CN107515239B - 一种再生碳纤维超微电极的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种再生碳纤维超微电极的方法，是将参比电极和毒化电极一起置于去离子水中，通过恒电位电流‑时间法，对参比电极和毒化电极进行活化操作；其中去离子水中不添加任何其他化学物质。本发明的上述方法活化效果好，经处理后的碳纤维超微电极，电化学响应较毒化后电极明显增加，再生电极电化学性能稳定。

Description

一种再生碳纤维超微电极的方法

技术领域

本发明涉及生物电化学分析技术领域，具体涉及一种再生碳纤维超微电极的方法。

背景技术

超微电极具有高时间、空间分辨率及高灵敏度等优良特性，近年来在多个领域得到了广泛而深入的研究，已成为电化学研究中极具发展前景的一个重要分支。由于它能够在生物体系中检测特定微区内的快速而微小的化学变化，超微电极电化学检测被广泛应用在生物微环境中探索细胞化学，而且特别适宜于活体分析。然而，在生物电化学分析体系中，超微电极表面易被电化学反应中产生的自由基或电聚合产物污染而钝化，电极污染物主要是一些有机生物分子如五羟色胺，组胺，氨基酸，NADH，苯胺等以及其氧化、代谢产物，它们易在电极表面吸附形成绝缘膜，导致电极电信号随时间急剧衰减，灵敏度和选择性严重下降。

为了提高电极的检测灵敏度，大量研究工作采用一些化学、物理方法对电极表面进行活化处理。

化学方法一般通过构建化学修饰电极来改变电极表面结构，进而在一定程度上改变反应电位和反应速率，使电极不仅具有传递电子的功能，还能对电化学反应进行促进与选择。程寒等研制了单壁碳纳米管修饰的碳纤维微电极(单壁碳纳米管修饰电极的抗污染性能研究及其用于五羟色胺检测，分析化学，vol.41：540-545，2013)，采用安培法对五羟色胺进行检测，修饰电极对五羟色胺造成的电极污染有显著的减轻。然而对电极进行修饰处理过程较复杂，还会污染环境，且修饰电极往往存在修饰物在电极表面附着不够牢固、膜的厚度难以控制、电极寿命较短等缺点。

也有研究把电极先在二次蒸馏水中浸泡10min，再以0.05mol/L的磷酸生理缓冲溶液pH6.0作底液，先将电位调至2.5V恒定位活化30s，再将电位调至-1.0V恒电位活化30s。然后在-0.6～0.9V范围内做循环伏安扫描(扫速为100mV/s)直至循环曲线平衡，电极经重蒸馏水冲洗后，置于重蒸馏水中备用。碳纤维电极经电化学处理后，灵敏度提高、分辨率改善。经电化学活化处理后的碳纤维电极用于活体测定多巴胺时，可逆性发生了很大的变化。

物理方法包括采取机械打磨抛光的方法从块状电极表面除去表面附着的污染物，该技术不适合在超微电极表面实施。另外还有激光烧蚀、火焰刻蚀、酸洗等传统方法，张丽瑶等报道了通过火焰刻蚀法再生碳纤维电极(再生碳纤维电极的新方法，分析测试学报，vol.18：457-459，2002)，此法再生电极的各种性能与原电极相当，应用不方便之处在于苛刻的处理条件易改变电极微结构和表面化学作用，导致电极响应重现性和稳定性变差。

发明内容

针对碳纤维超微电极活化存在的上述技术问题，本发明提供了一种既简单方便，又效果良好的活化方法，再生电极电化学性能稳定，具有良好的电化学响应。

本发明提供的再生碳纤维超微电极的方法，是将参比电极和毒化电极一起置入去离子水中，通过恒电位电流-时间法，对参比电极和毒化电极进行活化操作；其中去离子水中不添加任何其他化学物质。

