CN114674906A - 一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的方法 - Google Patents
一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的方法，包括如下步骤：(1)制备烟草检测液；(2)将烟草检测液中的烟碱和酚类物质使用毛细管分离；(3)毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物。本发明的方法可同时检测烟草中烟碱和酚类物质，具有灵敏度高、分析速度快、选择性和重现性好的优点，在烟草质量控制和烟草化学研究中有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属烟草化学技术领域，具体涉及一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的方法。
背景技术
烟草，别称烟或烟叶，是茄科烟草属植物烟草Nicotiana tobacum L.的干燥全草，秋季按叶片成熟度，由下往上陆续采收，晒干或烘干后可做药用，也可鲜用。其不仅是烟草工业的中药原料，也是一种中草药。根据《中华本草》记载，烟草具有行气止痛、消肿、燥湿和杀虫解毒等功效。主治疥癣、食滞饱胀、毒蛇咬伤、气结疼痛、湿疹扭挫伤等。其含有众多生物活性物质，如生物碱、酚类物质、黄酮、酚酸、氨基酸、蛋白质等，其含量和烟草的质量和疗效息息相关。烟草也是提取药用烟碱、绿原酸等活性成分的重要原料。
烟草中含有多种生物碱，其中烟碱又名尼古丁，含量最高，约占烟草生物碱总量的95％。其化学名称为1-甲基-2-(2-吡啶基)吡咯烷，是烟草成瘾性的主要物质基础，也是烟草及其制品质量控制的主要指标，烟碱含量的高低不仅关系到烟草制品的质量，而且关系到人体健康。将其提取出来可用于制药或配置电子烟烟油。此外，烟草中还含有众多的酚类物质，如酚酸、黄酮等，主要有芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸等。研究表明，酚类物质是烤烟生长发育和采后制品品质的重要物质，在烟草生长、调制特性、烟草色泽、烟气香吃味和烟气生理强度等方面起作用，是研究和衡量烟草品质的主要因素。通常，较高等级的烟草，其酚类为物质含量较高。酚类物质的含量范围较宽，占烟叶干重的0.52～6.04％。目前检测烟草及其制品中烟碱和酚类物质主要采用高效液相色谱法和气相色谱法，分析方法复杂，分析成本较高，且不能同时检测。所以，建立能同时检测烟草中烟碱和酚类物质的快速简便的分析方法具有十分主要的实际意义。
毛细管电泳是一种在毛细管中的直流电场中进行样品电泳分离分析的微流控分析方法，其以微管道为特征，优点在于柱效高、分析速度较快、进样体积小和毛细管极易清洗等，进样量为几纳升级，节省样品和试剂。因毛细管内径通道尺寸微小，需要高灵敏度的检测手段，毛细管电泳常采用紫外检测器和激光诱导荧光检测器。常用的分离毛细管内径通常小于100μm，紫外吸收光程短，检测灵敏度不高。对无紫外吸收和非荧光或不易衍生的物质就需使用其它检测技术，如电化学和质谱检测等。电化学检测技术具有灵敏度高、选择性好、死体积小、成本低、电极及控制仪器小巧易集成的优点，主要包括安培检测、电位检测和电导检测法，其中最常用的安培检测法通过将恒定的电位施加在检测电极上，通过测量被测物在电极上发生氧化或还原产生的与浓度有关的电流信号来完成检测，但将毛细管电泳电化学检测技术用于烟草中烟碱和酚类物质的同时检测，尚未见文献报道。烟草中烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸等烟碱和酚类物质均为电化学活性物质，采用毛细管电泳安培检测可提高检测灵敏度。由于非电化学活性物质不被检测，方法具有选择性，可简化获得简化的毛细管电泳图谱，降低共存物质对分析结果的干扰。
本发明建立了一种用于烟草中烟碱和酚类物质同时检测的毛细管电泳电化学分析新方法，具有检测灵敏度高、选择性好、分离分析速度快、分析成本低、样品处理简单、方法选择性好等优点，可满足烟草实际样品中烟碱和酚类物质的快速分析，在烟草质量控制和烟草化学研究中有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提出一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的方法。
本发明的技术方案如下：
一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的方法，包括如下步骤：
(1)制备烟草检测液；
(2)将步骤(1)的烟草检测液中的烟碱和酚类物质使用毛细管分离；
