CN103323419A

CN103323419A - 一种烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的检测方法

Info

Publication number: CN103323419A
Application number: CN2013102575795A
Authority: CN
Inventors: 孙金影; 吴铁; 吕思敏; 钟月春; 郑志明
Original assignee: Guangdong Medical University
Current assignee: Guangdong Medical University
Priority date: 2013-06-15
Filing date: 2013-06-15
Publication date: 2013-09-25

Abstract

本发明涉及一种分析检测技术领域烟草中尼古丁生物碱的检测方法，其特征如下：1，将香烟烟丝取出，加入超纯水超声提取，萃取液经滤膜过滤、流动相稀释后，作为进样溶液；2，利用高效液相色谱-紫外检测方法，对尼古丁生物碱进行测定。通过与标准品的保留时间对比对烟草中尼古丁生物碱定性，外标法定量。与其他分析烟草中生物碱的方法相比，本方法操作简单、分析快速、重现性好、灵敏度高，且能够将其他生物碱组分提取出来，可用于烟草尼古丁生物碱的质量控制。

Description

一种烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的检测方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体为一种烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的检测方法。

背景技术

烟草生物碱是烟草及烟草制品的重要组成部分，其中尼古丁生物碱也称烟碱，占烟草生物碱总量的98％，占整个烟草干重的1％-3％。一方面，尼古丁生物碱是导致吸烟成瘾的重要诱因，且本身有剧毒；另一方面尼古丁及其他含量较低的生物碱的存在和含量高低影响香烟的口感和品质，而现行的国家标准中没有专属检测尼古丁的方法，且共存生物碱的存在常常干扰尼古丁生物碱的检测结果，因此需要建立烟草及烟草制品中尼古丁的灵敏、快速且专属性强的检测方法。

尼古丁生物碱在260nm的紫外区有响应，同时有电化学和电化学发光响应，因此目前人们已经建立了紫外分光光度法、电化学法和电化学发光法来检测烟草中的尼古丁生物碱。但由于紫外分光光度法、电化学法和电化学发光检测法是通用的检测方法，因此检测中受干扰较多。与气相色谱、液相色谱、毛细管电泳等复杂体系的分离技术相结合能够有效克服上述检测中遇到的问题。因质谱分辨率高，定性能力强，对分离的条件要求相对较低，因此常与气相色谱、液相色谱和毛细管电泳等联用用于烟草和烟草制品中尼古丁及其他生物碱的定性和定量分析。但质谱仪价格昂贵，维持费用和使用费用高，且对操作技术的要求高，限制了它在日常分析中的应用，因此开发成本低廉且操作简便的用于烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的分析方法至关重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有烟草尼古丁生物碱检测技术中常用分离手段与MS检测联用时仪器价格昂贵、维持费用高和操作技能要求高的问题，开发维持费用低、操作简单同时准确性高、分析速度快的分析方法。

本发明烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的检测方法包括如下步骤：

1，取烟丝样品，加入水作为萃取溶剂，超声萃取，微孔滤膜过滤，收集滤液，流动相稀释后作为进样溶液；

2，利用高效液相色谱-紫外检测联用分析上述样品溶液，对烟丝中尼古丁生物碱进行定性和定量。

步骤1中，烟丝与萃取剂水的比例为200mg∶20mL。

步骤1中，超声萃取时间为30min，萃取之间静置时间10min，超声萃取之后静置时间10min。

步骤1中，收集滤液，流动相稀释倍数为10。

步骤2中，所述分离和检测条件为：检测波长260nm，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6mm×250mm×5μm，Agilent)，流动相为甲醇∶20mmol/L KH₂PO₄∶三乙胺＝10∶90∶0.05％(v：v，以H₃PO₄调节pH至3.2)，流速1.0mL/min。以尼古丁标准品溶液中尼古丁生物碱的保留时间对烟草和烟草制品中的尼古丁生物碱定性，外标法定量。

本发明与现有技术相比有如下有益效果：

(1)本发明中所用萃取溶剂仅为水，操作步骤简便，对环境无害，对操作者身体健康无任何影响，且所得萃取液可直接用于动物实验。

(2)以水为萃取剂，回收率高，能够完全萃取烟丝中的尼古丁生物碱和其他水溶性的生物碱，方法准确度高。

(3)本发明所采用的分离检测方法为HPLC-UV，仪器价格低廉，维护和运行成本低，利于方法的推广。

(4)本发明中检测方法中所采用的流动相有机相所占比例小，对环境污染少，利于保护操作者的身体健康。

附图说明

图1为实施例中尼古丁生物碱标准溶液的HPLC谱图；

图2为实施例中烟草样品萃取液的HPLC谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步描述。实施例仅用于本发明而不限于本发明的范围。

实施例中的烟丝样品一种来自安徽中烟集团的黄山牌香烟，两种来自湖南中烟集团的万宝路和白沙香烟，一种来自广东省湛江市廉江烟丝厂烟丝；

尼古丁标准品购自美国Sigma-Aldrich；

高效液相色谱仪为岛津LC-20AT；检测器为SPD-20A型紫外检测器；色谱柱为ZORBAXEclipse Plus C18柱(4.6mm×250mm×5μm，Agilent)；超声波清洗仪购自昆山超声仪器有限公司。

