CN104698058B - 一种定量测定五羟色胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量测定五羟色胺的方法，是采用差分脉冲伏安法，洁净和火焰灼烧活化的碳纤维超微电极为工作电极，原洁净电极在基准溶液中的峰电流为基准电流，活化电极峰电流除以原洁净电极峰电流为电流校正因子，各梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以校正因子为校正后氧化峰电流。或以在基准溶液中差分脉冲响应电流差异20％以内的不同碳纤维超微电极作为工作电极，各电极峰电流与第一根电极峰电流的比值为电流校正因子，梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以校正因子为校正后氧化峰电流。以五羟色胺浓度为横坐标，校正后氧化峰电流为纵坐标绘制标准曲线，电流校正后氧化峰电流与浓度线性关系良好，实现了五羟色胺的定量测定。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学、电分析化学、生物电分析化学技术领域，具体涉及一种定量测定神经递质五羟色胺的电化学检测方法。
背景技术
五羟色胺(5-HT)是大脑内主要神经递质之一，在脑神经细胞内合成，可参与多种生理功能及病理状态的调节，如体温，睡眠、饮食、精神情感性疾病等。五羟色胺是一种电活性物质，可以采用电化学方法进行检测，但其氧化过程中产生的氧化活性产物易吸附在各种不同材料的电极表面形成绝缘膜，包括贵金属电极，玻碳电极、碳纤维电极以及鹏掺杂金刚石电极等，导致电极表面被污染而影响检测灵敏度与稳定性。
碳纤维超微电极具有高时间、空间分辨率及高灵敏度等优良特性，近年来在多个领域得到了广泛而深入的研究，已成为电化学研究中极具发展前景的一个重要分支。由于它能够在生物体系中检测特定微区内的快速而微小的化学变化，超微电极电化学检测被广泛应用在生物微环境中探索细胞化学，而且特别适宜于活体分析。然而，在生物电化学分析体系中，碳纤维超微电极表面易被电化学反应中产生的自由基或电聚合产物污染而钝化，电极污染物主要是一些有机生物分子如五羟色胺，组胺，氨基酸，NADH，苯胺等以及其氧化、代谢产物，它们易在电极表面吸附形成绝缘膜，导致电极电信号随时间延长急剧衰减。目前，碳纤维超微电极抗污染的方法主要通过快速循环伏安法以及对电极进行修饰处理。Jackson等报道了通过快速循环伏安法测定五羟色胺(Fast-Scan cyclic voltammetryof5-Hydroxytryptamine，Anal Chem，vol.67：1115-1120，1995)，该法能在一定程度上减轻电极污染，污染问题仍不能忽略，且同时会降低检测灵敏度和选择性。程寒等研制了单壁碳纳米管修饰的碳纤维微电极(单壁碳纳米管修饰电极的抗污染性能研究及其用于五羟色胺检测，分析化学，vol.41：540-545，2013)，采用安培法对五羟色胺进行检测，修饰电极对五羟色胺造成的电极污染有显著的减轻。Hashemi等采用电镀方法将阳离子交换聚合物Nafion修饰于碳纤维微电极表面(Voltammetric detection of 5-hydroxytryptaminerelease in the rat brain，Anal Chem，vol.81：9462-9471，2009)，用于老鼠大脑五羟色胺释放动力学监测；朱明芳等制备了石墨烯-四磺酸基酞菁铁修饰的碳纤维微电极(神经递质分子电化学测定的新方法研究，华南理工大学博士学位论文，43-56，2012)，并用于小鼠海马区中多巴胺和五羟色胺的同时测定，然而对电极进行修饰处理过程较复杂，还会污染环境，且修饰电极往往存在修饰物在电极表面附着不够牢固、膜的厚度难以控制、电极寿命较短等缺点。
发明内容
针对现有技术中五羟色胺测定方法的上述不足，本发明提供了一种新的定量检测五羟色胺的方法。
本发明提供的定量测定五羟色胺的方法，过程包括：
(1)碳纤维超微电极经清洗后用循环伏安法活化，再用超纯水清洗，得到活化后洁净的碳纤维超微电极，记为洁净电极；
(2)采用双电极系统，所有电位均以Ag/AgCl作为参比电极，洁净电极和经火焰灼烧活化的该洁净电极为工作电极，铁氰化钾水溶液或多巴胺水溶液为基准溶液，梯度浓度的五羟色胺溶液作为标准溶液，采用差分脉冲伏安法进行检测；
A、首先取一根洁净电极在基准溶液中扫描，记录峰电流作为基准电流；洁净电极用超纯水清洗晾干，再在任一浓度五羟色胺标准样品中扫描，记录氧化峰电流；