(3)毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物。
优选地，所述酚类物质为芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸。
优选地，步骤(1)烟草检测液的制备方法为：将烟草粉末用甲醇、乙醇或水溶液在50-70℃下提取时间为20-40min；提取液过滤得到滤液、除去溶剂后加入缓冲液稀释，用滤膜过滤或离心后得到滤液即为烟草检测液。
优选地，所述缓冲液为硼酸盐液，其浓度为10-100mM，pH值为8-10；更优选地，其浓度为50mM，pH值为9.2。。
优选地，步骤(2)使用毛细管的长度为10-80cm，内径为10-50μm，外径为355-375μm，外部包裹一层聚酰亚胺涂层，涂层厚度为20-30μm；使用前，需借助负压用氢氧化钠溶液、稀盐酸和硼酸盐缓冲溶液依次分别冲洗10min以上，然后填充pH值为9.2的50mM的硼酸盐缓冲溶液；烟碱和酚类物质分离和进样电压为1-30kV，进样时间为1-10s。更优选地，毛细管的长度为40cm，内径为25μm，外径为365μm，外部包裹的聚酰亚胺涂层厚度为25μm；分离和进样电压为12kV，进样时间为5s。
优选地，步骤(3)毛细管电泳安培法的检测条件为：碳基材料圆盘电极为检测电极，检测电极与毛细管的出口同心准直，二者的距离为10-100μm；参比电极为饱和甘汞电极，检测电位为+0.7-+1.0V；环境温度为20-30℃。更优选地，检测电极与毛细管的出口的距离为50μm；检测电位为+0.8V；环境温度为25℃。
优选地，碳基材料圆盘电极材质为碳纳米管、石墨烯、铅芯或玻碳中的一种或几种；圆盘电极直径为50μm。
本发明的毛细管电泳安培法同时检测烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸的方法。使用长度为10～80cm的熔融石英毛细管，内径为10-50μm，外径为355-375μm，外部包裹一层聚酰亚胺涂层，厚度为20-30μm，毛细管内填充10-100mM的硼酸盐缓冲溶。当电泳分离和进样电压为1-30kV，采用电动进样方式，进样时间为1-10s，可将烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸完全分离。采用安培检测方式，以碳基材料圆盘电极为检测电极，材质可为碳纳米管、石墨烯、铅芯或玻碳等。检测电极和毛细管电泳出口的距离为10-100μm，当安培检测电位为0.7-1.0V，其峰电流与浓度在0.001-1.0mM范围内有线性关系，方法的检测下限在0.1-0.2μM。
优选的检测条件为：熔融石英毛细管长度为40cm，内径为25μm，外径为365μm，外部包裹一层25μm厚的聚酰亚胺涂层，毛细管内填充pH值为9.2的50mM的硼酸盐缓冲溶，分离和进样电压均为12kV，电动进样时间为5s，采用安培检测方式，以碳纳米管圆盘电极为检测电极，电极直径为500μm，检测电极和电泳分离毛细管出口的距离为50μm；参比电极为饱和甘汞电极，检测电位为+0.8V。
烟草检测液的制备方法为：烟草分析前需粉碎为20-200目，每克烟草粉末可分散于20-200mL甲醇、乙醇或其水溶液中，通过水浴加热进行提取，温度为50-70℃，提取时间为2-40min。过滤或离心得到的提取液除去溶剂后，采用上述条件下进行检测，可同时完成烟草中烟碱和酚类物质得快速分离分析。
烟草检测液的制备方法包括如下步骤：
(A)将烟草样品于50-70℃的恒温鼓风干燥箱中干燥0.5-2h，优选的干燥温度为60℃，优选的干燥时间为1h。
(B)用粉碎机将干燥后的烟草样品粉碎，通过粉碎时间控制粉末的目数为20-200目，优选的目数为100目。目数过大粉末过细，比表面积大，吸附能力增大，对提取不利，且粉末间隙小，不利于传质；而目数过小，样品粉末颗粒大，溶剂渗透和被提取成分溶出慢，影响提取效率。
(C)烟草样品提取溶剂可为甲醇、乙醇或水溶液，优选的提取溶剂为甲醇。每克烟草粉末可分散于20-20mL的提取溶剂中，优选的溶剂体积为50mL/g样品。通过水浴加热行提取，温度为50-70℃，提取时间为20-40min。对于甲醇，优选的提取温度为60℃，优选的提取时间为30min，通过过滤或离心获得清澈的提取液。
(D)为防止提取液中甲醇和乙醇产生的溶剂峰对毛细管电泳分离时对烟碱峰的干扰，本发明采用远红外线照射法、自然晾干法或氮吹法去除烟草提取液中的溶剂。具体方法为，吸取50-200μL的提取液于高25mm和直径25mm规格的圆柱形称量瓶中，于250W的远红外灯下烘烤，距离20cm，温度约为60-70℃，3-5min可干燥；也可室温敞口放置1h以上自然干燥，吹风可加速干燥。还可将50-200μL的提取液置于1.5mL规格的塑料样品管中，通过氮吹仪除去溶剂，加热温度为40-50℃，通氮气，约在30min内可将溶剂去除。
