准确获得产生的峰的定量数据信息，例如峰位置和峰面积。这样对于次级生物碱的定性和定量分析会产生影响。

因此，针对上述问题，本发明关于多级质谱对待测样品的检测提供了进一步的分析方法。对于次级生物碱的定量离子对的选择，先观察次级生物碱的第一离子对的峰的情况，第一离子对的峰会倾向于选择次级生物碱强度最高的离子对的峰，强度最高的峰的峰面积较大，对于定量检测其灵敏度较高。然而，当第一离子对的峰(次级生物碱强度最高的离子对的峰)至少部分地被待测样品中烟碱的离子对的峰覆盖或者干扰时，使得无法获得第一离子对的峰的数据信息时，需要放弃将第一离子对的峰对应的离子对作为该次级生物碱的定量离子对。可以选择次级生物碱的第二离子对的峰，观察第二离子对的峰，倘若其没有被烟碱的离子对的峰覆盖，或者未受到烟碱的离子对的峰的干扰或者说干扰很小时，即能够获得第二分离子对的峰的数据信息，例如峰位置和峰的面积，则可以将第二离子对的峰所对应的离子对作为所述次级生物碱的定量离子对。上述的干扰例如是尼古丁的出峰位置与某一个次级生物碱的出峰位置相同，或者说尽管尼古丁与次级生物碱的保留时间不同，但是由于尼古丁的峰较宽，部分覆盖或者全部覆盖了某一个次级生物碱的峰，或者由于尼古丁的峰太高，使得某一个次级生物碱的峰在图中几乎被忽略，使得无法准备获得该次级生物碱关于某一定量离子对下的相关数据。上述情况在与尼古丁的分子离子峰完全一致的次级生物碱中表现得尤为突出。上述第二离子对的峰可以是除第一离子对的峰以外其它强度较高的离子对的峰，例如是仅次于强度最高的离子对的峰。尽管可能选择的不是次级生物碱中最强的离子对的峰，但是通过选择不受尼古丁干扰的离子对进行定量分析，其结果会更加准确，灵敏度也更高。

例如，S-假木贼碱与纯烟碱的分子式与母离子完全一样，子离子也有多个重合，且样品为烟碱提取物，因此低含量的假木贼碱峰信号很容易受到烟碱的干扰。对于S-假木贼碱来说，尽管选用定量离子对163.1/90.0的情况下能够获得信号最强的峰，但是在这一离子对下尼古丁也会产生信号且强度较高，会对S-假木贼碱的定量分析产生影响。因此，可以选择163.1/146.2作为S-假木贼碱的定量离子对，在该情况下产生的信号受到尼古丁的峰的影响较小，对于定量分析较为合适。

此外，多级质谱的分析条件可以设为：扫描方式：正离子扫描；离子源：电喷雾离子源(AJS-ESI)；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度：100～300℃；干燥气流速：8～12L/min；雾化气压力：40～65psi；鞘气温度：150～250℃；鞘气流速：8～12L/min；毛细管电压：正0～3000V；喷嘴电压：正500～3000V；高压离子漏斗电压：正0～150V；低压离子漏斗电压：正0～150V；倍增器电压增幅：0～400V。

将上述液相色谱的分析条件结合上述关于质谱的分析方法，对于高纯度烟碱(99％级)中微量杂质(次级生物碱)含量的测定与分析效果更佳。

进一步地，针对烟碱浓度很高而杂质浓度很低的混合物来说，可以采用稀释的方式来降低高浓度烟碱的干扰。同时能够大幅提高检测方法的灵敏度和检测限，使低含量的次级生物碱能够被准确检测出来。

进一步地，本发明可采用外标法或内标法对次级生物碱的含量进行测定。外标法是测定次级生物碱定量离子对的峰面积，再通过计算获得该次级生物碱的含量。内标法是将一定质量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，根据测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比及相对校正因子，来计算被测组分的含量。关于内标法在本发明的应用来说，由于尼古丁的氘代内标极易受到含量差异巨大的尼古丁的影响，因此其无法作为次级生物碱的内标。本发明选择可的宁的氘代内标，即可的宁-D₃作为所测次级生物碱的内标。

进一步地，对于内标法来说，需要配制一系列标准溶液，将需要测定的次级生物碱标准样品配置成不同梯度的标准溶液，测定不同梯度的所述标准溶液和所述内标物的质谱峰面积，获得标准溶液和内标物的含量，进而获得校正曲线，以直线拟合，得到所述次级生物碱的一元线性回归方程。将通过高效液相色谱-质谱联用仪测定的所述待测样品的数据(峰面积等)代入所述一元线性回归方程中，计算得到所述待测样品中次级生物碱的含量。