B、测试完该浓度五羟色胺的洁净电极用超纯水清洗晾干，火焰灼烧进行活化后再在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在另一浓度五羟色胺标准样品中扫描，记录氧化峰电流；
重复B步骤至完成全部五羟色胺标准样品的测试；
(3)以各次经火焰灼烧活化后的洁净电极在基准溶液中的峰电流与基准电流的比值为电流校正因子，各梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以该浓度五羟色胺检测时对应的校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流；
以五羟色胺浓度和校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流绘制成标准曲线，进而得到相应的线性回归方程；
(4)取待测样品去除其中的细胞和蛋白后，步骤(2)的电极用超纯水清洗晾干，火焰灼烧进行活化后在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在待测样品中扫描，记录氧化峰电流；将峰电流值带入线性回归方程中，得到待测样品中五羟色胺的浓度。
实际检测工作中，待测样品可以为血液、尿液、组织细胞液等，为使检测结果更准确，最好去除其中的蛋白和细胞等成分。
优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，步骤(2)的差分脉冲伏安法中，初始电位0.2V、终止电位0.7V、电位增量0.004V、振幅0.05V、脉冲宽度0.1s、采样宽度0.0167s、脉冲周期0.2s，支持电解质为20mmol/L、pH值7.2的Tris-HCl缓冲溶液。
优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，碳纤维超微电极的制备方法为：将洁净的玻璃毛细管一端拉制成内径18～22μm的尖端；碳纤维依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水超声清洗后在空气中晾干；将碳纤维和铜丝用碳粉导电胶粘连，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入至露出玻璃毛细管尖端外，毛细管另一端用环氧树脂密封，环氧树脂固化后固定铜丝；将带有碳纤维的毛细管尖端置于750～850℃的火焰下灼烧至毛细管尖端熔融将碳纤维密封于其中；再将经熔融密封的碳纤维靠向340～360℃的火焰至黑色背景下观察到碳纤维尖端微红时立即拿开，获得碳纤维超微电极。
优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，铁氰化钾水溶液中铁氰化钾的摩尔浓度为1.0×10-3mol/L，多巴胺水溶液中多巴胺的摩尔浓度为1.0×10-4mol/L。当电极尖端碳纤维长度约为100μm时，在浓度为1.0×10-3mol/L铁氰化钾和1.0×10-4mol/L多巴胺溶液中氧化峰电流均较大，数量级为1×10-8A，电流重现性好，适合作为基准溶液。
优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，梯度浓度五羟色胺溶液的五羟色胺浓度在1.0×10-6～2.0×10-4mol/L范围内。实验表明，五羟色胺的浓度在该范围内时，其氧化峰电流随浓度增大而增大，线性关系最稳定，因此能确保获得的检测结果最准确。
优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，五羟色胺溶液由1×10-2mol/L五羟色胺母液经pH值7.2的Tris-HCl稀释配制。
浓度为1×10-2mol/L五羟色胺母液由0.1mol/L HClO4水溶液溶解五羟色胺粉末配制而成，然后置于4℃冰箱内保存。样品在每次实验前由母液用20mmol/L、pH值7.2的Tris-HCl缓冲溶液稀释至所需的浓度，选择Tris-HCl稀释配制梯度标准溶液主要目的是作为支持电解质。
根据类似的技术原理，本发明还提供了另一种定量测定五羟色胺的方法，过程包括：
(1)碳纤维超微电极经清洗后置于H2SO4溶液中用循环伏安法活化，再用超纯水清洗，得到活化后洁净的碳纤维超微电极，记为洁净电极；
(2)采用双电极系统，所有电位均以Ag/AgCl作为参比电极，将多个洁净电极在1.0×10-5mol/L多巴胺基准溶液中进行差分脉冲伏安扫描，筛选出峰电流差异在20％以内的电极作为工作电极；
