CN104198554B

CN104198554B - 一种工作电极及其制备方法、生物传感器

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Publication number: CN104198554B
Application number: CN201410445152.2A
Authority: CN
Inventors: 丁春华; 肖宇; 汪国庆; 姜宏
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2014-09-03
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2034-09-03
Also published as: CN104198554A

Abstract

本发明涉及电化学技术领域，特别涉及一种工作电极及其制备方法、生物传感器。该工作电极的原料为活性炭，经成型、氧化、修饰纳米金属、硅烷化、接枝戊二醛、固载生物酶获得；工作电极的直径为0.5～10mm，长度为1～10cm，碘吸附值为700～2500mg/g，比表面积为700～3500m²/g，灰分≤4％。本发明提供的工作电极对生物酶的固载量得到了显著的提高，生物酶固载量可达52.5mg/g，而且该工作电极的灵敏度高、抗干扰能力强。本发明提供的生物传感器中的工作电极可拆卸，更换简单，生物传感器易于操作，可连续测量；而且待测液独立存在，进出样简便；磁力搅拌转子的设置可进一步提高检测灵敏度。

Description

一种工作电极及其制备方法、生物传感器

技术领域

本发明涉及电化学技术领域，特别涉及一种工作电极及其制备方法、生物传感器。

背景技术

由于生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。目前全球糖尿病患者已超过1.2亿人，中国患者人群居世界第二，中国的糖尿病发病率高达9.6％，未来50年内糖尿病仍将是中国一个严重的公共卫生问题。

糖尿病会引发严重的并发症，如糖尿病酮症酸中毒昏迷、糖尿病高渗昏迷、糖尿病眼病、糖尿病肾病等等，严重影响糖尿病患者的生活质量。目前的研究证明，严格控制血糖可以使糖尿病患者死亡的危险下降，减少或延缓糖尿病并发症的发生。可见，糖尿病治疗的关键在于严格控制血糖。严格控制血糖需要糖尿病患者将血糖控制到正常或接近正常的水平，即空腹血糖水平为6.1mmol/L，餐后2小时血糖水平为7.8mmol/L。因此，快速、准确检测血液中葡萄糖的浓度对于监测糖尿病具有重要意义。

目前，葡萄糖生物传感器成为葡萄糖检测的重要工具，它良好的选择性和灵敏性引起了人们的极大关注。葡萄糖生物传感器检测葡萄糖的原理为：葡萄糖生物传感器通过电极上的葡萄糖氧化酶与反应池溶液中的葡萄糖发生氧化还原反应，葡萄糖被氧化，葡萄糖氧化酶被还原，通过电子传递媒介将还原态的葡萄糖氧化酶恢复原态，持续发生氧化还原反应。葡萄糖生物传感器是利用电化学反应，形成电子流，检测终端收集该电流电压信号，利用电流或电压信号与葡萄糖浓度的线性关系，实现溶液中葡萄糖浓度的检测。

然而，葡萄糖生物传感器中的工作电极为玻碳电极，其不能直接进行物理方法或者化学方法固载酶，只能通过在玻碳电极表面进行其他处理，例如化学交联或者溶胶凝胶使得玻碳电极表面固载少量酶。由于玻碳电极的固载酶量低，使得其灵敏度未能达到理想水平。因此，提供一种酶固载量高、分析灵敏度高的工作电极具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种工作电极及其制备方法、生物传感器。该工作电极对生物酶的固载量得到了显著的提高，生物酶固载量可达52.5mg/g，而且该工作电极的灵敏度高、抗干扰能力强；本发明提供的生物传感器中的工作电极可拆卸，更换简单，工作电极可重复利用，延长了生物传感器的使用寿命；生物传感器易于操作，可连续测量；而且待测液独立存在，进出样简便；磁力搅拌转子的设置可进一步提高检测灵敏度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种工作电极，其原料为活性炭，经成型、氧化、修饰纳米金属、硅烷化、接枝戊二醛、固载生物酶获得；

工作电极的直径为0.5～10mm，长度为1～10cm，碘吸附值为700～2500mg/g，比表面积为700～3500m²/g，灰分≤4％。

本发明将活性炭成型、修饰纳米金属、固载生物酶，制得工作电极，该工作电极由于自身的孔道结构和吸附力便于纳米材料的修饰和酶的固载。试验结果显示修饰的纳米金属颗粒有序且颗粒平整均匀，有利于提高电极的导电性和灵敏度，而且纳米粒子之间的空隙也有利于酶固载量的提高，通过共价固载使酶不易脱落，可提高酶性能，使酶促反应更加充分，同时延长了酶的使用寿命。

