CN103723725B - 硅烷化活性炭的制备方法、固载化酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化工领域，特别涉及硅烷化活性炭的制备方法、固载化酶的制备方法。在本发明中，硅烷化活性炭的制备方法包括：取活性炭，经氧化，得到氧化后的活性炭；在有机溶剂和水存在的条件下，氧化后的活性炭与硅烷偶联剂发生硅烷化反应，即得；以g/mL计，氧化后的活性炭与水的用量比为1:（0.05～0.2）。本发明提供的固载化酶的制备方法可大大提高生物酶的固载量，酶活力也有所提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域，特别涉及在活性炭上固载化酶的制备方法。
背景技术
酶是具有生物催化功能的生物大分子，即生物催化剂，它能够加快生化反应的速度，但不改变反应的方向和产物，是一种催化反应条件温和、高选择性、无污染的天然高分子催化剂。在生物体内，酶参与机体所有的生命活动，使生物体内极其复杂的代谢活动不断地、有条不紊地进行。例如人体从食物中摄取的蛋白质，必须在胃蛋白酶的作用下，水解成氨基酸，成为人体可吸收利用的营养成分。在生产生活中，酶同样发挥着极其重要的作用，例如酿造酱油、食醋、酒，制作诊断疾病的试剂盒，治理环境污染等，因此酶在食品加工、医药、环境保护等方面有着广阔的应用前景。
然而，处于自由状态下的酶具有不稳定性，容易变形，在反应体系中的很难分离和提纯，因此固载酶技术应运而生。固载酶技术是用物理或化学方法处理生物酶使之固定于固相载体，但仍具有酶活性的一种技术。酶经固载后，不仅容易分离，而且对温度与pH值变化的稳定性高，可提高生成物的质量。
常用的酶固载方法有物理吸附法、包埋法和共价结合法。物理吸附法是通过物理吸附或静电引力将酶吸附在活性炭、氧化铝、离子交换树脂等具有活泼表面的载体上，优点是操作简便，缺点是结合不牢，酶容易脱落，从孔道里漏出，导致很差的操作稳定性。包埋法是将酶分子包埋在凝胶的网格中或微型胶囊中，优点是酶包埋在聚合物中不易漏出，操作条件温和，对外界环境的缓冲作用大，可防止酶体的机械损伤，易于再生，产物分离提取容易，适合实验室操作，缺点是持久性差，包埋反应可能会减损酶的活性。共价法相对于物理吸附法和包埋法具有一定的优势，它是通过酶分子上的官能团，如氨基、羧基、腈基、酚基、巯基、咪唑基，将酶分子通过共价键结合于天然或合成高聚物载体上，酶与载体结合牢固，酶分子不会脱落，具有较好的稳定性，因此目前多采用共价结合法进行酶的固载。例如将淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶通过共价结合方法固载到聚氯乙烯材料上，由这些材料制造成刷子、毛巾、容器等，在用于去除污渍时具有很好的效果。
但利用现有的固载方法，酶的固载量相对较低。例如：通过使用金属离子和戊二醛将过氧化氢酶固载到皮胶原纤维上，载体上酶的固载量只有20～30mg/g；采用聚合物微球固载生物酶，酶的固载量在30mg/g以下；用交联法将葡萄糖异构酶固载到活性炭上，并将固载酶应用于填充床反应器中，固载酶质量分数也只有1％～3％。因此，如何提高生物酶的固载量成为固载酶技术中亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了硅烷化活性炭的制备方法、固载化酶的制备方法。该制备方法通过在硅烷化反应体系中加入少量的水，提高了生物酶的固载量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种硅烷化活性炭的制备方法，包括如下步骤：
取活性炭，经氧化，得到氧化后的活性炭；
在有机溶剂和水存在的条件下，氧化后的活性炭与硅烷偶联剂发生硅烷化反应，即得；
以g/mL计，氧化后的活性炭与水的用量比为1:(0.05～0.2)。
硅烷偶联剂比较活泼，在水中易分解，所以硅烷化反应体系中一般不加入水进行硅烷化反应。本发明在硅烷化反应体系中加入少量水，从而可将硅烷偶联剂固载量提高10倍，其机制为：加入少量水有利于硅烷试剂与活性炭表面上的酚羟基发生水解反应，更容易将硅烷试剂共价固载到活性炭载体上。本发明中使用多胺基的硅烷偶联剂也可以使酶的固载量增加。
在本发明提供的一些实施例中，硅烷偶联剂为二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷或2-氨乙基三甲氧基硅烷中的一种或两者以上的混合物。
二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷能够提高固载量，这种硅烷偶联剂除了有一个伯胺之外还有另外两个仲氨基团，在接枝戊二醛时也会参与反应，相对于其他硅烷偶联剂能够接枝更多的戊二醛。目前，还未见将二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷作为硅烷偶联剂的报道。作为优选，硅烷化反应采用的硅烷偶联剂为二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷。