本发明对于高浓度烟碱中的次级生物碱的测定效果较好，其中液相色谱实现了对高浓度烟碱和多种次级生物碱彼此之间的分离，多级质谱的使用和分析方法避开了烟碱的影响，通过定量离子对的选择与分析完成了对次级生物碱的定性和定量分析计算。将上述对于液相色谱分析方法的改进和多级质谱分析方法的改进进行结合，能够有效地实现对于高浓度烟碱中次级生物碱的分离和具体含量的测定。特别地，上述描述的测定方法对于高纯烟碱(质量分数为99％以上)中含量极低的次级生物碱含量的检测尤其适用，突破了现有技术中对于高浓度甚至高纯烟碱中次级生物碱含量测定的技术难点，在分析检测领域具有重要的应用意义。

下面将以具体实施例对本发明进行示例性介绍，但实施例中的具体数值和具体条件并不构成对本发明的限制。

实施例1

待测样品检测目标：待测样品为高浓度烟碱，针对该烟碱中的麦斯明、可的宁、2S-尼古丁-1-氧化物、R,S-降烟碱、R,S-新烟草碱、S-假木贼碱及二烯烟碱进行测定。

试剂：氘代可的宁，可的宁、2S-尼古丁-1-氧化物、R,S-降烟碱、R,S-新烟草碱、麦斯明、S-假木贼碱、二烯烟碱七种次级生物碱标准样品，乙酸，氨水，甲酸(LC-MS级)、甲醇(HPLC级)，高纯水。

设备：高效液相色谱(Agilent 1290)串联三重四级杆质谱(Agilent 6495)

1、标准工作溶液的配制

1)内标溶液

可的宁-D₃母液用甲醇稀释定容至1μg/mL备用。

2)工作溶液

标准物质的母液浓度以及各级标准工作溶液浓度如下表所示，根据不同工作溶液浓度的需求，移取不同体积的母液加入到9个10mL容量瓶中，依次加入100μL 1μg/mL的可的宁-D₃内标溶液，用水定容至刻度，得到1-9号标准工作溶液，如表1。

表1各次级生物碱的工作曲线浓度(ug/mL)

2、待测样品准备

准确移取10μL样品，记录称量质量，转移至10mL容量瓶中，加入100μL 1μg/mL的可的宁-D₃内标溶液，用水定容至刻度，用0.22μm的PTFE膜过滤，加入色谱瓶中待测。

如有个别样品因含量太高，需要在上述基础上进一步稀释测试。

此外标线范围的选择可以根据实际样品情况进行调整。

3、液相色谱条件

仪器：Agilent 1290高效液相色谱串联Agilent 6495三重四级杆质谱；

色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(粒径1.7μm，内径2.1mm×，长度为100mm)；

流速：0.3mL/min；

柱温：50℃；

进样量：2μL；

流动相：

A：1000mL水中加入1.429mL乙酸，用氨水调节pH至10；

B：甲酸-甲醇，其中甲酸体积分数为0.1％；

检测时间：40min

梯度洗脱条件如表2所示。

表2梯度洗脱条件

4、质谱条件

扫描方式：正离子扫描；

离子源：电喷雾离子源(AJS-ESI)；

检测方式：多反应监测(MRM)；

干燥气温度：200℃；

干燥气流速：11L/min；

雾化气压力：60psi；

鞘气温度：200℃；

鞘气流速：10L/min；

毛细管电压：正2000V；

喷嘴电压：正1000V；

高压离子漏斗电压：正150V；

低压离子漏斗电压：正60V；

倍增器电压增幅：200V。

待测物及内标的定量离子对、定性离子对·等质谱参数见表3。

表3各次级生物碱及内标质谱参数表

根据上述标准曲线绘制方法，获得的回归方程以及相关参数如下表4所示：

表4回归方程及相关信息参数表

其中x代表次级生物碱与内标物的浓度比，y代表次级生物碱和内标的定量离子对的峰面积比。

经检测，采用实施例1的方法所获得的加标回收率如下表5所示：

表5加标回收率表

此外，还利用实施例1中的方法对15种实际样品进行检测，其测试结果如下表6所示：

表6实际样品测试结果(单位mg/Kg)

表中“检出”指的是：大于检出限但低于定量限。图2为利用实施例1的方法获得的标样谱图，可以发现标样谱图的峰形完整、清晰。图3为利用实施例1的方法实际测定样品的谱图，可以发现所要测定的次级生物碱都能与样品中的干扰杂质有效分离，例如，对于与尼古丁(烟碱)拥有相同定量和定性离子对的S-假木贼碱，该方法不仅能够将其与尼古丁有效分离，而且依然使其保持优良的信号强度，使其能够被精确定量。