(3)梯度浓度五羟色胺溶液标准样品的每个浓度值对应一个工作电极，测定并记录各工作电极在1.0×10-5mol/L多巴胺基准溶液中的峰电流，以最低浓度五羟色胺溶液对应的工作电极在基准溶液中的峰电流作为基准电流，其他工作电极在基准溶液中的峰电流与基准电流的比值为电流校正因子，各工作电极在梯度浓度五羟色胺溶液中的氧化峰电流除以该工作电极对应的校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流；
(4)以五羟色胺浓度和校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流绘制成标准曲线，进而得到相应的线性回归方程；
(5)待测样品去除其中的细胞和蛋白后，取一新的工作电极，在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在待测样品中扫描，记录氧化峰电流，将氧化峰电流值带入线性回归方程中，得到待测样品中五羟色胺的浓度。
实验发现，用1×10-5mol/L多巴胺作为基准溶液，也可筛选在1×10-5mol/L多巴胺基准溶液中差分脉冲响应电流差异在20％以内的多根不同碳纤维超微电极作为工作电极。同样能够避免五羟色胺氧化产物污染电极的弊端，获得更为准确的检测结果。
优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，碳纤维超微电极的制备方法为：将洁净的玻璃毛细管一端拉制成内径18～22μm的尖端；碳纤维依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水超声清洗后在空气中晾干；将碳纤维和铜丝用碳粉导电胶粘连，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入至露出玻璃毛细管尖端外，毛细管另一端用环氧树脂密封，环氧树脂固化后固定铜丝；将带有碳纤维的毛细管尖端置于750～850℃的火焰下灼烧至毛细管尖端熔融将碳纤维密封于其中；再将经熔融密封的碳纤维靠向340～360℃的火焰至黑色背景下观察到碳纤维尖端微红时立即拿开，获得碳纤维超微电极。
优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，梯度浓度五羟色胺溶液的五羟色胺浓度在1.0×10-6～2.0×10-4mol/L范围内。
优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，五羟色胺溶液由1×10-2mol/L五羟色胺母液经pH值7.2的Tris-HCl稀释配制。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以洁净的碳纤维超微电极和火焰灼烧活化后的碳纤维微电极为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，以原洁净碳纤维超微电极在基准溶液中的峰电流为基准电流，火焰灼烧活化后电极峰电流与原洁净电极峰电流的比值为电流校正因子，各梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流。或筛选在基准溶液中差分脉冲响应电流差异在20％以内的不同碳纤维超微电极作为工作电极，测定并记录其在基准溶液中的峰电流，各电极峰电流与第一根电极峰电流的比值为电流校正因子，电极在梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流。对五羟色胺氧化峰电流进行校正后，其与五羟色胺浓度线性关系良好，可以克服五羟色胺氧化产物污染电极的弊端，实现了神经递质五羟色胺的定量测定检测。
附图说明
图1为洁净的碳纤维超微电极在1×10-4mol/L五羟色胺溶液中10次循环伏安扫描曲线，电流随扫描次数递减，表明采用循环伏安法测试时，五羟色胺对电极表面有严重的毒化作用。
图2为洁净的碳纤维超微电极在1×10-4mol/L五羟色胺溶液中10次差分伏安扫描曲线，电流随扫描次数递减，表明采用差分脉冲伏安法测试时，五羟色胺对电极表面有严重的毒化作用。
图3为洁净的碳纤维超微电极在1.0×10-3mol/L铁氰化钾溶液(A、B)与1.0×10- 4mol/L多巴胺溶液(C、D)中的电化学行为，a.毒化前，b.毒化后，c.活化后，表明火焰灼烧法能活化电极表面，增加电流响应。
图4为洁净电极以及经火焰灼烧活化后的洁净电极在1.0×10-3mol/L铁氰化钾溶液中的差分脉冲伏安叠加图。通过火焰灼烧后，被污染的电极表面活化，电化学性能优良，与此同时，碳纤维也会因为灼烧而变短，电流一定程度减小。