作为优选，氧化后的活性炭与水的用量比为1:(0.1～0.17)。
在本发明提供的一些实施例中，以g/mL计，氧化后的活性炭与硅烷偶联剂的用量比为1:(0.67～1)。
在本发明提供的一些实施例中，硅烷化反应为在63～120℃条件下进行硅烷化反应12～24h。
作为优选，硅烷化反应的时间为13～24h。
硅烷化反应需在有机溶剂中发生反应。作为优选，有机溶剂为甲苯、二氯甲烷、二甲基亚砜或乙醇中的一种或两者以上的混合物。
活性炭与生物酶发生共价结合前，需采用一系列的手段对活性炭进行改性，首先需要对活性炭进行氧化，使活性炭表面产生大量的酚羟基，用于硅烷化反应。在本发明提供的一些实施例中，氧化采用的试剂为硝酸。
在本发明提供的一些实施例中，硝酸的质量百分浓度为15％～25％。
在本发明提供的一些实施例中，氧化为在75～80℃的条件下氧化3～5h。
本发明还提供了一种固载化酶的制备方法，如本发明提供的硅烷化活性炭制备方法制得的硅烷化活性炭与戊二醛发生交联反应，得到接枝戊二醛的活性炭，再与生物酶共价结合，即得。
在本发明提供的一些实施例中，戊二醛的质量百分浓度为5％～10％。
在本发明提供的一些实施例中，交联反应具体为在50～60℃的条件下交联6～8h。
经过改性的活性炭可固载多种生物酶，在本发明提供的一些实施例中，生物酶包括脲酶、葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、漆酶、脂肪酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、谷氨酰胺转氨酶或α-淀粉酶。但生物酶的种类并非局限与此，本领域技术人员认为可行的生物酶均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
固载生物酶的过程中，将生物酶与缓冲溶液混合制得生物酶溶液，再与经接枝戊二醛的活性炭进行共价结合。在本发明提供的一些实施例中，生物酶溶液的质量体积浓度为1.5～3g/L。
生物酶溶液中采用的缓冲溶液优选为磷酸盐、酒石酸、柠檬酸或醋酸盐制得的缓冲溶液。
在本发明提供的一些实施例中，共价结合具体为在0～50℃的条件下共价结合12～36h。
作为优选，共价结合具体为在4～10℃的条件下固载10～24h。
活性炭是一种廉价、易得、无毒的多孔材料，孔径可在制备过程中调节，具有较高的机械强度，良好的耐磨性和固有的颗粒结构，满足填充床反应器连续操作的要求。在本发明提供的一些实施例中，活性炭的原料来源于煤质和/或果壳。
在本发明提供的一些实施例中，果壳选自椰壳、桃核壳、杏核壳或核桃壳中的一种或两者以上的混合物。
在本发明提供的一些实施例中，活性炭的孔径为1～200nm。
作为优选，活性炭的孔径为2～100nm。
在本发明提供的一些实施例中，活性炭的比表面积为200～1600m2/g。
在本发明提供的一些实施例中，活性炭的粒径为0.3～5mm。
本发明提供了硅烷化活性炭的制备方法、固载化酶的制备方法。本发明中硅烷化活性炭制备方法包括：取活性炭，经氧化，得到氧化后的活性炭；在有机溶剂和水存在的条件下，氧化后的活性炭与硅烷偶联剂发生硅烷化反应，即得；以g/mL计，氧化后的活性炭与水的用量比为1:(0.05～0.2)；本发明中固载化酶的制备方法为：本发明制得的硅烷化活性炭与戊二醛发生交联反应，得到接枝戊二醛的活性炭，再与生物酶共价结合，即得。经过检测后，本发明提供的制备方法制得的固载化酶的固载量在85～120mg/g之间，酶活力保持在35.5％～55.2％之间，而利用现有固载技术生物酶的固载量低于45mg/g，活力低于37％。由此可见，本发明提供的固载化酶的制备方法可大大提高生物酶的固载量，酶活力也有所提高。
附图说明
图1示实施例1中椰壳活性炭的碳元素X射线光电子能谱(XPS)图；
图2示实施例1中氧化后的活性炭的碳元素XPS图；
图3示实施例1提供的红外光谱(FT-IR)图。其中，线1示氧化后的活性炭，线2示硅烷化活性炭；
图4示实施例1提供的FT-IR图。其中，线2示硅烷化活性炭，线3示接枝戊二醛的活性炭；
图5示实施例1提供的FT-IR图。其中，线3示接枝戊二醛的活性炭，线4示固载化脲酶。
具体实施方式
本发明公开了硅烷化活性炭的制备方法、固载化酶的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的硅烷化活性炭的制备方法、固载化酶的制备方法中所用原料、试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1固载化脲酶的制备
