CN102033085A - 氰戊菊酯农药检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种氰戊菊酯农药检测方法，使用预先制得的DNA电化学生物传感器对待测物进行检测，所述DNA电化学生物传感器包括作为基体的碳纤维电极，在所述碳纤维电极表面由内至外依次层叠设置有过氧化聚吡咯膜、纳米金层以及DNA层；氰戊菊酯在DNA电化学生物传感器上发生电化学行为，通过测定氰戊菊酯的DPV峰电流值，进而确定氰戊菊酯的浓度。本发明使用DNA电化学生物传感器检测氰戊菊酯农药，利用的是电化学检测方式，可免去众多复杂的前处理工作，仪器简单，成本低，可以实现现场检测；而且使用的是一次性的碳纤维修饰电极，DNA电化学生物传感器制备步骤也简单易行，电极可事先修饰好，实现批量检测，节省时间。
Description
技术领域
本发明涉及农药检测技术领域，尤指一种氰戊菊酯农药检测方法。
背景技术
拟除虫菊酯类农药应用相当广泛，而氰戊菊酯又是其中很主要的一种。目前，氰戊菊酯类农药残留检测方法主要是色谱法和免疫法。
其中，色谱法的具体包括以下几个步骤：一、农药标准样品的配制；二、样品制备；三、样品提取与净化，其中，提取过程如下：称取捣碎样品25.0g，加石油醚：丙酮＝1：1的溶液100mL，置组织捣碎机中匀浆提取2min，真空抽滤，分别用25mL混合溶剂洗涤滤渣，过滤好的溶液用等体积饱和硫酸钠溶液加入分液漏斗萃取，剧烈振摇1min，分出有机相，浓缩至2mL上净化柱。净化过程如下：在1.5cm（ID）×20cm玻璃层析柱中，加入lcm高无水硫酸钠，再加入5g弗罗里硅土载体（5%蒸馏水脱活），上层再加入1cm高无水硫酸钠。加正己烷20 mL预洗层析柱，弃去淋洗液。从提取滤液中移取1mL人柱中，用100 mL（石油醚）：V(乙酸乙酯)-98：2淋洗，浓缩至10mL待测；四、色谱分析，色谱柱：HP-5，30m×0.25mm×0.25μm；气体流速：氮气；柱前压：15psi；尾吹气：60mL／min；温度：柱温：60℃保持2min，再以30℃／min升到至280℃，保持20min；进样口：250℃；检测器：300℃。色谱法存在的缺点主要有：前处理过程复杂，仪器成本高，操作复杂，对所需的试剂要求高等。
免疫法的具体步骤如下：1、半抗原的制备；2、制备蛋白质-半抗原偶联物；3、单克隆和多克隆抗体的制备；4、抗原的固定；5、酶联免疫法分析。免疫法存在的缺点主要有：抗原抗体的制备过程耗时长，成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种氰戊菊酯农药检测方法，以便能低成本、快速地检测出氰戊菊酯农药。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种氰戊菊酯农药检测方法，使用预先制得的DNA电化学生物传感器对待测物进行检测，所述DNA电化学生物传感器包括作为基体的碳纤维电极，在所述碳纤维电极表面由内至外依次层叠设置有过氧化聚吡咯膜、纳米金层以及DNA层；氰戊菊酯在DNA电化学生物传感器上发生电化学行为，通过测定氰戊菊酯的DPV峰电流值，进而根据预先确定的表征氰戊菊酯的DPV峰电流值与其浓度之间关系的线性回归方程得出氰戊菊酯的浓度。
进一步地，所述DNA电化学生物传感器的制备包括如下步骤：
制备碳纤维电极步骤：将碳纤维进行清洗、干燥后与电极引线铜丝用导电胶粘连，待导电胶干后，将碳纤维的一端置于酒精灯外焰灼烧以进一步清除其表面的氧化物；拉制玻璃毛细管的一端，形成内径较另一端要细的尖端，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入，并自拉细了的尖端露出1~2mm，再用粘胶将玻璃毛细管两端封住，待粘胶固化后可得到碳纤维电极；