本实施例特别是针对于高纯度烟碱中多种次级生物碱的检测效果显著，其烟碱与各种次级生物碱之间得到有效分离，且质谱图中检测峰峰形好，互不干扰，定量检测更精确。

实施例2

实施例2中分析条件和参数的选择基本上与实施例1相同，不同之处在于色谱柱的为ACQUITY UPLC BEH C18(粒径1.7μm，内径2.1mm，长度100mm)。

实施例3

实施例3中分析条件和参数的选择基本上与实施例1相同，不同之处在于流动相B为甲酸体积分数为0.025％的甲酸-乙腈溶液。

实施例4

实施例4中分析条件和参数的选择基本上与实施例1相同，不同之处在于流动相A的pH为8；流动相B为乙酸-甲醇，其中乙酸体积分数为0.025％；流动相梯度洗脱条件如表7所示：

表7梯度洗脱条件

实施例5

实施例5中分析条件和参数的选择基本上与实施例1相同，不同之处在于流动相A的pH为10；流动相B为乙酸-乙醇，其中乙酸体积分数为0.5％；流动相梯度洗脱条件如表8所示：

表8梯度洗脱条件

对比例1

对比例1中分析条件和参数的选择基本上与实施例1相同，不同之处在于色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC(粒径1.7μm，内径2.1mm，长度100mm)。

对比例2

对比例2中分析条件和参数的选择基本上与实施例1相同，不同之处在于流动相B为乙腈。

对比例3

对比例3中各种条件和参数的选择基本上与实施例1相同，不同之处在于，流动相梯度洗脱条件如表9所示：

表9梯度洗脱条件

图4为利用实施例2的方法检测的次级生物碱的谱图。可以发现，当采用BEH C18色谱柱时，各次级生物碱的保留时间得到有效区分，尤其是S-假木贼碱与尼古丁能够有效分离，因此可以实现对多种次级生物碱的高灵敏检测。实施例1与实施例2相比，R,S-降烟碱的峰形更好。

图6为利用对比例1的方法检测的次级生物碱的谱图。与实施例1和实施例2相比，利用对比例1的方法产生的图谱中S-假木贼碱的峰与尼古丁重合，使得对于S-假木贼碱的检测受到较大干扰，二烯烟碱的峰形也不好。

图7为利用对比例2的方法检测的次级生物碱的谱图。可以发现，相比于实施例1，S-假木贼碱与尼古丁无法有效分离，R,S-降烟碱的峰形较差。

图5为利用实施例3的方法检测的次级生物碱的谱图。与对比例2相比，利用实施例3的方法检测次级生物碱的峰形得到较大改善，各次级生物碱与尼古丁都能得到有效分离，互相之间不干扰，提高了测量的准确度。实施例1中S-假木贼碱的峰信号相对实施例3的峰信号更强。

按照实施例4和实施例5的方法对烟碱进行检测，发现在实施例4和实施例5的检测条件下，对于上述提到的次级生物碱和烟碱都能够得到有效的分离，且峰形好，可做定性和定量的分析。

图8为利用对比例3的方法检测的次级生物碱的谱图。可以发现将初始流动相中有机相的比例提升到5％，2S-尼古丁-1-氧化物、R,S-新烟草碱、R,S-降烟碱的峰形变差，定量和定性离子对都相同的S-假木贼碱与尼古丁也无法有效分离。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (16)

1.一种烟碱中次级生物碱含量的测定方法，其特征在于，采用液相色谱-多级质谱联用的方法对所述次级生物碱含量进行测定，所述次级生物碱包括麦斯明、可的宁、2S-尼古丁-1-氧化物、R,S-降烟碱、R,S-新烟草碱、S-假木贼碱及二烯烟碱中的一种或几种。

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述液相色谱的分析条件为：

选用C18反相色谱柱；流动相A为乙酸铵溶液，其pH为8～10.5；流动相B为由x和y两种有机物混合的有机溶剂，其中x为甲酸或乙酸，y为甲醇或乙腈，x在有机溶剂中的比例为0.025％～0.5％(v/v)；

采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的条件为：0～3分钟流动相A体积比保持在100％；3～23分钟流动相A体积比由100％下降至30％～40％；23～25分钟流动相A体积比由30％～40％下降至4％～6％；25～35分钟流动相A体积比保持在4％～6％；35～35.1分钟流动相A体积比由4％～6％上升至90％～100％；35.1～40分钟流动相A体积比保持在90％～100％。

3.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述乙酸铵溶液pH为10；所述有机溶剂中x的体积分数为0.1％；

所述梯度洗脱的条件为：0～3分钟流动相A体积比保持在100％；3～23分钟流动相A体积比由100％下降至37％；23～25分钟流动相A体积比由37％下降至5％；25～35分钟流动相A体积比保持在5％；35～35.1分钟流动相A体积比由5％上升至100％；35.1～40分钟流动相A体积比保持在100％。