将200mL质量百分浓度为20％的硝酸与5g椰壳活性炭(从sigma公司购买)进行混合，反应温度为80℃，反应时间为4h，用去离子水煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL甲苯作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2mL的3-氨丙基三甲氧基硅烷(硅烷偶联剂)混合，再加入0.3mL去离子水，在110℃下搅拌反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为6.8的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲溶液将脲酶(EC3.5.1.5)配成3g/L的脲酶溶液，取100mL脲酶溶液与1g第三产物在冰浴下搅拌36h，过滤，再用pH为6.8的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲溶液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物与椰壳活性炭(原料活性炭)利用X射线光电子能谱方法进行检测，结果如图1、图2所示。由图1、图2可知，氧化后的活性炭的-C-OH峰强度大大增强，结果表明第一产物含有大量的酚羟基官能团，酚羟基含量为0.25mmol/g，即得到了氧化后的活性炭。
取第二产物与第一产物利用红外光谱法进行检测，结果如图3所示。由图3可以看出，硅烷化活性炭在779cm-1处出现Ar-O-Si基团，721cm-1是-(CH2)3-基团的伸缩振动峰，同时在1546cm-1处出现-NH2伸缩振动峰，此外在1405cm-1处Ar-OH峰硅烷化后明显减弱。结果表明活性炭表面的酚羟基官能团与硅烷偶联剂发生了缩合，即得到了硅烷化活性炭。
取第三产物利用红外光谱法进行检测，结果如图4所示。由图4可以看出，1546cm-1处的-NH2伸缩振动峰消失，而在1564cm-1处出现C＝N双键的伸缩振动，同时在1726cm-1处出现醛基的C＝O伸缩振动。硅烷化结果表明硅烷化活性炭上的伯胺基与戊二醛上一端的醛基发生了缩合反应，即得到了接枝戊二醛的活性炭。
取第四产物利用红外光谱法进行检测，结果如图5所示。由图5可以看出，接枝戊二醛的活性炭在固载酶后醛基的C＝O双键伸缩振动消失，而在1500～1700cm-1处出现酶的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带吸收峰。结果表明酶成功固载在接枝戊二醛的活性炭上，即得到了固载化脲酶。
实施例2固载化脂肪酶的制备
将200mL质量百分浓度为20％的硝酸与5g椰壳活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为4h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL乙醇作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2mL的3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷混合，再加入0.3mL去离子水，在78℃下搅拌反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
最后用pH为6.5磷酸盐缓冲溶液将脂肪酶(EC3.1.1.3)配成3g/L的脂肪酶溶液，取100mL脂肪酶溶液与1g第三产物冰浴下搅拌36h。最后，过滤、真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化脂肪酶。
实施例3固载化葡萄糖氧化酶的制备
将200mL质量百分浓度为15％的硝酸与5g桃核活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为4h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
用150mL氯仿(二氯甲烷)作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2mL3-氨丙基三乙氧基硅烷硅混合，加入0.3mL去离子水，在63℃下反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为6.5的磷酸盐与柠檬酸缓冲溶液将葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)配制成1.5g/L的葡萄糖氧化酶溶液，取100mL的葡萄糖氧化酶溶液与1g第三产物在冰浴下搅拌36h，过滤，再用pH为6.5的磷酸盐与柠檬酸缓冲溶液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化葡萄糖氧化酶。
实施例4固载化木瓜蛋白酶的制备
将200mL质量百分浓度为15％的硝酸与5g桃核活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为4h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL甲苯作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2mL的3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷混合，加入0.3mL去离子水，在110℃下反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为6.5磷酸盐缓冲液将木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)配成2g/L的木瓜蛋白酶溶液。取100mL木瓜蛋白酶溶液与1g第三产物在4℃下搅拌24h，过滤，再用pH为6.5的磷酸盐缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化木瓜蛋白酶。