实施例

1，样品制备

配制浓度为1.0mg/mL的尼古丁甲醇储备液，并于低温暗处冷藏保存；低浓度系列由储备液经流动相逐级稀释而得，并同样于冰箱暗处冷藏保存。

称取200mg烟丝样品于50mL烧杯中，加入20mL超纯水作为萃取剂，轻摇，然后静置10min使烟丝被萃取剂充分浸润，超声30min，再静置10min。经孔径0.22μm滤膜过滤后用流动相稀释10倍，作为待分析样品。

2，标准曲线和检测限

配制0.005μg/mL，0.01μg/mL，0.05μg/mL，1μg/mL，10μg/mL，50μg/mL和100μg/mL8个浓度系列的尼古丁标准品溶液，考察峰面积与浓度呈线性的工作范围。低浓度的标准品溶液多次进样，信噪比3倍所对应的浓度定义为检测限。经过考察，尼古丁浓度在0.05μg/mL-100μg/mL浓度范围内时，峰面积响应与浓度呈良好的线性关系，线性方程为y＝13039.7+16761.4x(y：峰面积；x：μg/mL)，线性相关系数0.9970，检测限为0.005μg/mL。

3，精密度、重复性和回收率

以10μg/mL尼古丁标准品溶液进样，考察了方法的日内和日间精密度及重复性，每个样品连续进样3次，取平均值。日内连续8次进样和日间连续5天进样的相对标准偏差(RSD)分别为1.5％和0.9％，说明该方法用于日内和日间测定时精密度和重复性良好。将高、中、低三个浓度水平的尼古丁标准品溶液加入到烟丝萃取液中，测定加标回收率，结果显示回收率在94.4％-102.9％之间，表明测定有较好的准确性，符合分析测定的要求。

4，样品稳定性

考察了100μg/mL尼古丁标准品溶液和烟丝萃取液原液在冰箱中冷藏保存的稳定性，每次将尼古丁标准品溶液和烟丝原液用流动相稀释10倍，再进样分析，每隔2天分析一次，连续10天，所得RSD分别为1.2％和2.4％，说明样品在低温暗处保存10天有较好的稳定性。

5，烟丝中尼古丁生物碱含量测定

以尼古丁标准品的保留时间对烟丝中尼古丁生物碱定性，以外标法定量，测定了安徽中烟集团生产的黄山烟烟丝、湖南中烟集团生产的白沙烟烟丝和万宝路烟烟丝以及广东省湛江市廉江烟丝厂生产的烟丝中尼古丁生物碱的含量。分离和检测条件为：ZORBAX Eclipse PlusC18柱(4.6mm×250mm×5μm)色谱柱；甲醇∶20mmol/L KH₂PO₄∶三乙胺＝10∶90∶0.05％(v：v，以H₃PO₄调节pH至3.2)流动相，等度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：常温；进样量10μ1；检测波长：260nm。测定结果以三次测定的平均值±标准偏差表示，四种烟丝中尼古丁含量分别为10.59±0.77mg/g，13.53±0.38mg/g，10.82±0.41mg/g和10.89±0.92mg/g。综上所述，本发明中的方法操作简单方便，分离度、准确性、精密度高，灵敏度好，能够用于烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的分析检测，也可用于烟草中其他少量生物碱的分析检测。

Claims

1.一种烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的高效液相色谱检测方法，其特征在于：以水为溶剂将烟草和烟草制品中尼古丁生物碱游离出来，并通过高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)方法检测其中的尼古丁，以尼古丁标准品的保留时间对烟草和烟草制品中的尼古丁生物碱定性，以外标法对其定量。

2.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的测定方法，其特征在于：

(1)烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的萃取：称取200mg烟草或烟草制品中的烟丝粉末于50mL小烧杯内，加入20mL水为萃取剂，静置浸润试样，超声萃取；

(2)烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的分析：萃取后静置，使得烟丝与萃取剂较好的分离，取萃取液经微孔滤膜过滤，收集过滤液，经流动相稀释后作为待分析样品进样分析；

色谱分析条件：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱柱，长度25cm，内径4.6mm，填料粒径5μm；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；流动相：甲醇∶20mmol/LKH₂P0₄∶三乙胺＝10∶90∶0.05％(v：v，以H₃P0₄调节pH至3.2)，等度洗脱；检测波长：260nm。

3.如权利要求1和2所述烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的萃取方法，其特征在于：超声时间20～60min，超声功率为100Hz。

4.如权利要求1和2所述烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的萃取方法，其特征在于：以超纯水为萃取剂，萃取之前静置10～30min，使得烟丝被萃取剂充分浸润；萃取后静置10～30min，使得烟丝与萃取液充分分离。

5.如权利要求1和2所述烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的分析方法，其特征在于：尼古丁标准品储备液配制于甲醇溶剂中，低浓度系列由储备液经流动相稀释而得，于低温暗处保存。

6.如权利要求1和2所述烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的分析方法，其特征在于流动相中有机相与水相的配比为5∶95～30∶70，有机相也可为乙腈，水相中缓冲盐也可为其他钾盐或者钠盐。流动相pH值在2.0～5.0之间，也可以冰乙酸调节pH值。

7.如权利要求1和2所述烟草及烟草制品中尼古丁生物碱的分析方法，检测波长在250～270nm之间。