4.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述C18反相色谱柱的粒径为1.7～5μm；所述C18反相色谱柱的内径为2.1mm或4.6mm，长度为50mm、100mm、150mm中的一种。

5.如权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述C18反相色谱柱的粒径为1.7μm；所述内径为2.1mm；所述长度为100mm。

6.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述液相色谱或所述液相色谱的分析条件为以下(1)～(3)中的一种或几种：

(1)流速0.2～0.5mL/min；

(2)柱温：30～50℃；

(3)进样量：1μL～10μL。

7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，其中，利用所述多级质谱对待测样品进行测定的方法包括：

定量离子对选择：当待测样品中所述次级生物碱的第一离子对的峰至少部分地被待测样品中所述烟碱的离子对的峰覆盖或者干扰时，选择所述次级生物碱的第二离子对的峰，当所述第二离子对的峰不被所述烟碱的离子对的峰覆盖或者干扰时，将所述第二离子对的峰对应的离子对作为所述次级生物碱的定量离子对；

定量分析：通过所述次级生物碱的定量离子对对所述次级生物碱的含量进行分析。

8.如权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述定量离子对选择满足下述(1)～(7)中的一种或几种：

(1)可的宁m/z：177.1/98.2；(2)2S-尼古丁-1-氧化物m/z：179.1/96.1；(3)R,S-降烟碱m/z：149.1/132.1；(4)R,S-新烟草碱m/z：161.1/144.1；(5)麦斯明m/z：147.1/105.2；(6)S-假木贼碱m/z：163.1/146.2；(7)二烯烟碱m/z：159.1/144.1。

9.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于，对所述次级生物碱进行所述定量分析时选用的碰撞电压满足下述(1)～(7)条件中的一种或几种：

(1)可的宁：28V；(2)2S-尼古丁-1-氧化物：20V；(3)R,S-降烟碱：12V；(4)R,S-新烟草碱：12V；(5)麦斯明：32V；(6)S-假木贼碱：15V；(7)二烯烟碱：28V。

10.如权利要求7所述的测定方法，其特征在于，利用所述多级质谱对所述待测样品进行测定的步骤还包括定性分析，所述定性分析包括定性离子对的选择，所述定性离子对的选择满足下述(1)～(7)中的一种或几种：

(1)可的宁m/z：177.1/80.2；(2)2S-尼古丁-1-氧化物m/z：179.1/84.2；(3)R,S-降烟碱m/z：149.1/80.1；(4)R,S-新烟草碱m/z：161.1/106.1；(5)麦斯明m/z：147.1/78.1；(6)S-假木贼碱m/z：163.1/118.3；(7)二烯烟碱m/z：159.1/117.1。

11.如权利要求10所述的测定方法，其特征在于，对所述次级生物碱进行所述定性分析时选用的碰撞电压满足下述(1)～(7)条件中的一种或几种：

(1)可的宁：36V；(2)2S-尼古丁-1-氧化物：20V；(3)R,S-降烟碱：32V；(4)R,S-新烟草碱：12V；(5)麦斯明：40V；(6)S-假木贼碱：15V；(7)二烯烟碱：40V。

12.如权利要求1-11任一项所述的测定方法，其特征在于，还包括：将烟碱样品用水稀释并定容制成待测样品。

13.如权利要求1-11任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法采用内标法对所述次级生物碱定量。

14.如权利要求13所述的测定方法，其特征在于，内标物为氘代可的宁。

15.如权利要求13所述的测定方法，其特征在于，还包括以下步骤：

标准溶液的配制：将需要测定的次级生物碱标准样品配置成不同梯度的标准溶液；

标准曲线的绘制：测定不同梯度的所述标准溶液和所述内标物的定量离子对的峰面积，将所述标准溶液的定量离子对的峰面积与所述内标物的定量离子对的峰面积之比与次级生物碱的浓度进行线性拟合，得到所述次级生物碱的一元线性回归方程；

次级生物碱含量的确定：将通过多级质谱测定的待测样品的数据代入所述一元线性回归方程中，计算得到所述待测样品中次级生物碱的含量。

16.如权利要求15所述的测定方法，其特征在于，所述次级生物碱的标准溶液的线性浓度范围满足以下(1)～(7)中的一种或几种：

(1)麦斯明标准溶液浓度范围为：0.2μg/mL～20μg/mL；

(2)可的宁标准溶液浓度范围为：0.002μg/mL～2μg/mL；

(3)2S-尼古丁-1-氧化物标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL；

(4)R,S-降烟碱标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL；

(5)R,S-新烟草碱标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL；

(6)S-假木贼碱标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL；

(7)二烯烟碱标准溶液浓度范围为：0.01μg/mL～10μg/mL。

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