(E)最后，用去溶剂前提取液5-50倍体积的pH值为9.2的50mM的硼酸盐缓冲溶液溶解，于2000-5000rpm离心1-10分钟，上清液用于毛细管电泳进样分析。
本发明的毛细管电泳安培检测方法可以精确地检测在烟草实际样品中的烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸等化学成分。
本发明的有益效果：
1、本发明的方法利用了毛细管电泳安培检测的技术优势，建立了一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的方法。具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高、选择性好、样品用量少和分析成本低等优点。
2、由于烟草样品提取液中成分复杂，是多组分复杂样品体系。本发明采用毛细管电泳安培检测技术，先通过毛细管电泳将目标待测成分尽可能地分离，然后采用对具有电化学活性目标化合物进行检测，大幅提高了方法的选择性和专属性。同时，由于仅电化学活性成分被检测，测定的毛细管电泳图谱获得简化，将共存物质的干扰大幅降低。
3、本发明的方法借助毛细管电泳的特点建立了一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的新方法，将带不同电荷的成分进行分离，可将烟碱以及黄酮和酚酸等酚类物质同时分离和检测，大大提高了分析效率。
4、本发明的方法建立了一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的新方法，使用的熔融石英毛细管价格低廉，容易通过清洗复原，特别适合烟草等复杂样品体系的分析。
5、本发明中烟草样品提取液通过红外线照射、自然干燥或氮吹法去除溶剂，可消除样品毛细管电泳图谱中的溶剂峰的干扰。
附图说明
图1为本发明的毛细管电泳安培检测0.5mM的烟碱(1)、芦丁(2)、绿原酸(3)、槲皮素(4)、阿魏酸(5)、没食子酸(6)和原儿茶酸(7)的标准混合溶液的毛细管电泳图谱。
分离检测条件：熔融石英毛细管长度为40cm，内径为25μm，外径为365μm，外部包裹一层25μm厚的聚酰亚胺涂层，毛细管内填充pH值为9.2的50mM的硼酸盐缓冲溶，分离和进样电压均为12kV，电动进样时间为5s，采用安培检测方式，以碳纳米管圆盘电极为检测电极，电极直径为500μm，检测电极和电泳分离毛细管出口的距离为50μm，参比电极为饱和甘汞电极，检测电位为+0.8V。
图2为本发明的流体动力学伏安曲线，即检测电位对毛细管电泳安培检测0.5mM的烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸峰电流的影响曲线。
图3为本发明的毛细管电泳分离缓冲液的(a)pH值、(b)缓冲液浓度和(c)分离电压对烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸电泳迁移时间的影响、以及(d)电动进样时间对峰电流的影响。
图4为本发明实施例1的为毛细管电泳安培检测三个烟草样品的毛细管电泳图谱。其中：峰号1为烟碱，峰号2为芦丁，峰号3为绿原酸，峰号4为槲皮素，峰号5为阿魏酸，峰号6为没食子酸，峰号7为原儿茶酸。
具体实施方式
下面通过实施例和附图进一步描述本发明。
毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的方法的建立。酚类物质为芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸。
1、毛细管电泳安培检测方法
熔融石英毛细管使用前用浓度为0.1M盐酸溶液和浓度为0.1M的NaOH溶液各冲洗10min，以清洁毛细管内表面。在进行毛细管电泳电泳分离前，毛细管用运行缓冲液即pH为9.2的50mM硼酸盐缓冲溶液冲洗10min。阳极缓冲溶液池和接地的阴极缓冲溶液池均装有pH为9.2的50mM硼酸盐缓冲溶液，要求溶液表面在同一水平面上。接地的阴极缓冲溶液池为检测池，安装有分离毛细管、接地铂电极、饱和甘汞电极、铂丝辅助电极和碳纳米管圆盘检测电极。检测电极通过三维调节器与毛细管的出口同心准直，二者的距离为50μm。在毛细管两端的缓冲溶液中施加12kV的直流电压，通过电渗流使缓冲溶液通过毛细管，使毛细管电泳内的液体平衡10min以上。所用的毛细管电泳电化学检测系统包括±30kV高压直流电源和安培检测器，安培检测器施加在圆盘检测电极上的检测电位为+0.8V，电位参比电极为饱和甘汞电极。为操作方便，实验中所用毛细管电泳分离电压和电动进样电压均为12kV，优化的电动进样时间为5s；实验温度为25℃。