吡咯的聚合与过氧化步骤：将碳纤维电极经清洗后再进行如下预处理：分别依次在30wt%HNO3溶液、丙酮溶液、乙醇溶液中浸泡10~20min、5~10min、5~10min，然后，将该碳纤维电极在0.5mol/L的H2SO4溶液中，-0.2V~1.2V范围内扫描10~20圈，扫描速率为100mV/s，待循环伏安曲线稳定后，将碳纤维电极洗涤干净、干燥后备用；将预处理好的碳纤维电极浸入到0.2mol/L吡咯溶液中，以50mV/s的扫描速度在-0.35V~0.85V范围内循环伏安扫描10次；将聚合有吡咯膜的碳纤维电极清洗后晾干，再置于pH=7.0的Tris-HCl缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极在1.5V下进行过氧化处理，得到Ppyox/CFE修饰电极；
电沉积纳米金步骤：以Ag/AgCl作为参比电极，铂片电极作为对电极，修饰有过氧化聚吡咯膜的碳纤维电极作为工作电极，置入0.5mmol/L的HAuCl4溶液，该溶液中还含有含有0.05mol/L的KCl，采用循环伏安法，在0.24V～-0.96V内以50mV/s的扫描速率，扫描15圈，得到nano-Au/Ppyox/CFE修饰电极；
固定DNA步骤：将制备好的nano-Au/Ppyox/CFE修饰电极冲洗后浸入到0.1mg/ml CTDNA溶液中，在1.5V（vs.Ag/AgCl）下富集30min，取出电极后冲洗除去电极上未稳定吸附的DNA，从而得到DNA/nano-Au/Ppyox /CFE修饰电极，亦即DNA电化学生物传感器。
进一步地，制备碳纤维电极步骤中，所述碳纤维是依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水超声清洗3~5 min。
进一步地，制备碳纤维电极步骤中所用引线铜丝直径0.2mm，长度10cm。
进一步地，制备碳纤维电极步骤中所用粘胶由环氧树脂与乙二胺体积比5：1混合均匀制得。
进一步地，吡咯的聚合与过氧化步骤中，预处理前的碳纤维电极以及聚合有吡咯膜的碳纤维电极均是用二次蒸馏水超声清洗3~5min。
进一步地，吡咯的聚合与过氧化步骤中，所述吡咯溶液的支持电解质为1.0mol/LKCl。
进一步地，固定DNA步骤中，nano-Au/Ppyox/CFE修饰电极在浸入到CTDNA溶液之前以及浸泡完成自该溶液中取出后均用二次蒸馏水进行冲洗。
进一步地，氰戊菊酯的DPV峰电流与其浓度之间的关系，在9.5×10-8～9.5×10-6mol/L浓度范围内呈线性关系，线性回归方程为： 
，相关系数为0.9924，检出下限为3.0×10-8 mol/L。
本发明的有益效果如下：本发明使用DNA电化学生物传感器检测氰戊菊酯农药，利用的是电化学检测方式，可免去众多复杂的前处理工作，仪器简单，成本低，可以实现现场检测；而且使用的是一次性的碳纤维修饰电极，DNA电化学生物传感器制备步骤也简单易行，电极可事先修饰好，实现批量检测，节省时间。
附图说明
图1是本发明氰戊菊酯农药检测方法的检测曲线图。
具体实施方式
本发明首先提供一种氰戊菊酯农药检测方法，其具体是应用DNA电化学生物传感器来实现的。
在具体应用时，氰戊菊酯在DNA电化学生物传感器上会发生电化学行为，如图1所示，氰戊菊酯的DPV峰电流与其浓度之间的关系，在9.5×10-8～9.5×10-6 mol/L浓度范围内呈线性关系，线性回归方程为：
，根据测得的氰戊菊酯的DPV峰电流，即可进而确定氰戊菊酯的浓度。需要说明的是，以上的线性回归方程是采用所制得的DNA电化学生物传感器通过预先实验测定多组电流与浓度数据后再归纳得出的。线性回归方程受到DNA电化学生物传感器制备过程中的诸多因素的影响，例如：采用的各种试剂的浓度、处理时间、采用的电压等参数，制备过程采用的每一组参数均可对应测定出一个线性回归方程，因此线性回归方程并不是唯一确定的，以上给出的线性回归方程是根据下述的DNA电化学生物传感器制备步骤制得的DNA电化学生物传感器来预先测定归纳得出的，经后期实际应用过程中的检测，DPV峰电流与浓度的相关性系数可达0.9924，检出下限为3.0×10-8 mol/L。