本发明对生物酶的固载量得到了显著的提高，生物酶固载量可达52.5mg/g；而且该工作电极的灵敏度高、抗干扰能力强。

作为优选，碘吸附值为700～850mg/g。

作为优选，比表面积为950～1100m²/g。

在本发明提供的一些实施例中，工作电极为圆柱形。但本发明中工作电极的形状并不局限于此，本领域技术人员认为可行的形状均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。

在本发明提供的一些实施例中，活性炭为煤质活性炭或椰壳活性炭。

在本发明提供的一些实施例中，纳米金属为纳米金、纳米银、纳米铜或纳米铂。

在本发明提供的一些实施例中，生物酶为葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶或脲酶。

本发明还提供了该工作电极的制备方法，包括如下步骤：

步骤A：取活性炭，经成型，获得成型活性炭；

步骤B：取成型活性炭，经氧化、修饰纳米金属、硅烷化、接枝戊二醛、固载生物酶，即得。

作为优选，工作电极的直径0.5～10mm，长度1～10cm，碘吸附值700～2500mg/g，比表面积700～3500m²/g，灰分≤4％。

优选地，碘吸附值为700～850mg/g。

优选地，比表面积为950～1100m²/g。

在本发明提供的一些实施例中，修饰纳米金属具体为：

以氧化后的活性炭为工作电极，设置对电极和参比电极，采用循环伏安法电沉积纳米钴；将沉积纳米钴后的活性炭浸入纳米金属溶液中修饰；

重复上述操作1～20次。

作为优选，电沉积纳米钴采用的试剂为0.01～1mol/LNa₂SO₄和5～50mmol/L醋酸钴的混合溶液。

优选地，电沉积纳米钴采用的试剂为0.01～0.1mol/LNa₂SO₄和5～10mmol/L醋酸钴的混合溶液。

作为优选，循环伏安法的参数设置为：扫速为1～100mv/s，扫描范围：-0.9～0.5V，扫描圈数：1～400。

优选地，循环伏安法的参数设置为：扫速为10～50mv/s，扫描范围：-0.9～0.5V，扫描圈数：20～100。

在本发明提供的一些实施例中，纳米金属溶液为四氯金酸溶液、硝酸银、氯化铜、氯铂酸或硫氰化铁。

作为优选，纳米金属溶液的浓度为0.1～50mmol/L。

作为优选，修饰的时间为5～40min。

本发明还提供了该工作电极在制备生物传感器中的应用。

本发明还提供了一种生物传感器，该生物传感器包括本发明提供的工作电极1、对电极2、参比电极3、磁力搅拌转子4、外壳5、信号处理器6、玻璃池7、液体出口开关8、液体出口9、液体入口10、电极固定体11、反应池12、螺丝13，具体连接关系为：

工作电极1、对电极2和参比电极3固定于电极固定体11内，工作电极1通过螺丝13固定于电极固定体11；磁力搅拌转子4固定于玻璃池7，电极固定体11与玻璃池7构成反应池12；

玻璃池7有液体入口10和液体出口9，液体出口9设置有液体出口开关8；液体入口10与待测液输入装置连接，液体出口9与废液瓶连接；

电极固定体11镶嵌于外壳5上并通过导线连接信号处理器6。

本发明提供的生物传感器以本发明制得的经纳米金属修饰、固载生物酶的活性炭电极为工作电极，该工作电极的生物酶固载量可达52.5mg/g，灵敏度高，抗干扰能力强；该工作电极可拆卸，更换简单，工作电极可重复利用，延长了生物传感器的使用寿命。生物传感器易于操作，可连续测量；而且待测液独立存在，进出样简便；磁力搅拌转子的设置可进一步提高检测灵敏度。

作为优选，对电极2由导电材料制成。

在本发明提供的一些实施例中，对电极2由铂、金、银或石墨制成。

作为优选，参比电极3为饱和甘汞电极，内充液体为饱和氯化钾。

作为优选，电极固定体11由聚四氟乙烯材料制成。

本发明提供的传感器在测量样品前应清洗玻璃池7；待测液注入后，启动磁力搅拌转子4；电极插入待测液中通过导线与信号处理器6连接记录电流和电压，根据响应电流与葡萄糖浓度的线性关系，在显示窗口显示待测液的葡萄糖浓度。

