JP2859310B2 - セロトニン及びその代謝物の定量方法 - Google Patents

セロトニン及びその代謝物の定量方法

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芳輝 景山
幸治 荒川
喜三 尾崎
なをみ 芳山
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Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、セロトニン及びその代謝物の定量方法に関
し、さらに詳しくは、例えば、尿、血液、髄液、脳組織
等の検体中に含有するセロトニン及びその代謝物を迅速
かつ簡便に定量する方法に関する。
[従来の技術及び発明が解決しようとする課題] 腸癌等のセロトニン産生腫瘍の診断方法のために、尿
等の検体中に含まれるセロトニン及びその代謝物である
5−ヒドロキシインドール−3−酢酸等の濃度を、薄層
クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分
析法、液体クロマトグラフィー等で定量する方法が知ら
れている。
しかしながら、これらの定量方法は、操作が煩雑で測
定の自動化ができないうえ、高価な装置が必要なことか
ら、臨床分析法としては不適当であり、また液体クロマ
トグラフィーは、昨今臨床分析の分野で最も有望視され
ている分析法ではあるが、カラムによる目的物質の分離
に時間を要し、また、カラムの劣化や特性変化による測
定結果のバラツキが大きく再現性に欠けるという不都合
があった。
本発明の目的は、検体に含有するセロトニン及びその
代謝物を迅速かつ簡便に定量することができるととも
に、測定を自動化して多数の検体を連続的に処理するこ
とができる、セロトニン及びその代謝物の定量方法を提
供することにある。
[課題を解決するための手段] 本発明者は、検体に含有するセロトニン及びその代謝
物以外の電気化学的活性物質を、特定の電位に設置した
定電位電解装置で、選択的にかつ迅速に電解し、次いで
前記定電位電解装置の電位と特定の電位幅をもって設定
したクーロメータまたはアンペロメータで、検体に残存
したセロトニン及びその代謝物を電解して測定できるこ
とを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明のセロトニン及びその代謝物の定量
方法は、検体に含有するセロトニン及びその代謝物以外
の電気化学的活性物質を、作用電極の電位を+0.1〜0.6
V(銀/塩化銀参照電極基準)に設定した定電位電解装
置にて電解し、ついでセロトニン及びその代謝物を、作
用電極の電位を前記定電位電解装置の作用電極の電位よ
り0.01〜0.5V高い電位に設定したクーロメータまたはア
ンペロメータにて電解することを特徴とする。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の定量方法は、検体に含有するセロトニン及び
その代謝物(以下、単にセロトニン等という)以外の電
気化学的活性物質をクーロメータ等の定電位電解装置を
使用して電気化学的に予め電解する。
検体としては、特に制限はなく、例えば尿、血液、髄
液、脳組織及びその他動物組織等を挙げることができ
る。
セロトニン等以外の電気化学的活性物質を電解する定
電位電解装置(以下、単にリアクタということがある)
の作用電極の電位は、参照電極として銀/塩化銀電極を
用いた場合、+0.1〜+0.6V、好ましくは+0.3〜+0.5
V、さらに好ましくは+0.40〜+0.45Vに設定する。
このような電位に設定したリアクターに検体を通導す
ることにより、検体に含有するセロトニン等以外の電気
化学的活性物質を良好に電解することができる。
なお、前記作用電極の電位が、+0.1V未満の場合に
は、セロトニン等以外の電気化学的活性物質が分解され
ずに残存し、また+0.6Vを超える場合にはセロトニン等
を分解し、測定精度が低下する。
本発明の作用電極の電位は、参照電極が銀/塩化銀電
極のときの電位をもって特定したが、他の参照電極を使
用する場合には、例えば標準水素電極を補正した前記電