所述去离子水，包括采用一般方法例如离子交换树脂去除水中的阴离子和阳离子的水，还包括纯度级别更高的蒸馏水、纯水、高纯水、超纯水等。只要水符合国际标准化组织ISO/TC 147规定的“去离子”定义“去离子水完全或不完全地去除离子物质”即可。

本发明上述技术方案，其中一个创新点在于使用去离子水对电极进行活化。我们研究发现，去离子水中离子种类单一，键合在碳纤维表面的基团明确，可以排除溶液中其他离子的干扰，电极活化机理清晰。另外，使用超纯水作为活化底液，通过氧化刻蚀除去电极表面的绝缘层，再于碳纤维超微电极洁净表面键合羟基修饰层，活化电极的生物相容性良好，更加适用于活体检测，应用范围更广。对于其他电沉积底液，我们也进行过比较试验，采用Tris-HCl缓冲溶液作为电沉积底液对毒化电极进行活化处理，结果表明相同实验条件下Tris-HCl缓冲溶液由于存在其他阴离子的干扰，活化效果较去离子水活化电极差，且基线漂移较严重。

恒电位电流-时间法是通过控制被测电极的电位，选定一段时间内保持电位不变，检测这段时间内的电流值，时间为横坐标，电流为纵坐标绘制电流-时间曲线。初始电位及活化时间的优化即改变电位的大小及电镀时间两个参数，检测不同电位及活化时间下毒化电极的活化程度来确定最佳初始电位及活化时间。具体可参见具体实施方式部分的2.2节，描述了初始电位和活化时间的优化。

优选地，上述再生碳纤维超微电极的方法中，所述恒电位电流-时间法的活化条件为：初始电位1.5V，活化时间600s。

优选地，上述再生碳纤维超微电极的方法中，所述毒化电极的毒化物包括5-HT、NADH和水杨酸中的一种或几种。

优选地，上述再生碳纤维超微电极的方法中，在对毒化后的电极进行活化后，再取出电极用超纯水冲洗，晾干。

优选地，上述再生碳纤维超微电极的方法中，所述参比电极为Ag/AgCl(银/氯化银电极)。

本发明还提供了以上任一所述的再生碳纤维超微电极的方法制得的再生碳纤维超微电极在定量测定多巴胺中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的碳纤维超微电极活化方法简单方便，而且活化效果良好，再生电极电化学性能稳定，具有良好的电化学响应。

附图说明

图1：碳纤维超微电极在1.0×10^-4mol/L 5-HT溶液中循环伏安扫描图(A)以及电极毒化前后在1.0×10^-5mol/L DA溶液中差分脉冲图(B)。

图2：碳纤维超微电极毒化前后在1.0×10^-5mol/L DA溶液中的电化学行为。活化初始电位A.1.0V，B.1.5V，C.2.0V，a.原始电极b.毒化电极c.再生电极。

图3A：碳纤维超微电极经不同活化时间在1.0×10^-5mol/L DA溶液中电化学行为之差分脉冲图。

图3B：碳纤维超微电极经不同活化时间在1.0×10^-5mol/L DA溶液中电化学行为之折线图。

图4：再生电极在1.0×10^-5mol/L DA溶液中的差分脉冲伏安叠加图。

图5：再生电极在1.0×10^-5mol/L DA溶液中的循环伏安图(A)及峰电流与扫速的关系(B)。

图6：再生电极在不同浓度DA溶液中的DPV曲线(A)及氧化峰电流与DA浓度的关系曲线(B)。

图7：碳纤维超微电极毒化前后在1.0×10^-5mol/L DA溶液中的差分脉冲对比图，A为NADH毒化的电极，B水杨酸毒化的电极；a.原始电极b.毒化电极c.再生电极。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1.1仪器与试剂

XD-RFL实验室倒置显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)；pHS-3C型pH计(上海仪器科学仪器股份有限公司)；CHI660D化学工作站(上海辰华仪器公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器；本实验采用双电极系统：碳纤维超微电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极。