本发明提供了一种工作电极及生物传感器。该工作电极的原料为活性炭，经成型、氧化、修饰纳米金属、硅烷化、接枝戊二醛、固载生物酶获得；工作电极的直径为0.5～10mm，长度为1～10cm，碘吸附值为700～2500mg/g，比表面积为700～3500m²/g，灰分≤4％。本发明提供的工作电极对生物酶的固载量得到了显著的提高，生物酶固载量可达52.5mg/g，而且该工作电极的灵敏度高、抗干扰能力强。

本发明提供的生物传感器中的工作电极可拆卸，更换简单，工作电极可重复利用，延长了生物传感器的使用寿命；生物传感器易于操作，可连续测量；而且待测液独立存在，进出样简便；磁力搅拌转子的设置可进一步提高检测灵敏度。

附图说明

图1示实施例1中纳米钴的SEM示意图；

图2示实施例1中纳米金的SEM示意图；

图3示实施例1中葡萄糖氧化酶浓度和吸光度的标准曲线；

图4示实施例1中工作电极固载葡萄糖氧化酶量的曲线图；

图5示实施例4中生物传感器的具体连接关系；

图6示实施例4中生物传感器在不同葡萄糖浓度下的电流响应；

图7示实施例4中生物传感器对尿酸、抗坏血酸、葡萄糖的电流响应。

具体实施方式

本发明公开了一种工作电极及其制备方法、生物传感器，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的工作电极及其制备方法、生物传感器中所用原料、试剂或材料均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1工作电极的制备

将活性炭(煤质活性炭)成型为圆柱状，直径3mm，长度2.2cm，碘吸附值800mg/g，比表面积1000m²/g，灰分≤4％。

称取成型活性炭4g，用蒸馏水煮沸30min，过滤，重复上述操作三次，将其放入烘箱中110℃下干燥12h。

取干燥好的活性炭置于圆底烧瓶中，加入100mL、20％HNO₃溶液，80℃下油浴搅拌回流反应3h。将经过滤得到的滤饼置于500mL烧杯中，加入400mL蒸馏水煮15min、过滤，重复操作3次。将得到的活性炭放入干燥箱中，100～120℃下干燥12h，获得氧化后的活性炭。

对上述制得的氧化后的活性炭修饰纳米金属，其具体操作为：以上述氧化后的活性炭为工作电极，Pt为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在0.1mol/LNa₂SO₄和10mmol/L醋酸钴的溶液中，采用循环伏安法电沉积纳米钴，循环伏安法的参数设置为：扫速为50mv/s，扫描范围：-0.9～0.5V，扫描圈数：20；将处理好的活性炭浸入25mmol/L的四氯金酸溶液中20min。重复该操作3次，获得修饰纳米金属的活性炭。电沉积纳米钴的SEM图见图1，修饰纳米金的SEM图见图2。由图2可以看出纳米金颗粒有序且颗粒平整均匀，有利于提高电极的导电性和灵敏度，而且纳米粒子之间的空隙也有利于酶固载量的提高，通过共价固载使酶不易脱落，可提高酶性能。

在氮气保护下，将100mL经分子筛干燥后的甲苯、1g上述制得的修饰纳米金属的活性炭、2mL(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(AMPTS)加入三口烧瓶中，在110℃下回流搅拌24h。加热完成后过滤，并用无水乙醇冲洗，得到的表面硅烷化活性炭置于索氏提取器中充分提取24h，最后产物在80℃真空干燥，获得硅烷化活性炭。

取3g上述制得的硅烷化活性炭于150mL的烧瓶中，加入100mL乙醇作溶液，再加入5mL的50wt％戊二醛，80℃回流搅拌2h后，过滤，并用蒸馏水多次冲洗滤饼，所得活性炭置于80℃真空干燥器中干燥24h，获得接枝戊二醛的活性炭。

称取上述制得的接枝戊二醛的活性炭0.6g置于装有100mL蒸馏水的锥形瓶中，并加入30mg葡萄糖氧化酶，冰浴搅拌24h，获得工作电极。

对获得的工作电极进行生物酶固载量的检测，检测方法如下：

1、葡萄糖氧化酶浓度和吸光度的标准曲线测定

取1、2、3、4、5、6号共6支试管，分别在试管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL0.1mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，然后，在上述试管中依次加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mL蒸馏水。最后，在每支试管中均加入5mL考马斯亮蓝染液，室温下摇均。以1号试管为参比在595nm测各管内溶液的吸光度。绘制的标准曲线如图3所示。