本发明所使用的DNA电化学生物传感器的制备步骤如下：
A、制备碳纤维电极步骤
将碳纤维依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水超声清洗3~5 min，所述碳纤维的尺寸通常为直径7μm，长度大约15 mm；待干燥后将清洗过的碳纤维与电极引线铜丝用导电胶粘连，所述引线铜丝一般采用直径0.2mm，长度约10cm的铜丝制得，待导电胶干后，将碳纤维的一端置于酒精灯外焰1秒钟，碳纤维在高温灼烧下表面的氧化物得到进一步的清除；拉制玻璃毛细管的一端，使得尖端内径约为20μm，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入，并自拉细了的尖端露出约1~2mm，再用粘胶将玻璃毛细管两端封住，所述粘胶可由环氧树脂与乙二胺体积比5：1混合均匀制得，可以理解地，其他类型的粘胶同样也可以达到相同的功效，待粘胶固化后可得到碳纤维电极。
B、吡咯的聚合与过氧化步骤
碳纤维电极上聚合聚吡咯之前，先用二次蒸馏水超声清洗3~5 min，然后分别依次在30 wt%HNO3溶液中浸泡10~20 min，在丙酮、乙醇溶液中各浸泡5~10 min进行预处理；为提高电极在溶液中的电化学活性，将该碳纤维电极在0.5mol/L的H2SO4溶液中，-0.2 V~1.2 V范围内扫描10~20圈，扫描速率为100 mV/s。待循环伏安曲线稳定后，电极用二次蒸馏水洗涤干净，于红外灯下干燥后备用；将预处理好的碳纤维电极浸入到0.2mol/L吡咯溶液中，所述吡咯溶液的支持电解质为1.0mol/LKCl，以50mV/s的扫描速度在-0.35V～0.85V范围内循环伏安扫描10次；将聚合有吡咯膜的碳纤维电极用二次蒸馏水清洗后晾干，再置于pH=7.0的Tris-HCl缓冲溶液中于1.5V（vs.Ag/AgCl）下过氧化处理300s，得到Ppyox/CFE修饰电极。
C、电沉积纳米金步骤
电沉积纳米金的过程：使用标准的三电极系统，以Ag/AgCl作为参比电极，铂片电极作为对电极，修饰有过氧化聚吡咯膜的碳纤维电极作为工作电极。在0.5mmol/L的HAuCl4（含0.05mol/L的KCl）溶液中，采用循环伏安法，在0.24V～-0.96V内以50mV/s的扫描速率，扫描15圈，得到nano-Au/Ppyox/CFE修饰电极。
D、固定DNA步骤
将制备好的nano-Au/Ppyox/CFE修饰电极用二次蒸馏水冲洗后浸入到0.1mg/ml CTDNA溶液中，在1.5V（vs.Ag/AgCl）下富集30min，取出电极后用二次蒸馏水冲洗，除去电极上未稳定吸附的DNA，从而得到DNA/nano-Au/Ppyox /CFE修饰电极，即为修饰好的碳纤维电极，亦即DNA电化学生物传感器。
当然，可以理解地，上述DNA电化学生物传感器采用其他现有的常规制备技术来制备也是可行的，只需确保所制得的DNA电化学生物传感器具备以下的特征：其包括作为基体的碳纤维电极，在所述碳纤维电极表面由内至外依次层叠设置有过氧化聚吡咯膜、纳米金层以及DNA层。
由于本发明采用电化学检测方式，可免去很多复杂的前处理工作，仪器简单，成本低，可以实现现场检测，另外使用的是一次性的碳纤维修饰电极，电极可事先修饰好，实现批量检测，节省时间。
Claims (9)
1.一种氰戊菊酯农药检测方法，其特征在于：使用预先制得的DNA电化学生物传感器对待测物进行检测，所述DNA电化学生物传感器包括作为基体的碳纤维电极，在所述碳纤维电极表面由内至外依次层叠设置有过氧化聚吡咯膜、纳米金层以及DNA层；氰戊菊酯在DNA电化学生物传感器上发生电化学行为，通过测定氰戊菊酯的DPV峰电流值，进而根据预先确定的表征氰戊菊酯的DPV峰电流值与其浓度之间关系的线性回归方程得出氰戊菊酯的浓度。