碳纤维(直径6μm，吉林市神舟碳纤维有限责任公司)，无水乙醇(分析纯，天津医药公司)，多巴胺(DA,Sigma)，去甲肾上腺素(NE,Sigma)，抗坏血酸(AA,分析纯,国药集团化学试剂有限公司)，DA用无水乙醇作为溶剂配成1.0×10^-2mol/L的母液备用。五羟色胺(5-HT,Sigma)，用0.1mol/L的HClO₄配置成1.0×10^-3mol/L的母液，置于4℃的冰箱冷藏室中保存，使用时用Tris-HCl缓冲溶液稀释到所需的浓度.碳粉导电胶(自制)，AB胶(广东爱必达胶黏剂有限公司)，实验用水为二次去离子水。

1.2碳纤维超微电极的制作

在酒精灯火焰上拉制玻璃毛细管(内径1mm)，使其尖端内径约20μm，碳纤维(直径6μm，长约15mm)和铜丝(直径0.2mm，长约10cm)用碳粉导电胶粘连，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入至露出玻璃毛细管尖端外约2mm，用AB胶将玻璃毛细管末端封住，粘胶固化后固定铜丝，再将玻璃毛细管尖端置于火焰外焰约0.5s，玻璃迅速熔封，露出的碳纤维在酒精灯外焰上小心烧蚀，在倒置显微镜下测量电极长度，至露出的碳纤维长度100～200μm即为碳纤维超微电极(CFUME)。

1.3碳纤维超微电极的毒化

首先，记录洁净电极在1.0×10^-5mol/L多巴胺(DA)中的差分脉冲图。然后，将该电极置于1.0×10^-4mol/L五羟色胺(5-HT)溶液中扫描40圈，设置扫描速度为0.1V/s，扫描范围从-0.2V～0.6V。放入1.0×10^-5mol/L DA的小烧杯中记录毒化后的差分脉冲图，对比毒化前后的差分脉冲图，毒化后在DA溶液中氧化峰几乎消失，得到毒化后的碳纤维超微电极。

1.4碳纤维超微电极的再生

取适量去离子水，将已毒化的碳纤维超微电极和Ag/AgCl参比电极置于去离子水中，采用恒电位电流-时间法，在一定电位下进行下活化，通过氧化刻蚀除去电极表面的绝缘层，同时在碳纤维超微电极洁净表面键合羟基修饰层。取出电极用超纯水冲洗，晾干，即得到再生碳纤维超微电极。

2.结果与讨论

2.1碳纤维超微电极的毒化及再生

将洁净碳纤维超微电极放入1×10^-4mol/L 5-HT溶液中用循环伏安扫描40次，扫描速度为0.1V/s，扫描范围-0.2V～0.60V，结果如图1A所示。从图1A中可以看出电流随着扫描次数的增加而递减，表明五羟色胺对碳纤维超微电极表面具有明显的毒化作用。将毒化前后的电极分别在1×10^-5mol/L DA溶液中进行差分脉冲扫描，见图1B，毒化后的碳纤维超微电极与洁净电极相比，响应电流显著降低，几乎看不到峰电流。表明5-HT电极经五羟色胺毒化后，其表面的反应活性位点几乎全部被5-HT的氧化产物覆盖。

2.2电极再生条件优化

2.2.1最佳活化电压

采用电化学法将5-HT毒化的碳纤维超微电极在纯水中进行活化，通过改变时间-电流曲线的初始电位对活化程度进行优化。在外加电压的作用下，5-HT的氧化绝缘膜因氧化刻蚀脱落，重新暴露出碳纤维表面的电活性位点，水中游离的氢氧根进而键合至碳纤维表面，提高了电极的亲水性，而神经递质DA是水溶性物质，故活化后的电极在DA溶液中的电化学响应明显增加。设置初始电位由小到大(1.0，1.5，2.0V)，其他实验参数不变，进行恒电位电流-时间曲线扫描。将活化后的电极分别在1.0×10^-5mol/L DA中进行差分脉冲扫描，记录其电化学响应。图2是不同初始电位下活化后电极的差分脉冲对比图。对比图2A-2C三图，发现当初始电位为1.5V时，再生电极的氧化峰电流较原始电极增幅最大，较原始电极的电化学性能更优。说明5-HT毒化的碳纤维超微电极在纯水中的最佳活化电压为1.5V。