实施例5固载化过氧化氢酶的制备
将200mL质量百分浓度为15％的硝酸与5g杏核活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为5h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL二甲基亚砜作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与3mL2-氨乙基三甲氧基硅烷硅混合，加入0.15mL去离子水，在120℃下反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液将过氧化氢酶(EC1.11.1.6)配成2g/L的过氧化氢酶溶液，取100mL过氧化氢酶溶液与1g第三产物在冰浴下搅拌36h，过滤，再用pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化过氧化氢酶。
实施例6固载化果胶酶的制备
将200mL质量百分浓度为15％的硝酸与5g杏核活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为5h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL乙醇作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与3mL二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷硅混合，加入0.4mL去离子水，在78℃下反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为4.0磷酸盐与柠檬酸缓冲液将果胶酶(3.2.1.15)配成2g/L的果胶酶溶液，取100mL果胶酶溶液与1g第三产物在冰浴下搅拌36h，过滤，再用pH为4.0磷酸盐与柠檬酸缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化果胶酶。
实施例7固载化葡萄糖异构酶的制备
将200mL质量百分浓度为20％的硝酸与5g煤质活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为5h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL甲苯作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2mL的3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷混合，加入0.6mL去离子水，在110℃下反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为10％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为7.5磷酸盐缓冲液将葡萄糖异构酶(EC5.3.1.5)配成3g/L的葡萄糖异构酶溶液，取100mL葡萄糖异构酶溶液与1g第三产物在4℃下搅拌24h，过滤，再用pH为7.5磷酸盐缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化葡萄糖异构酶。
实施例8固载化α-淀粉酶的制备
将200mL质量百分浓度为20％的硝酸与5g煤质活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为5h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL甲苯作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2mL的2-氨乙基三甲氧基硅烷混合，加入0.5mL去离子水，在110℃下反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为6.0磷酸盐与柠檬酸缓冲液将α-淀粉酶(EC3.2.1.1)配成3g/L的α-淀粉酶溶液，取100mLα-淀粉酶溶液与1g第三产物在10℃下搅拌12h，过滤，再用pH为6.0磷酸盐与柠檬酸缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化α-淀粉酶。