图5为洁净电极以及经火焰灼烧活化后的洁净电极在浓度范围为1.0×10-6～2.0×10-4mol/L五羟色胺中的差分脉冲伏安图。
图6为电流校正前五羟色胺氧化峰电流与其浓度的线性关系。
图7为电流校正后五羟色胺氧化峰电流与其浓度的线性关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
五羟色胺溶液由1×10-2mol/L五羟色胺母液经pH值7.2的Tris-HCl逐级稀释配制。五羟色胺母液由0.1mol/L HClO4水溶液溶解五羟色胺粉末配制而成，然后置于4℃冰箱内保存。
20mmol/L、pH值7.2的Tris-HCl缓冲溶液：将242.3mg三羟甲基氨基甲烷(Tris)粉末溶于80mL蒸馏水，采用1mol/L盐酸将溶液pH调节至7.2，混匀并定容至100mL。
实施例中如无特殊说明，循环伏安法与差分脉冲伏安法均采用双电极系统，所有电位均以Ag/AgCl作为参比电极。
实施例1碳纤维超微电极制备
将洁净的玻璃毛细管(内径为1mm)一端拉制成内径约为20μm的尖端。碳纤维(直径6μm，长约15mm)依次用丙酮，乙醇，二次蒸馏水超声清洗5分钟，在空气中晾干。将碳纤维和铜丝(直径0.2mm，长约10cm)用碳粉导电胶粘连，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入至露出玻璃毛细管尖端外约2mm，毛细管另一端用环氧树脂密封，静置过夜环氧树脂固化后固定铜丝。将带有碳纤维的毛细管尖端置于酒精灯中部的外焰处(温度在750～850℃之间)灼烧约0.5s，毛细管尖端熔融将碳纤维密封于其中。再将经熔融密封的碳纤维小心靠向置于火焰底部的外焰处(温度约为350℃)，在黑色背景下可以看到碳纤维尖端微红时立即拿开，即可制得长度为50～200μm，尖端直径为几百纳米的碳纤维超微电极。
实施例2电极不经火焰灼烧活化对五羟色胺的检测
将实施例1制备的碳纤维超微电极分别在丙酮、无水乙醇和超纯水中清洗3min，其置于0.5mol/L H2SO4水溶液中用循环伏安法活化0.5h，再用超纯水清洗，得到活化后洁净的碳纤维超微电极。
将一根洁净的碳纤维超微电极置于1.0×10-4mol/L五羟色胺溶液进行循环伏安扫描10次，设定扫描速度为100mV/s，扫描范围从0.1V至0.8V。电流随扫描次数增加而递减，如图1所示，表明用循环伏安法，五羟色胺对电极表面有严重的毒化作用。采用双电极系统，所有电位均以Ag/AgCl作为参比电极。
将一根洁净的碳纤维超微电极置于1.0×10-4mol/L五羟色胺溶液进行差分脉冲扫描10圈，设定扫描速度为0.1V/s，扫描范围从0V至1.0V。电流随扫描圈次数增加而递减，结果如图2所示，表明用差分脉冲法，五羟色胺对碳纤维超微电极表面有严重的毒化作用。
实施例3
(1)火焰灼烧活化碳纤维超微电极方法：用镊子压紧酒精灯灯芯，使酒精灯火焰呈现微弱火焰，再将经熔融密封的碳纤维缓缓靠近火焰底部的外焰处(温度约为350℃)，在黑色背景下观察碳纤维尖端微微发红时立即拿开即可。
(2)将一根洁净的碳纤维超微电极分别在1.0×10-4mol/L多巴胺和1.0×10-3mol/L铁氰化钾溶液中进行循环伏安扫描与差分脉冲伏安扫描，经五羟色胺毒化后再将其置于上述溶液中扫描，用火焰灼烧法活化碳纤维超微电极后再将其置于上述溶液中扫描。碳纤维超微电极毒化前后和活化后在各电活性物质中的循环伏安与差分脉冲图如图3所示。实验结果说明，碳纤维超微电极在五羟色胺溶液扫描过程中被严重毒化，使得电极表面的活性点大部分被覆盖，电活性物质的峰电流大幅降低甚至消失，碳纤维电极毒化后会严重影响其检测灵敏度。经火焰灼烧后相当于更新了电极表面，活化后的电极电化学性能良好。
实施例4
在1.0×10-6～2.0×10-4mol/L浓度范围内选取7个不同浓度(浓度依次为1.0×10-6mol/L、5.0×10-6mol/L、1.0×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L、1.5×10-4mol/L、2.0×10-4mol/L)的五羟色胺标准样品，按浓度由低到高依次编号为1～7号。接着取一根经循环伏安法活化处理洁净的碳纤维超微电极在1.0×10-3mol/L铁氰化钾基准溶液中扫描，记录峰电流作为基准电流，然后在1号五羟色胺标准样品中扫描，记录峰电流，将电极用超纯水清洗，并在火焰上小心灼烧活化，再在1.0×10-3mol/L铁氰化钾基准溶液扫描并且记录峰电流，然后测2号五羟色胺标准样品，重复上述操作，直至扫描完一系列不同浓度的五羟色胺标准样品。原洁净碳纤维超微电极与火焰灼烧活化后电极在铁氰化钾基准溶液中的差分脉冲叠加图如图4所示。