2.2.2最佳活化时间

使用恒电位时间电流曲线法在纯水中对被5-HT毒化的碳纤维超微电极进行活化，保持初始电位1.5V不变，通过改变活化时间来探究其最佳活化条件。图3A为在去离子水中活化60s，300s，600s，900s以及1200s后在DA溶液中的DPV曲线与原始电极的叠加对比图。读取每个活化时间的氧化峰电流值制得图3B，从图3B中可知，从60s开始，随着活化时间的增加，再生电极在1×10^-5mol/L DA溶液中的氧化峰电流也随之增加，至600s后电流增幅趋于平缓。故选取600s为最佳活化时间。

2.3考查再生电极的稳定性

取最佳条件下活化的碳纤维超微电极在1.0×10^-5mol/L DA溶液中进行差分脉冲扫描，每隔1小时测一次，连续扫5次，扫描结果如图4所示。从图4看出，5次扫描结果氧化峰电流基本重合，计算5次测量结果的RSD为0.89％，表明再生碳纤维超微电极具有良好的稳定性。

2.4比较再生电极与原始电极在DA溶液中的检测限

采用差分脉冲法来检测原始电极与再生后电极的检测限，实验测得原始电极和再生电极的检测限分别为4.0×10^-8mol/L和3.0×10^-8mol/L(S/N＝3)，实验结果可知，经纯水处理再生后的碳纤维超微电极具有比原始电极更低的检测限。2.5考查再生电极检测DA溶液的氧化峰电流与扫速的关系

图5A为再生电极在1.0×10^-5mol/L DA溶液中不同扫描速度(10、20、50、100、200、500、1000mV/s)下的循环伏安图。以扫描速度为横坐标，氧化峰电流为纵坐标绘制工作曲线如图5B所示，氧化峰电流随扫速的增加而逐渐向正电位方向移动，氧化峰电流与扫速线性关系良好，线性回归方程为I(A)＝8.0×10^-9V(V/s)+9.0×10^-10，相关系数R²＝0.9916，说明DA在再生碳纤维超微电极表面的氧化过程受吸附控制。

2.6工作曲线

如图6A所示，在20mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液中，用差分脉冲方法测出去离子水再生电极在DA溶液中的氧化峰电流与DA溶液的浓度(自下而上浓度依次为1.0×10^{- 7}mol/L、5.0×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、5.0×10^-6mol/L、1.0×10^-5mol/L、5.0×10^-5mol/L、1.0×10^-4mol/L)的线性关系。如图6B所示，DA溶液氧化峰电流与其浓度在1.0×10^-7mol/L～1.0×10^-4mol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为I(A)＝17215c(mol/L)-5.0×10^-6，线性相关系数R²为0.9914。

2.7加样回收实验

在准确配置的初始浓度分别为(100、10、1μM)的DA溶液10mL中分别加入浓度为10mmol/L的DA溶液100、10、1μL，并计算该混合溶液的真实浓度c_真，用再生后的碳纤维超微电极检测三种DA混合溶液的峰电流，每个浓度平行测定三次，通过标准曲线I(A)＝17215c(mol/L)-5.0×10^-6计算出待测溶液浓度，通过公式计算加样回收率，R(％)＝c_测/c_真×100％，结果如表1所示。由表1可见，回收率分别为97.12％，105.7％，95.15％，平均回收率为99.32％，说明再生后的碳纤维超微电极测定DA溶液，结果可靠。