位に対応する電位で実施することができる。
このようにして検体に含有するセロトニン等以外の電
気化学的活性物質を電解したのちに、その検体に残存す
るセロトニン等をクーロメータ又はアンペロメータにて
電解する。
セロトニン等を電解するクーロメータまたはアンペロ
メータ(以下、単にディテクタということがある)の作
用電極の電位は、前記リアクタの電位より0.01〜0.5V高
い電位に設定する。
なお、ディテクタの作用電極の電位が、0.01V未満の
場合には、セロトニン等の検出ができず、また0.5Vを超
える場合には共存物質が電解されて測定精度が低下す
る。
本発明の定量方法は、このような作用電極の電位の下
にセロトニン等を電解し、例えばディテクタがクーロメ
ータである場合には、セロトニン等の電解に要した電気
量、また、ディテクタがアンペロメータである場合に
は、電解時の電流に基づきセロトニン等を定量する。
次に、本発明の定量方法に使用する測定系について、
図を参照しながら説明する。
本発明の定量方法に使用する測定系としては、例え
ば、第1図〜第4図に示すように、リアクタ1としての
クーロメータaのディテクタ2としてのクーロメータa
及び/またはアンペロメータbとを直列に結合した測定
系で行われる。
リアクタ1またはデイテクタ2として用いられるクー
ロメータとしては、いわゆるクーロメトリーに使用する
ことができるものであれば特に制限はなく、例えば第5
図に示すように、サンプル流路17に臨ませた多孔性炭素
等の作用電極11、参照電極12、対極13、これらを収納す
る電解セル14及び前記参照電極12を基準として、作用電
極11と対極13に一定電位を印加するポテンシオスタット
を内蔵する電量計15を有する装置を挙げることができ
る。
クーロメータの作用電極としては、特に制限はなく、
公知の作用電極を使用することができるが、中でも多孔
性で表面積の大きい炭素材料が好ましい。
前記炭素材料としては、例えば本発明者らが先に提案
(特願平1−136371号)した炭素材料、すなわちその表
面に平均孔径0.1〜50μm、好ましくは1〜30μmの細
孔を有し、比表面積が10m2/g以上、好ましくは50m2/g以
上であって、しかも、X線分析法で求められる炭素の平
均層間隔(d002)が3.35〜3.42Å、好ましくは3.35〜3.
40Åの物理的性質を保有する多孔性黒鉛質炭素成形体を
使用することができる。
クーロメータの参照電極としては、特に制限はなく、
公知の電極を使用することができるが、中でも好ましい
のは、銀/塩化銀電極、フェリシャン鉄/フェロシャン
鉄電極である。
クーロメータの対極としては、特に制限はなく、例え
ば公知の耐蝕性金属からなる電極を使用することができ
るが、中でも好ましいのは、白金、金、ステンレスであ
る。
アンペロメータとしては、いわゆるアンペロメトリー
に使用することができるものであれば特に制限はなく、
例えば第6図に示すように、サンプル流路17に臨ませた
作用電極11、参照電極12、対極13これらを収納する電解
セル14及び前記参照電極12を基準として、作用電極11の
対極13に一定電位を印加するポテンシオスタットを内蔵
する電流計16を有する装置を挙げることができる。
アンペロメータの作用電極としては、特に制限はな
く、公知の作用電極を使用することができるが、中でも
好ましいのは、カーボン電極である。
アンペロメータの参照電極としては、特に制限はな
く、通常、クーロメータに使用することができる参照電
極を好適に使用することができる。
アンペロメータの対極としては、特に制限はなく、通
常、クーロメータに使用することができる対極を好適に
使用することができる。
なお、本発明の定量方法に使用することのできる測定
系は、前述のように少なくともリアクタとディテクタと
が直列に結合していればよく、例えば、第1図〜第3図
に示すように、リアクタ1を構成するクーロメータaと
ディテクタ2を構成するクーロメータaまたはアンペロ
メータbを直列に結合した測定系であってもよい。
また、例えば第4図に示すように、ディテクタ2を構
成する複数のクーロメータaを並列に結合した測定系で
あってもよい。なお、この場合、クーロメータaの一方