五羟色胺的浓度在1.0×10-6～2.0×10-4mol/L范围内，其氧化峰电流随浓度增大而增大，如图5所示。
以原洁净碳纤维超微电极在铁氰化钾基准溶液中的峰电流为基准电流，各次活化后电极在铁氰化钾基准溶液中的峰电流与基准电流的比值为电流校正因子，各梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流。整理所得数据如表1所示。
表1 碳纤维超微电极在不同浓度五羟色胺溶液氧化峰电流校正
以五羟色胺浓度为横坐标，校正前、后五羟色胺氧化峰电流为纵坐标绘制工作曲线如图6和图7所示，电流校正前氧化峰电流与浓度线性关系不佳，回归方程为I(nA)＝0.0842C(μmol/L)+1.1927，线性相关系数R2＝0.9745；电流校正后氧化峰电流与浓度线性关系良好，回归方程为I(nA)＝0.2075C(μmol/L)+0.3181，线性相关系数R2＝0.9968。
将1×10-2mol/L五羟色胺母液经pH值7.2的Tris-HCl稀释作为试样，浓度为4.80×10-5mol/L，在试样中加五羟色胺标准品待测。
将检测完五羟色胺标准品的碳纤维超微电极用超纯水清洗晾干，火焰灼烧进行活化后在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在待测样品中扫描，记录氧化峰电流；然后将得到的峰电流值带入线性回归方程中，得到待测样品中五羟色胺的浓度，回收率为98.0％～102.4％(表2)。
表2 碳纤维超微电极检测五羟色胺的回收率
实施例4
(1)将按实施例1方法自制的碳纤维超微电极分别在丙酮、无水乙醇和超纯水中清洗5min，并将其置于1.0mol/L H2SO4溶液中用循环伏安法活化0.5h，再用超纯水清洗，得到活化后洁净的碳纤维超微电极。
(2)在1.0×10-6～2.0×10-4mol/L浓度范围内选取5个不同浓度五羟色胺标准样品，按浓度由低到高依次编号为1～5号。接着取一根洁净的碳纤维超微电极在1.0×10- 5mol/L多巴胺基准溶液中扫描，记录峰电流作为基准电流，然后在1号五羟色胺标准样品中扫描，记录峰电流；将电极用超纯水清洗，晾干后在火焰上小心灼烧活化，再在1.0×10- 5mol/L多巴胺基准溶液扫描并且记录峰电流，洗净并晾干后测2号五羟色胺标准样品，重复上述操作，直至扫描完一系列不同浓度的五羟色胺标准样品。记录电极在多巴胺基准溶液及五羟色胺溶液中的差分脉冲图。
(3)以各次灼烧活化后电极在多巴胺基准溶液中的峰电流与基准电流的比值作为电流校正因子，各梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流。
(4)以五羟色胺浓度为横坐标，电流校正后氧化峰电流与浓度线性关系良好，回归方程为I(A)＝0.0008C(mol/L)+2.0×10-9，线性相关系数R2＝0.9920。
(5)样品检测：将1×10-2mol/L五羟色胺母液经pH值7.2的Tris-HCl稀释作为试样，采用差分脉冲伏安法测得其浓度为5.12×10-5mol/L，在试样中加五羟色胺标准品待测。
将检测完五羟色胺标准品的碳纤维超微电极用超纯水清洗晾干，火焰灼烧进行活化后在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在待测样品中扫描，记录氧化峰电流；然后将得到的峰电流值带入线性回归方程中，得到待测样品中五羟色胺的浓度，回收率为96.3％～104.0％(表3)。
表3 碳纤维超微电极检测五羟色胺的回收率
实施例5
(1)将自制的碳纤维超微电极分别在丙酮、乙醇和超纯水中清洗3min，并将其置于0.5mol/L H2SO4溶液中用循环伏安法活化0.5小时，再用超纯水清洗，得到活化后洁净的碳纤维超微电极。
(2)将不同碳纤维超微电极在1.0×10-5mol/L多巴胺基准溶液中进行差分脉冲伏安扫描，筛选峰电流差异在20％以内的电极进行编号，进行下一步实验。
(3)测定并记录1～5号碳纤维超微电极在1.0×10-5mol/L多巴胺基准溶液中的峰电流I1～I5，各电极峰电流与第一根电极峰电流的比值(In/I1)为电流校正因子，在1.0×10-6～2.0×10-4mol/L浓度范围内选取5个不同浓度五羟色胺标准样品，按浓度由低到高依次编号为1～5号。筛选后的碳纤维超微电极在梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流。