2、分离检测分析条件的优化
本发明将毛细管电泳与安培检测技术结合建立烟草中烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸的快速分离分析方法。通过优化实验获得优选的分离条件为：熔融石英毛细管长度为40cm，内径为25μm，外径为365μm，外部包裹一层25μm厚的聚酰亚胺涂层，毛细管内填充pH值为9.2的50mM的硼酸盐缓冲溶，分离和进样电压均为12kV，电动进样时间为5s；采用安培检测方式，以碳纳米管圆盘电极为检测电极，电极直径为50μm，检测电极和电泳分离毛细管出口的距离为5μm，检测电位为+0.8V，参比电极为饱和甘汞电极，实验温度为25℃。获得的0.5mM的烟碱(1)、芦丁(2)、绿原酸(3)、槲皮素(4)、阿魏酸(5)、没食子酸(6)和原儿茶酸(7)标准混合溶液的电泳图谱见图1。可见，烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸可在11min内完全分离，电泳图谱各混合物的信号峰尖锐；检测灵敏度高，无严重的拖尾和峰展宽现象，说明分离条件合适、检测电极状态良好。以下为优化检测电位、分离缓冲液pH值、缓冲液浓度、分离电压和进样时间的过程和结果。
(1)检测电位的优化
图2为流体动力学伏安曲线，即检测电位对毛细管电泳安培检测0.5mM的烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸峰电流的影响曲线。结果表明检测电极电位对检测电流具有显著影响；当电位过低，检测灵敏度低；而检测电位过高，本底溶液氧化析出氧气，造成基线不稳和本底电流过高，故需测试电极对检测物质的流体动力学伏安图对检测电位进行优化。除检测电位，测试0.5mM的烟碱(1)、芦丁(2)、绿原酸(3)、槲皮素(4)、阿魏酸(5)、没食子酸(6)和原儿茶酸(7)标准混合溶液在碳纳米管圆盘电极上的流体动力学伏安曲线的分离分析条件上述优选条件。从+0.1V至+1.2V逐步增加检测电位，每次增加幅度为0.1V，记录毛细管电泳图谱。将不同电位下检测电位和各物质峰电流作图，可得如图2所示的烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸的流体动力学伏安曲线。图2表明，检测电位对7种物质的峰电流信号具有显著影响，7种物质的流体动力学曲线轮廓相似。当电位从+0.1V升高到+0.4V，峰电流升高缓慢，但当电位高于+0.4V，电流快速上升。当电位高于+0.7V时，电流上升趋缓，而当电位高于+0.8V，峰电流基本不再上升，但本底电流快速上升，导致基线不稳和噪音增大。综合检测灵敏度和背景电流，优化的检测电位为+0.8V(相对于饱和甘汞电极)。
(2)运行缓冲溶液的酸度的优化
毛细管电泳中运行缓冲溶液的酸度不仅影响待测成分的荷电状况，还决定了毛细管内壁的硅羟基的电离情况，从而影响样品的电泳分离和电渗流的大小。烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸中，烟碱为生物碱，其他为酚类物质，缓冲溶液的酸度影响这些化合物的分离。其中芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸等均为酚类物质，有的带有羧基，在碱性水溶液可发生部分电离，由于解离程度不同，可进行电泳分离。本发明选用碱性硼酸盐缓冲液对这些物质进行电泳分离，浓度选定为50mM，借助酸度计配制pH值分别为8.0，8.6，9.2，9.7和10.2的硼酸盐缓冲液，对0.5mM的烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸混合标准溶液进行毛细管电泳分离，其他条件同上述优选条件。记录电泳图谱，测定缓冲溶液酸度迁移时间的影响，并绘制酸度-迁移时间曲线，见图3(a)。可见，样品的保留时间随缓冲液pH值上升而延长，而分离度获得了改善，这与酚类物质的解离有关，酸度下降，荷负电量增加，导致迁移时间上升和分离度提高。在pH为9.2时，电泳峰形最好，灵敏度最高，见图1。当溶液pH值高于9.7，电极析氧电位下降，造成电极背景电流快速上升，基线电流高且噪声大，电极稳定性降低。此外，电泳峰展宽，峰电流下降，且峰形变差。本实验根据样品检测灵敏度、基线电流、噪声和分析时间等因素，选择优化的分离缓冲液的pH值为9.2。
(3)运行缓冲液浓度的优化