をリアクタ電位に、また他方をディテクタ電位に設定し
て、両者の電流値の差を差電流増幅器18にて測定するこ
とにより、リアクタ1で電解されなかった共存物に基づ
く電流値を補正することができる。
また、リアクタを構成する複数のクーロメータを並列
に結合した測定系(図示しない)であってもよい。
本発明の定量方法に使用する測定系は、クーロメータ
およびアンペロメータのほか、例えば第1図〜第4図に
示すように、リアクタ1の前段にフィルターまたはプレ
カラム3を設けることもできる。
フィルタおよびプレカラムは、検体に含有する例えば
蛋白質等がリアクタおよびディテクタの電気化学的特性
に影響を与えたり、リアクタおよびディテクタを目詰ま
りさせるのを防ぐため、予めそのような成分を除去する
ためのものである。
フィルターとしては、セロトニン等の保持能力がない
ものであれば特に制限はなく、例えば焼結フィルター、
ガラス製の各種フィルター等を好適に使用することがで
きる。
プレカラムとしては、例えばアルキル化したシリカゲ
ル、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体及びその誘導
体等の逆相系の充填剤、陽イオン交換樹脂等を充填した
プレカラムを使用することができる。
また、第1図〜第4図に示す測定系においては、通
常、検体4Aをリアクタ1及びディテクタ2内に円滑に導
通させるため、キャリヤーがポンプ7によりリアクタ1
からディテクタ2方向に流されている。
キャリヤーとしては、リアクタ及びディテクタ中で電
気化学的反応が起きるのに必要な程度の水(具体的には
5%程度以上)が含まれていれば、あらゆる組成の水溶
液が使用可能であるが、緩衝液のpHは2〜10、メタノー
ル或いはアセトニトリルの含有量は30%以下が望まし
い。
測定系内に通導するキャリヤーの流量は、通常0.1〜1
0ml/分、好ましくは0.3〜2ml/分である。
また、リアクタ及びディテクタへ供給するキャリヤー
は第1図及び第4図に示すように、キャリヤー貯め8か
らリアクタ1及びディテクタ2へ通導したのちは廃液貯
め9に廃棄してもよいし、第2図及び第3図に示すよう
に、循環して使用してもよい。
なお、キャリヤーを循環して使用する場合には、第2
図及び第3図に示すように、リアクタ1の前段に定電位
電解装置をガードセル5として設けるのが好ましい。
ガードセルは、循環するキャリヤーに含有する電気化
学的活性物質を予め電解する作用乃至機能を有する。
ガードセルとしては、通常、リアクタまたはディテク
タとして使用することができる、クーロメータを好適に
使用することができる。
なお、ガードセルとして使用する定電位電解装置の作
用電極の電位は、ディテクタとして使用するクーロメー
タまたはアンペロメータの作用電極の電位と同じか、0.
01〜0.5V高い電位に設定する。
(作用) このような第1図〜第4図に示す測定系において、リ
アクタ1の前段からサンプル注入器4等を用いて系内に
導入された検体4Aは、キャリヤーとともに、所定の電位
に設定されたリアクタ1に導かれ、ここで検体4Aに含有
するセロトニン等以外の電気化学的活性物質は電解され
る。
次いで、リアクタ1で電解されなかったセロトニン等
は、所定の電位に設定されたディテクタ2にキャリヤー
とともに導かれ電解される。
この電解の際、例えばディテクタがクーロメータの場
合には、電量値としてまたアンペロメータの場合には電
流値としてセロトニン等の電解応答信号を検出し、つい
でこの電解応答信号を計録計6またはデータ処理装置に
入力し、得られたデータに基づいてセロトニン等を定量
する。
[発明の効果] このように、本発明のセロトニン等の定量方法は、セ
ロトニン等を分離するための分離カラムを必要とせず、
またセロトニン等の定量を電気化学的に行うので、迅速
かつ簡単に優れた再現性をもって検体に含有するセロト
ニン等の濃度を定量することができる。また、測定を自
動化して多数の検体を連続的に処理することができる。
[実施例] 以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明す
る。
実施例1 第1図に示す測定系を用い、セロトニン産生腫瘍患者