表1样品加标回收率试验

2.8共存物质的影响

考查了生物体内常见的无机离子及有机物对再生电极测定DA的影响，结果表明：1×10^-4mol/L K⁺，Na⁺，Cu²⁺，Ca²⁺，Cl^-，AA及20mg/L葡萄糖、核糖核酸、L-半胱氨酸对1×10^{- 5}mol/L DA测定的影响较小，相对误差均控制在±5％以内，说明该方法具有良好的选择性。

3结论

(1)制备碳纤维超微电极，在1.0×10^-4mol/L 5-HT溶液中采用循环伏安法扫描40圈，使碳纤维超微电极表面形成一层绝缘膜，制得毒化电极，之后在去离子水中通过恒电位电流-时间法对毒化后的电极进行活化，优化了电化学活化条件，最佳初始电位为1.5V，活化时间为600s，再生电极的电化学性能良好。

(2)再生碳纤维超微电极稳定性良好，在DA中的检测限提高。

(3)再生电极在DA溶液中氧化峰电流与扫速线性关系良好，回归方程为I(A)＝8.0×10^-9V(V/s)+9.0×10^-10，线性相关系数R²＝0.9916，说明DA溶液在再生碳纤维超微电极上的氧化过程受吸附控制。

(4)再生电极在1×10^-7～1×10^-4mol/L DA溶液中，溶液的浓度与氧化峰电流线性关系良好，回归方程为I(A)＝17215C(mol/L)+5.0×10^-6，线性相关系数R²为0.9914。该再生电极在检测DA溶液的抗干扰能力良好，有望用于活体中DA浓度的测定。

(5)实验结果还表明该再生碳纤维超微电极的方法对NADH和水杨酸钝化的电极同样具有良好的再生效果。

采用相同的实验方案对NADH及水杨酸毒化的电极进行活化处理，优化实验条件，得到经NADH与水杨酸毒化后电极在去离子水中最佳活化条件为初始电压1.5V，活化时间600s。

图7为碳纤维超微电极毒化前后在1.0×10^-5mol/L DA溶液中的差分脉冲对比图，图7A为NADH毒化的电极，图7B为水杨酸毒化的电极，实验在最佳活化条件下进行，由图可知，水杨酸及NADH对电极均有一定程度的毒化，经去离子水活化处理后的碳纤维超微电极在DA溶液中的电化学响应较毒化后电极明显增加，再生电极性能较原始电极性能更佳，说明该再生电极的方法对水杨酸及NADH毒化后的电极同样具有良好的活化作用。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (4)

1.一种再生碳纤维超微电极的方法，其特征在于，记录洁净碳纤维超微电极在浓度为1×10^-5mol/L多巴胺溶液中的差分脉冲响应；然后将上述电极置于1×10^-4mol/L毒化物溶液中循环伏安扫描40圈，设置参数扫描速度为0.1V/s，扫描范围从-0.2V～0.60V；放入含1×10^-5mol/L多巴胺溶液中进行差分脉冲扫描，记录毒化后差分脉冲响应，对比毒化前后的差分脉冲图，毒化后在多巴胺溶液中的氧化峰几乎消失，得到毒化后的碳纤维超微电极；取适量去离子水，将毒化后的碳纤维超微电极和Ag/AgCl参比电极置于去离子水中，采用恒电位电流-时间法，在一定电位下进行活化；取出活化后的电极用超纯水冲洗，晾干，即得再生碳纤维超微电极；其中去离子水中不添加任何其他化学物质。

2.根据权利要求1所述的再生碳纤维超微电极的方法，其特征在于，所述恒电位电流-时间法的活化条件为：初始电位1.5V，活化时间600s。

3.根据权利要求1所述的再生碳纤维超微电极的方法，其特征在于，所述毒化物包括5-HT、NADH和水杨酸中的一种。

4.权利要求1～3任一所述的再生碳纤维超微电极的方法制得的再生碳纤维超微电极在定量测定多巴胺中的应用。