实施例9固载化辣根过氧化物酶的制备
将200mL质量百分浓度为20％的硝酸与5g核桃核活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为5h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL二甲基亚砜作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与3mL2-氨乙基三甲氧基硅烷混合，加入0.3mL的去离子水，在120℃下反应13h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为5.0磷酸盐和柠檬酸缓冲液将辣根过氧化物酶(EC1.11.1.7)配成3g/L的辣根过氧化物酶溶液，取100mL辣根过氧化物酶溶液与1g第三产物在冰浴下搅拌36h，过滤，再用pH为5.0磷酸盐和柠檬酸缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化辣根过氧化物酶。
实施例10固载化谷氨酰胺转氨酶的制备
将200mL质量百分浓度为20％的硝酸与5g核桃核活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为5h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL甲苯作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2mL的二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷混合，加入0.3mL去离子水，在110℃下反应13h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为8％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为7.2磷酸盐缓冲液将谷氨酰胺转氨酶(EC2.3.2.13)配成2g/L的谷氨酰胺转氨酶溶液，取100mL谷氨酰胺转氨酶溶液与1g第三产物在冰浴下搅拌36h，过滤，再用pH为7.2磷酸盐缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化谷氨酰胺转氨酶。
实施例11固载化漆酶的制备
将200mL质量百分浓度为20％的硝酸与5g椰壳活性炭进行混合，反应温度为78℃，反应时间为4h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL氯仿(二氯甲烷)作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2mL的二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷混合，加入0.4mL去离子水，在65℃下反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在50℃条件下反应8h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为7.2磷酸盐缓冲液将漆酶(EC1.10.3.2)配成3g/L的漆酶溶液，取100mL漆酶溶液与1g第三产物在0℃下36h，过滤，再用pH为7.2磷酸盐缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化漆酶。
实施例12固载化脲酶的制备
将200mL质量百分浓度为25％的硝酸与5g椰壳活性炭进行混合，反应温度为75℃，反应时间为3h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL乙醇作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2.5mL的二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷混合，加入0.3mL去离子水，在78℃下反应12h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为7.2磷酸盐缓冲液将脲酶(EC3.5.1.5)配成2g/L的脲酶溶液，取100mL脲酶溶液与1g第三产物在50℃下10h，过滤，再用pH为7.2磷酸盐缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化脲酶。
实施例13固载化果胶酶的制备