2、生物酶固载量的检测

分别称量1g上述制得的接枝戊二醛的活性炭于锥形瓶中。再分别加入浓度为0.04、0.07、0.1、0.3、0.5mg/mL葡萄糖氧化酶溶液。冰浴24h，过滤，测滤液在595nm处的吸光度，根据绘制的标准曲线计算生物酶固载量，结果如图4所示。

由图4可以看出，实施例1制得的工作电极的生物酶固载量达52.5mg/g。

实施例2工作电极的制备

将活性炭(椰壳活性炭)成型为圆柱状，直径0.5mm，长度1cm，碘吸附值700mg/g，比表面积1100m²/g，灰分≤4％。

称取成型活性炭4g，用蒸馏水煮沸30min，过滤，重复上述操作三次，将其放入烘箱中110℃下干燥18h。

取干燥好的活性炭置于圆底烧瓶中，加入100mL、20％HNO₃溶液，80℃下油浴搅拌回流反应3h。将经过滤得到的滤饼置于500mL烧杯中，加入400mL蒸馏水煮15min、过滤，重复操作3次。将得到的活性炭放入干燥箱中，100～120℃下干燥18h，获得氧化后的活性炭。

对上述制得的氧化后的活性炭修饰纳米金属，其具体操作为：以上述氧化后的活性炭为工作电极，Pt为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在0.01mol/LNa₂SO₄和5mmol/L醋酸钴的溶液中，采用循环伏安法电沉积纳米钴，循环伏安法的参数设置为：扫速为10mv/s，扫描范围：-0.9～0.5V，扫描圈数：100；将处理好的活性炭浸入0.1mmol/L的硝酸银溶液中40min。重复该操作1次，获得修饰纳米金属的活性炭。

称取上述制得的接枝戊二醛的活性炭0.6g置于装有100mL蒸馏水的锥形瓶中，并加入30mg过氧化氢酶，冰浴搅拌24h，获得工作电极。并对其进行了生物酶固载量的检测，结果显示该工作电极的生物酶固载量达50.8mg/g。

实施例3工作电极的制备

将活性炭(煤质活性炭)成型为圆柱状，直径10mm，长度10cm，碘吸附值850mg/g，比表面积950m²/g，灰分≤4％。

称取成型活性炭4g，用蒸馏水煮沸30min，过滤，重复上述操作三次，将其放入烘箱中110℃下干燥24h。

取干燥好的活性炭置于圆底烧瓶中，加入100mL、20％HNO₃溶液，80℃下油浴搅拌回流反应3h。将经过滤得到的滤饼置于500mL烧杯中，加入400mL蒸馏水煮15min、过滤，重复操作3次。将得到的活性炭放入干燥箱中，100～120℃下干燥24h，获得氧化后的活性炭。

对上述制得的氧化后的活性炭修饰纳米金属，其具体操作为：以上述氧化后的活性炭为工作电极，Pt为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在0.09mol/LNa₂SO₄和9mmol/L醋酸钴的溶液中，采用循环伏安法电沉积纳米钴，循环伏安法的参数设置为：扫速为40mv/s，扫描范围：-0.9～0.5V，扫描圈数：30；将处理好的活性炭浸入50mmol/L的氯铂酸溶液中5min。重复该操作20次，获得修饰纳米金属的活性炭。

称取上述制得的接枝戊二醛的活性炭0.6g置于装有100mL蒸馏水的锥形瓶中，并加入30mgα-淀粉酶，冰浴搅拌24h，获得工作电极。并对其进行了生物酶固载量的检测，结果显示该工作电极的生物酶固载量达47.3mg/g。

实施例4生物传感器的制备

取实施例1制得的工作电极、对电极(由铂制成)、参比电极(饱和甘汞电极，内充液体为饱和氯化钾)、磁力搅拌转子、外壳、信号处理器、玻璃池、液体出口开关、液体出口、液体入口、电极固定体(由聚四氟乙烯材料制成)、反应池、螺丝组装成生物传感器，该生物传感器的具体连接关系参见图5，具体连接关系如下：