在毛细管电泳分离中，分离用缓冲液的浓度对分析结果具有显著影响。缓冲液的浓度影响溶液的粘度、毛细管内表面的双电层厚度、电动电势、溶液的离子强度等，从而决定了毛细管管中电渗流和焦耳热的大小，并影响毛细管电泳电化学检测烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸的迁移时间、灵敏度和分离度。对于本实验使用的pH值为9.2的硼酸盐缓冲液，当浓度为12.5mM，25mM，50mM、75mM和100mM时，分别测定0.5mM烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸混合标准溶液的毛细管电泳电泳图谱，研究在一定酸度下，分离缓冲溶液浓度对烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸迁移时间的影响，并绘制浓度-迁移时间曲线，见图3(b)，其他条件同上述优选条件。结果显示，样品的保留时间随缓冲液浓度上升而延长，而分离度获得了改善，这与离子强度上升，电动电势下降引起电渗流下降有关，导致迁移时间上升和分离度提高。对于pH值为9.2的硼酸盐缓冲液，浓度为50mM时，电泳峰形最好，灵敏度最高，见图1。当分离缓冲液浓度高于50mM时，溶液电导率上升，焦耳效应明显，引起轴向扩散加速导致电泳峰变宽和检测灵敏度下降。焦耳热还会引起电泳图谱基线波动和信噪比下降，硼酸盐缓冲液的优化浓度为50mM。
(4)分离电压的优化
毛细管电泳分析中，分离电压不仅影响样品迁移时间和分离度，还决定焦耳热的大小。图3(c)显示了分离电压对烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸电泳迁移时间的影响，其他条件同上述优选条件。显然，随着电压分离电压从6kV上升到18kV，7种混合物的迁移时间降低，而分离度也快速下降。在较低的分离电压下，分离度提高，但分析时间大幅上升，但较高的分离电压会产生过高的焦耳热，导致基线稳定和较高的噪声，考虑到分析时间、分离度、基线稳定性和灵敏度等因素，优化的电泳分离电压选择为12kV。
(5)进样时间的优化
图3(d)表明毛细管电泳电动法进样时间对峰高具有显著影响，当进样电压为12kV时，选择不同的进样时间，记录烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸标准混合溶液的电泳图谱，测量峰高，做进样时间与峰高的关系曲线，研究电动进样时间对烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸峰高的影响，以选择优化分离电压，其他条件同上述优选条件。图3(d)显示，随电动进样时间从3s增加到5s，电泳图谱中7种化合物的峰高快速上升，继续增加进样时间，峰高增加不大，但引起峰展宽，造成分离度下降，优化的电动进样时间为5s，进样电压为12kV。
通过测定流体动力学伏安图以及对电泳分离缓冲溶液浓度和酸度、分离电压和进样时间的优化，获得了上述优选的毛细管电泳安培检测烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸的条件。
3、方法的重现性
在优化的条件下，采用毛细管电泳安培法检测了烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸(浓度均为0.5mM)标准混合溶液，采用电动进样，重复测定9次，记录电泳图，测量各化合物的电泳峰电流值，每次电泳分析时间均控制为20min。烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸电泳峰电流响应信号的相对标准偏差分别为1.9％、2.4％、2.1％、3.0％、2.8％、2.7％和3.2％，说明方法重现性和稳定性良好。
4、线性分析和检测下限
为测试毛细管电泳安培检测烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸中的峰电流和浓度的线性关系，配制了浓度在1μM到1mM范围的烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸的系列混合标准溶液。在优化条件下测定其电泳图谱，测量峰电流，研究上述7种物质在检测电极上的电流响应与被测物浓度的关系，做线性分析并计算检测下限，结果见表1。可见，7种物质在1μM到1mM浓度范围内，峰电流与浓度呈良好的线性关系。根据线性回归曲线和三倍基线噪音对应浓度(信噪比S/N＝3)计算检测下限，烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸的检测下限在0.1μM至0.2μM范围内。
表1毛细管电泳安培检测烟碱和酚类物质的校准曲线的回归分析和检测下限
a其中x，y和R分别为峰值电流(nA)、被分析物浓度(mM)和相关系数。