(4)以五羟色胺浓度为横坐标，校正后五羟色胺氧化峰电流为纵坐标绘制工作曲线，校正后氧化峰电流与浓度线性关系良好，回归方程为I(A)＝0.0012C(mol/L)-9×10-10，线性相关系数R2＝0.9992，能实现神经递质五羟色胺的定量测定。
(5)样品检测：将1×10-2mol/L五羟色胺母液经pH值7.2的Tris-HCl稀释作为试样，其浓度为4.85×10-5mol/L，在试样中加五羟色胺标准品待测，取待测样品。
取新的工作电极，在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在待测样品中扫描，记录氧化峰电流，然后将得到的峰电流值带入线性回归方程中，得到待测样品中五羟色胺的浓度，回收率为98.7％～106.8％(表4)。
表4 碳纤维超微电极检测五羟色胺的回收率
附：加标回收率有空白加标回收和样品加标回收两种。
空白加标回收：在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值即为空白加标回收率。
样品加标回收：相同的样品取两份，其中一份加入定量的待测成分标准物质；两份同时按相同的分析步骤分析，加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果，其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率。
加标回收率的测定，是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术，对于它的计算方法，给定了一个理论公式：
加标回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，过程包括：
(1)碳纤维超微电极经清洗后用循环伏安法活化，再用超纯水清洗，得到活化后洁净的碳纤维超微电极，记为洁净电极；
(2)采用双电极系统，所有电位均以Ag/AgCl作为参比电极，洁净电极和经火焰灼烧活化的该洁净电极为工作电极，铁氰化钾水溶液或多巴胺水溶液为基准溶液，梯度浓度的五羟色胺溶液作为标准溶液，采用差分脉冲伏安法进行检测；
A、首先取一根洁净电极在基准溶液中扫描，记录峰电流作为基准电流；洁净电极用超纯水清洗晾干，再在任一浓度五羟色胺标准样品中扫描，记录氧化峰电流；
B、测试完该浓度五羟色胺的洁净电极用超纯水清洗晾干，火焰灼烧进行活化后再在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在另一浓度五羟色胺标准样品中扫描，记录氧化峰电流；
重复B步骤至完成全部五羟色胺标准样品的测试；
(3)以各次经火焰灼烧活化后的洁净电极在基准溶液中的峰电流与基准电流的比值为电流校正因子，各梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以该浓度五羟色胺检测时对应的校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流；
以五羟色胺浓度和校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流绘制成标准曲线，进而得到相应的线性回归方程；
(4)取待测样品去除其中的细胞和蛋白后，步骤(2)的电极用超纯水清洗晾干，火焰灼烧进行活化后在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在待测样品中扫描，记录氧化峰电流；峰电流与基准电流的比值为电流校正因子，氧化峰电流除以该电流校正因子为校正后氧化峰电流，将校正后氧化峰电流值带入线性回归方程中，得到待测样品中五羟色胺的浓度。
2.根据权利要求1所述的定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，步骤(2)的差分脉冲伏安法中，初始电位0.2V、终止电位0.7V、电位增量0.004V、振幅0.05V、脉冲宽度0.1s、采样宽度0.0167s、脉冲周期0.2s，支持电解质为20mmol/L、pH值7.2的Tris-HCl缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，碳纤维超微电极的制备方法为：将洁净的玻璃毛细管一端拉制成内径18～22μm的尖端；碳纤维依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水超声清洗后在空气中晾干；将碳纤维和铜丝用碳粉导电胶粘连，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入至露出玻璃毛细管尖端外，毛细管另一端用环氧树脂密封，环氧树脂固化后固定铜丝；将带有碳纤维的毛细管尖端置于750～850℃的火焰下灼烧至毛细管尖端熔融将碳纤维密封于其中；再将经熔融密封的碳纤维靠向340～360℃的火焰至黑色背景下观察到碳纤维尖端微红时立即拿开，获得碳纤维超微电极。