取工作电极(1)、对电极(2)和参比电极(3)固定于电极固定体(11)内，工作电极(1)通过螺丝(13)固定于电极固定体(11)；

磁力搅拌转子(4)固定于玻璃池(7)，电极固定体(11)与玻璃池(7)构成反应池(12)；

玻璃池(7)有液体入口(10)和液体出口(9)，液体出口(9)设置有液体出口开关(8)；液体入口(10)与待测液输入装置连接，液体出口(9)与废液瓶连接；

电极固定体(11)镶嵌于外壳(5)上并通过导线连接信号处理器(6)。

对上述制得的生物传感器进行电流响应值和抗干扰性的检测，具体试验及结果分析如下：

1、不同葡萄糖浓度下的电流响应

在玻璃池中加入19mLpH＝7.0的磷酸缓冲液，每隔15s滴入1mLpH＝7.0，浓度为0.05mol/L的葡萄糖溶液测得其每个浓度下的电流响应值。结果如图6。

由图6可以看出，线性关系为y＝0.0026x+0.1445，R²＝0.9976，可见，该生物传感器检测葡萄糖浓度线性范围宽广，为2.5～20.3mmol/L，同时电流响应值达到微安级，灵敏度较高。

2、抗干扰性测试

在玻璃池中加入20mLpH＝7.0的磷酸缓冲液，每隔15s分别滴入1mL0.1mol/L的尿酸、抗坏血酸、葡萄糖得到相应的电流响应。结果如图7。

由图7可以看出，本实施例生物传感器的工作电极对干扰因素的电流响应极小，而对葡萄糖有极强的响应，从而也说明实施例1提供的工作电极对葡萄糖的专一性强、抗干扰性强。

实施例5生物传感器的制备

取实施例2制得的工作电极、对电极(由金制成)、参比电极(饱和甘汞电极，内充液体为饱和氯化钾)、磁力搅拌转子、外壳、信号处理器、玻璃池、液体出口开关、液体出口、液体入口、电极固定体(由聚四氟乙烯材料制成)、反应池、螺丝组装成生物传感器，该生物传感器的具体连接关系参见图1，具体连接关系如下：

对上述制得的生物传感器进行了电流响应值和抗干扰性的检测，结果与实施例4制得的生物传感器的电流响应值和抗干扰性相近，表明本实施例制得的生物传感器检测葡萄糖浓度线性范围宽广，灵敏度较高，工作电极对相应底物的专一性强、抗干扰性强。

实施例6生物传感器的制备

取实施例3制得的工作电极、对电极(由银制成)、参比电极(饱和甘汞电极，内充液体为饱和氯化钾)、磁力搅拌转子、外壳、信号处理器、玻璃池、液体出口开关、液体出口、液体入口、电极固定体(由聚四氟乙烯材料制成)、反应池、螺丝组装成生物传感器，该生物传感器的具体连接关系参见图1，具体连接关系如下：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种工作电极，其特征在于，其原料为活性炭，经成型、氧化、修饰纳米金属、硅烷化、接枝戊二醛、固载生物酶获得；

所述修饰纳米金属具体为：

重复上述操作1～20次；

所述工作电极的直径为0.5～10mm，长度为1～10cm，碘吸附值为700～2500mg/g，比表面积为700～3500m²/g，灰分≤4％。

2.根据权利要求1所述的工作电极，其特征在于，所述活性炭为煤质活性炭或椰壳活性炭。

3.根据权利要求1所述的工作电极，其特征在于，所述纳米金属为纳米金、纳米银、纳米铜或纳米铂。

4.根据权利要求1所述的工作电极，其特征在于，所述生物酶为葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶或脲酶。

5.如权利要求1至4中任一项所述工作电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤A：取活性炭，经成型，获得成型活性炭；

步骤B：取所述成型活性炭，经氧化、修饰纳米金属、硅烷化、接枝戊二醛、固载生物酶，即得；

所述修饰纳米金属具体为：

重复上述操作1～20次。

6.如权利要求1至4中任一项所述的工作电极在制备生物传感器中的应用。

7.一种生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括如权利要求1至4中任一项所述的工作电极(1)、对电极(2)、参比电极(3)、磁力搅拌转子(4)、外壳(5)、信号处理器(6)、玻璃池(7)、液体出口开关(8)、液体出口(9)、液体入口(10)、电极固定体(11)、反应池(12)、螺丝(13)，具体连接关系为：

工作电极(1)、对电极(2)和参比电极(3)固定于电极固定体(11)内，工作电极(1)通过螺丝(13)固定于电极固定体(11)；磁力搅拌转子(4)固定于玻璃池(7)，电极固定体(11)与玻璃池(7)构成反应池(12)；

8.根据权利要求7所述的生物传感器，其特征在于，所述对电极(2)由导电材料制成。

9.根据权利要求7所述的生物传感器，其特征在于，所述参比电极(3)为饱和甘汞电极，所述饱和甘汞电极的内充液体为饱和氯化钾。