实施例1：毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质。步骤如下：
将待测烟叶样品于60℃的电热鼓风干燥箱中干燥1h，用样品粉碎机粉碎后备用。精确称取该粉末样品2.5g于250mL圆底烧瓶中，加100mL甲醇分散，称重，于60℃水浴中加热提取30min，然后置于槽式超声波清洗器中超声提取10min，擦干圆底烧瓶外部水分，用甲醇补重。将提取混合物用滤纸过滤，所得滤液置于干燥的容量瓶中备用。用微量进样器准确取滤液0.1mL于25mm×25mm的称量瓶中，置于上述可控温远红外干燥箱中，可在3min内将甲醇挥干，以消除毛细管电泳分离时的溶剂峰。然后，准确加入1mL的pH值为9.2的50mM硼酸盐缓冲溶液将干燥的提取物溶解，移入1.5mL的聚丙烯离心管中，于3000rpm转速下离心后，上清液供毛细管电泳电化学分析用。
在上述优化的条件下分析了三个烟草样品，每个样品测定3次；三个烟草样品的毛细管电泳图谱见图4。由图4可知，三个烟草样品的毛细管电泳图谱具有相似的毛细管电泳电化学指纹图，均含烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸特征峰。测定结果见表2；由表2可知，三个烟草样品中烟碱、芦丁和绿原酸的含量较高，而槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸的含量较低。由于烟草中烟碱、芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸等均为电化学活性物质，采用毛细管电泳电化学检测可提高检测灵敏度。因非电化学活性物质不被检测，方法具有选择性，可简化获得毛细管电泳图谱，降低共存物质对分析结果的干扰。
表2毛细管电泳电化学检测烟草中烟碱和酚类的含量(mg/g，n＝3)
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备烟草检测液；
(2)将步骤(1)的烟草检测液中的烟碱和酚类物质使用毛细管分离；
(3)毛细管电泳安培法同时检测烟草中烟碱和酚类物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酚类物质为芦丁、绿原酸、槲皮素、阿魏酸、没食子酸和原儿茶酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的烟草检测液的制备方法为：将烟草粉末用甲醇、乙醇或水溶液在50-70℃下提取时间为20-40min；提取液过滤得到滤液，除去溶剂后加入缓冲液稀释，用滤膜过滤或离心后得到滤液即为烟草检测液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为硼酸盐液，其浓度为10-100mM，pH值为8-10。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述硼酸盐液的浓度为50mM，pH值为9.2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)使用毛细管的长度为10-80cm，内径为10-50μm，外径为355-375μm，外部包裹一层涂层厚度为20-30μm的聚酰亚胺涂层；使用前，用氢氧化钠溶液、稀盐酸和硼酸盐缓冲溶液依次分别冲洗10min以上；烟碱和酚类物质分离和进样电压为1-30kV，进样时间为1-10s。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，毛细管的长度为40cm，内径为25μm，外径为365μm，外部包裹的聚酰亚胺涂层厚度为25μm；分离和进样电压为12kV，进样时间为5s。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)毛细管电泳安培法的检测条件为：碳基材料圆盘电极为检测电极，检测电极与毛细管的出口同心准直，二者的距离为10-100μm；参比电极为饱和甘汞电极，检测电位为+0.7-+1.0V；环境温度为20-30℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，检测电极与毛细管的出口的距离为50μm；检测电位为+0.8V；环境温度为25℃。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，碳基材料圆盘电极材质为碳纳米管、石墨烯、铅芯或玻碳中的一种；圆盘电极直径为50μm。
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