4.根据权利要求1所述的定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，铁氰化钾水溶液中铁氰化钾的摩尔浓度为1.0×10-3mol/L，多巴胺水溶液中多巴胺的摩尔浓度为1.0×10-4mol/L。
5.根据权利要求1所述的定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，梯度浓度五羟色胺溶液的五羟色胺浓度在1.0×10-6～2.0×10-4mol/L范围内。
6.根据权利要求1所述的定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，五羟色胺溶液由1×10-2mol/L五羟色胺母液经pH值7.2的Tris-HCl稀释配制。
7.一种定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，过程包括：
(1)碳纤维超微电极经清洗后置于H2SO4溶液中用循环伏安法活化，再用超纯水清洗，得到活化后洁净的碳纤维超微电极，记为洁净电极；
(2)采用双电极系统，所有电位均以Ag/AgCl作为参比电极，将多个洁净电极在1.0×10-5mol/L多巴胺基准溶液中进行差分脉冲伏安扫描，筛选出峰电流差异在20％以内的电极作为工作电极；
(3)梯度浓度五羟色胺溶液标准样品的每个浓度值对应一个工作电极，测定并记录各工作电极在1.0×10-5mol/L多巴胺基准溶液中的峰电流，以最低浓度五羟色胺溶液对应的工作电极在基准溶液中的峰电流作为基准电流，其他工作电极在基准溶液中的峰电流与基准电流的比值为电流校正因子，各工作电极在梯度浓度五羟色胺溶液中的氧化峰电流除以该工作电极对应的校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流；
(4)以五羟色胺浓度和校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流绘制成标准曲线，进而得到相应的线性回归方程；
(5)待测样品去除其中的细胞和蛋白后，取一新的工作电极，在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在待测样品中扫描，记录氧化峰电流，峰电流与基准电流的比值为电流校正因子，氧化峰电流除以该电流校正因子为校正后氧化峰电流，将校正后氧化峰电流值带入线性回归方程中，得到待测样品中五羟色胺的浓度。
8.根据权利要求7所述的定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，碳纤维超微电极的制备方法为：将洁净的玻璃毛细管一端拉制成内径18～22μm的尖端；碳纤维依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水超声清洗后在空气中晾干；将碳纤维和铜丝用碳粉导电胶粘连，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入至露出玻璃毛细管尖端外，毛细管另一端用环氧树脂密封，环氧树脂固化后固定铜丝；将带有碳纤维的毛细管尖端置于750～850℃的火焰下灼烧至毛细管尖端熔融将碳纤维密封于其中；再将经熔融密封的碳纤维靠向340～360℃的火焰至黑色背景下观察到碳纤维尖端微红时立即拿开，获得碳纤维超微电极。
9.根据权利要求7所述的定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，梯度浓度五羟色胺溶液的五羟色胺浓度在1.0×10-6～2.0×10-4mol/L范围内。
10.根据权利要求7所述的定量测定五羟色胺的方法，其特征在于，五羟色胺溶液由1×10-2mol/L五羟色胺母液经pH值7.2的Tris-HCl稀释配制。
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