将200mL质量百分浓度为15％的硝酸与5g杏核活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为5h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL乙醇作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与3mL2-氨乙基三甲氧基硅烷混合，加入0.4mL去离子水，在78℃下反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为5％的戊二醛溶液150mL在60℃条件下反应6h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为4.0磷酸盐与柠檬酸缓冲液将果胶酶(3.2.1.15)配成2g/L的果胶酶溶液，取100mL果胶酶溶液与1g第三产物在冰浴下搅拌36h，过滤，再用pH为4.0磷酸盐与柠檬酸缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化果胶酶。
实施例14固载化谷氨酰胺转氨酶的制备
将200mL质量百分浓度为20％的硝酸与5g核桃核活性炭进行混合，反应温度为80℃，反应时间为5h，得到氧化后的活性炭。用去离子水将氧化后的活性炭煮沸1h，过滤，然后用去离子水洗涤，重复三次，直至硝酸全部冲洗干净，置于105℃下干燥12h，得到第一产物。
150mL甲苯作为溶剂，将3g第一产物在氮气保护下与2mL的2-氨乙基三甲氧基硅烷混合，加入0.3mL去离子水，在110℃下反应13h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂，在80℃下干燥，得到第二产物。
取制得的第二产物与质量浓度为8％的戊二醛溶液150mL在58℃条件下反应7h，过滤，并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛，得到第三产物。
用pH为7.2磷酸盐缓冲液将谷氨酰胺转氨酶(EC2.3.2.13)配成2g/L的谷氨酰胺转氨酶溶液，取100mL谷氨酰胺转氨酶溶液与1g第三产物在冰浴下搅拌36h，过滤，再用pH为7.2磷酸盐缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。最后经真空冷冻干燥，得到第四产物，于4℃下保存。
取第一产物、第二产物、第三产物、第四产物采用实施例1相同的检测方法进行检测，得到的图谱与实施例1提供的图谱相似，结果表明第一产物为氧化后的活性炭、第二产物为硅烷化活性炭、第三产物为接枝戊二醛的活性炭、第四产物为固载化谷氨酰胺转氨酶。
实施例15生物酶固载量及活力测定试验
取实施例1至14制得的固载化酶，进行固载量及活力测定实验。固载量测定实验具体方法为：使用分光光度计法测定洗脱液的中酶的含量，酶的固载量可通过前后浓度变化计算出，计算公式为：酶的固载量＝酶初始浓度×酶体积－酶终浓度×洗脱液体积。活力测定实验具体方法为：测定反应前后反应底物的浓度差计算出酶活力：酶活力(U/mg)＝(C0-C)V/tm，其中，C0是反应前底物浓度，C是反应后底物浓度，V是底物体积，t是反应时间，m是生物酶质量。测定结果如表1所示。
表1生物酶固载量及活力测定结果
| 固载化酶种类 | 来源 | 活性炭种类 | 固载量(mg/g载体) | 活力保持(％) |
| 脲酶 | 实施例1 | 椰壳 | 110±15 | 40.5 |
| 脂肪酶 | 实施例2 | 椰壳 | 90±10 | 37.2 |
| 葡萄糖氧化酶 | 实施例3 | 桃核 | 110±15 | 55.2 |
| 木瓜蛋白酶 | 实施例4 | 桃核 | 115±15 | 35.5 |
| 过氧化氢酶 | 实施例5 | 杏核 | 100±15 | 38.3 |
| 果胶酶 | 实施例6 | 杏核 | 120±20 | 35.6 |
| 葡萄糖异构酶 | 实施例7 | 煤质 | 105±10 | 38.7 |
| α-淀粉酶 | 实施例8 | 煤质 | 110±15 | 43.3 |
| 辣根过氧化物酶 | 实施例9 | 核桃核 | 85±10 | 37.2 |
| 谷氨酰胺转氨酶 | 实施例10 | 核桃核 | 120±15 | 42.3 |
| 漆酶 | 实施例11 | 椰壳 | 120±10 | 40.3 |
| 脲酶 | 实施例12 | 椰壳 | 115±15 | 40.1 |
| 果胶酶 | 实施例13 | 杏核 | 90±10 | 36.8 |
| 谷氨酰胺转氨酶 | 实施例14 | 核桃核 | 85±10 | 41.2 |
由表1的试验数据可知，本发明实施例1至12提供的固载化酶的固载量在85～120mg/g之间，酶活力保持在35.5％～55.2％之间，相对于现有技术而言，在保持了较高的酶活力的同时，生物酶的固载量得到了大幅度提高，酶活力也有所提高。由此可见，本发明提供的固载化酶的制备方法可大大提高生物酶的固载量，酶活力也有所提高。