2.如要求1所述的氰戊菊酯农药检测方法，其特征在于，所述DNA电化学生物传感器的制备包括如下步骤：
制备碳纤维电极步骤：将碳纤维进行清洗、干燥后与电极引线铜丝用导电胶粘连，待导电胶干后，将碳纤维的一端置于酒精灯外焰灼烧以进一步清除其表面的氧化物；拉制玻璃毛细管的一端，形成内径较另一端要细的尖端，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入，并自拉细了的尖端露出1~2mm，再用粘胶将玻璃毛细管两端封住，待粘胶固化后可得到碳纤维电极；
吡咯的聚合与过氧化步骤：将碳纤维电极经清洗后再进行如下预处理：分别依次在30wt%HNO3溶液、丙酮溶液、乙醇溶液中浸泡10~20min、5~10min、5~10min，然后，将该碳纤维电极在0.5mol/L的H2SO4溶液中，-0.2V~1.2V范围内扫描10~20圈，扫描速率为100mV/s，待循环伏安曲线稳定后，将碳纤维电极洗涤干净、干燥后备用；将预处理好的碳纤维电极浸入到0.2mol/L吡咯溶液中，以50mV/s的扫描速度在-0.35V~0.85V范围内循环伏安扫描10次；将聚合有吡咯膜的碳纤维电极清洗后晾干，再置于pH=7.0的Tris-HCl缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极在1.5V下进行过氧化处理，得到Ppyox/CFE修饰电极；
电沉积纳米金步骤：以Ag/AgCl作为参比电极，铂片电极作为对电极，修饰有过氧化聚吡咯膜的碳纤维电极作为工作电极，置入0.5mmol/L的HAuCl4溶液，该溶液中还含有含有0.05mol/L的KCl，采用循环伏安法，在0.24V～-0.96V内以50mV/s的扫描速率，扫描15圈，得到nano-Au/Ppyox/CFE修饰电极；
固定DNA步骤：将制备好的nano-Au/Ppyox/CFE修饰电极冲洗后浸入到0.1mg/ml CTDNA溶液中，在1.5V（vs.Ag/AgCl）下富集30min，取出电极后冲洗除去电极上未稳定吸附的DNA，从而得到DNA/nano-Au/Ppyox /CFE修饰电极，亦即DNA电化学生物传感器。
3.如权利要求2所述的氰戊菊酯农药检测方法，其特征在于：制备碳纤维电极步骤中，所述碳纤维是依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水超声清洗3~5 min。
4.如权利要求3所述的氰戊菊酯农药检测方法，其特征在于：制备碳纤维电极步骤中所用引线铜丝直径0.2mm，长度10cm。
5.如权利要求2所述的氰戊菊酯农药检测方法，其特征在于：制备碳纤维电极步骤中所用粘胶由环氧树脂与乙二胺体积比5：1混合均匀制得。
6.如权利要求2所述的氰戊菊酯农药检测方法，其特征在于：吡咯的聚合与过氧化步骤中，预处理前的碳纤维电极以及聚合有吡咯膜的碳纤维电极均是用二次蒸馏水超声清洗3~5min。
7.如权利要求2所述的氰戊菊酯农药检测方法，其特征在于：吡咯的聚合与过氧化步骤中，所述吡咯溶液的支持电解质为1.0mol/LKCl。
8.如权利要求2所述的氰戊菊酯农药检测方法，其特征在于：固定DNA步骤中，nano-Au/Ppyox/CFE修饰电极在浸入到CTDNA溶液之前以及浸泡完成自该溶液中取出后均用二次蒸馏水进行冲洗。
9.如权利要求1~8任一项所述的氰戊菊酯农药检测方法，其特征在于：氰戊菊酯的DPV峰电流与其浓度之间的关系，在9.5×10-8～9.5×10-6mol/L浓度范围内呈线性关系，线性回归方程为： 
，检出下限为3.0×10-8 mol/L。
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