3名及び健康人10名の尿中の5−ヒドロキシインドール
−3−酢酸を定量し、セロトニン産生腫瘍の診断への適
用の可否を検討した。
なお、ディテクタとしては、クーロメータを用いた。
キャリヤーとして10%のメチルアルコールを含む0.05
モル燐酸水溶液を用い、流量0.5ml/分で測定系に流し
た。
作用電極として多孔性黒鉛質炭素成形体を、対極とし
てステンレスを用いた。
参照電極として銀/塩化銀電極を用い、これを基準に
リアクタの電位+0.4V、ディテクタの電位を+0.45V更
にガードセルの電位を+0.55Vに設定した。
試料としては、セロトニン産性腫瘍患者及び健康人の
尿のそれぞれをさらに10倍希釈したものを用いた。
この試料の10μを分取して測定系に注入し、その試
料に含有するセロトニン等の電解に要した電気量値を求
めた。
なお、試料に含有するセロトニン等の定量値は、別途
に調製した5−ヒドロキシインドール−3−酢酸の標準
液を測定系に注入し、得られた電解電量に基づき、5−
ヒドロキシインドール−3−酢酸換算で算出した。
結果を第1表に示す。
また試料注入時から電解電量出力時までを測定系の分
析時間として求め、さらに5−ヒドロキシンドール−3
−酢酸の標準液を測定系に10回注入し、その定量値の再
現性(RSD)を求めた。
結果を第2表に示す。
比較例1 実施例1と同様の試料から、液体クロマトグラフィー
[分離カラム:Nucleosil 5−C18、溶出剤:0.05Mクエン
酸/アセトニトリル(7:1,V/V)]にて5−ヒドロキシ
インドール−3−酢酸を分離したのちに、実施例1と同
様のディテクタに通導して、実施例1と同様にして分析
時間と再現性を求めた。
結果を第2表に示す。
評価 健康人とセロトニン産生腫瘍患者のそれぞれの尿中の
5−ヒドロキシインドール−3−酢酸は、第1表に示す
ように明らかな違いが検出され、セロトニン産生腫瘍の
診断における本法の有効性が確認された。
また第2表に示すように、従来の方法に比し本発明に
よる方法が、分析時間が短く、かつ再現性も良く、分析
方法として優れていた。
【図面の簡単な説明】
第1図〜第4図は、本発明の定量方法に使用する測定系
を例示する概念図である。 第5図は、本発明に係るクーロメータを例示する概念図
である。 第6図は、本発明に係るアンペロメータを例示する概念
図である。 1……リアクタ 2……ディテクタ 3……フィルタまたはプレカラム 4……サンプル注入器、4A……検体 5……ガードセル、6……記録計 7……ポンプ、8……キャリヤー貯め 9……廃液貯め、11……作用電極 12……参照電極、13……対極 14……電解セル、15……電量計 16……電流計、17……サンプル流路 18……差電流増幅器 a……クーロメータ b……アンペロメータ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 尾崎 喜三 三重県四日市市東邦町1番地 三菱油化 株式会社四日市総合研究所内 (72)発明者 芳山 なをみ 三重県四日市市東邦町1番地 三菱油化 株式会社四日市総合研究所内 (72)発明者 亀田 洋子 三重県四日市市東邦町1番地 三菱油化 株式会社四日市総合研究所内 (56)参考文献 J.Chnrnatogr,264 (1983)p.119−127 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) G01N 27/416

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】検体に含有するセロトニン及びその代謝物
    以外の電気化学的活性物質を、作用電極の電位を+0.1
    〜+0.6V(銀/塩化銀参照電極基準)に設定した定電位
    電解装置にて電解し、ついでセロトニン及びその代謝物
    を、作用電極の電位を前記定電位電解装置の作用電極の
    電位より0.01〜0.5V高い電位に設定したクーロメータま
    たはアンペロメータにて電解することを特徴とするセロ
    トニン及びその代謝物の定量方法。
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