另外，实施例6中果胶酶固载量达120±20mg/g，实施例10中谷氨酰胺转氨酶的固载量达120±15mg/g，均高于其他实施例的生物酶固载量，而这两个实施例中使用的硅烷偶联剂均为二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，这一结果提示二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的偶联效率更高，可大大提高生物酶的固载量。本发明又通过进一步设置了实施例13、14，更换了硅烷偶联剂，从而使实施例13、14中生物酶的固载量大大低于120mg/g，研究证实了二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的偶联效率更高，即二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷为最佳硅烷偶联剂。
对比例1固载化过氧化氢酶的制备
将含水量为12％的皮胶原纤维100份于室温下浸泡在pH为1.5的去离子水中1h，然后加入35份硫酸铝，于20℃水浴中搅拌反应4h；在2h内用碳酸氢钠溶液将反应体系pH调节到4.0，并在40℃下继续反应5h，过滤载体，用去离子水洗去载体表面的杂质后浸没于去离子水中，再加入20份戊二醛，于15℃水浴中搅拌反应1h，过滤，并用去离子水洗去载体上残留的戊二醛；再将载体浸没于去离子水中，加入过氧化氢酶6份，于15℃水浴中搅拌反应lh，反应结束后，过滤并用去离子水洗去载体上残留的过氧化氢酶后,即得到负载金属离子铝的胶原纤维为载体的固定化过氧化氢酶。
经过检测后过氧化氢酶的固载量为20±5mg/g，活力为31.5％。而本发明实施例1至12提供的固载化酶的固载量在85～120mg/g之间，酶活力保持在35.5％～55.2％之间，由此可见，本发明提供的固载化酶的制备方法可大大提高生物酶的固载量，酶活力也有所提高。
对比例2固载化脲酶的制备
按照实施例提供的活性炭氧化的方法将椰壳活性炭氧化。取150mL甲苯作为溶剂，将3g氧化后的椰壳活性炭在氮气保护下与2mL的3-氨丙基三甲氧基硅烷混合，在110℃下搅拌反应24h，然后再用乙醇进行索氏提取24h，除去未反应的硅烷试剂。再用质量浓度5％戊二醛150mL在60℃反应6h，过滤并用乙醇洗涤除去未反应的戊二醛。最后，用pH为6.8的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲溶液将脲酶配成3g/L的酶溶液，取100mL的该酶溶液与1g接枝戊二醛的椰壳活性炭在冰浴下搅拌36h，将酶共价固载到活性炭上。过滤，再用缓冲液冲洗，除去物理吸附的酶。真空冷冻干燥得到固定化脲酶，将固定化脲酶保存在4℃下。取制得的固定化脲酶，进行固载量及活力测定实验，具体测定方法参加实施例1提供的方法。
试验结果显示脲酶的固载量为40±5mg/g，活力为36.5％。而本发明实施例1至12提供的固载化酶的固载量在85～120mg/g之间，酶活力保持在35.5％～55.2％之间，由此可见，本发明提供的固载化酶的制备方法可大大提高生物酶的固载量，酶活力也有所提高。由此可以推知，在硅烷化反应体系中加入少量的水，可提高硅烷化反应的效率，提高硅烷化活性炭的产率，进而提高生物酶的固载量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种硅烷化活性炭的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获得氧化后的活性炭；
在有机溶剂和水存在的条件下，所述氧化后的活性炭与硅烷偶联剂发生硅烷化反应，即得；
以g/mL计，所述氧化后的活性炭与所述水的用量比为1:(0.05～0.2)；
所述硅烷偶联剂为二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以g/mL计，所述氧化后的活性炭与所述硅烷偶联剂的用量比为1:(0.67～1)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷化反应为在63～120℃条件下进行硅烷化反应12～24h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲苯、二氯甲烷、二甲基亚砜或乙醇中的一种或两者以上的混合物。
5.一种固载化酶的制备方法，其特征在于，如权利要求1至4中任一项所述的制备方法制得的硅烷化活性炭与戊二醛发生交联反应，得到接枝戊二醛的活性炭，再与生物酶共价结合，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述交联反应具体为在50～60℃的条件下交联6～8h。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述生物酶为脲酶、葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、漆酶、脂肪酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、谷氨酰胺转氨酶或α-淀粉酶。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述共价结合具体为在0～50℃的条件下共价结合12～36h。
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