CN104569085B - 高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高灵敏高选择的金属汞离子(Hg²⁺)电化学传感器。基于Au‑S键合作用，在金电极表面自组装巯基修饰的DNA捕获探针，构建Hg²⁺电化学传感器界面。利用DNA的胸腺嘧啶(T)与Hg²⁺间强的亲和作用，在Hg²⁺、DNA辅助探针及修饰电化学活性分子二茂铁(Fc)的DNA信号探针同时存在时，可产生协同杂交效应，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，使得Fc分子靠近电极表面。通过直接检测Fc的氧化电流大小，实现对溶液中Hg²⁺浓度的测定。由于单个Hg²⁺就能在电极表面诱导形成一个DNA“Y”型结构，致使其对Hg²⁺的检测具有很高的灵敏性和选择性。该传感器制备简单、分析时间短、重现性好、易于更新，可很好的应用于环境监测、食品安全等领域。

Description

高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器

一、技术领域

本发明为一种高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器。通过单个T-Hg²⁺-T键合促发协同杂交效应，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，利用电化学活性分子在电极表面的快速电子传递，实现对Hg²⁺的简单、快速、高灵敏、高选择性电化学检测。

二、背景技术

重金属汞离子(Hg²⁺)在水体中的污染日益引起人们的关注，其经过食物链的生物放大作用，进入人体积累在脑、肝和其他器官中，产生慢性中毒，损害肾、脑、胃和肠道，而且能够引起神经紊乱，甚至引起死亡。另外，Hg²⁺能与酶中的氨基、二巯基、羧基、羟基以及细胞膜内的磷酰基结合，使酶失活，造成功能和结构损伤，从而阻碍细胞的生物活性和正常代谢。传统的痕量Hg²⁺检测方法主要有原子吸收、电感耦合等离子体发射光谱、化学法(沉淀滴定及元素分析等)、电导检测法(电导率测定及电位滴定法)、光谱检测法(荧光及紫外-可见光吸收检测法)和等离子体质谱等技术。然而，这些方法普遍存在检测过程繁琐、仪器昂贵、运行费用高、复杂的样品预处理、需要专业操作人员等缺点，并不适合现场快速监测和连续在线分析。电化学方法具有设备简单、价格低廉、易自动化、便于携带、灵敏度高、能进行快速在线连续监测等优点，是一种具有发展前景的重金属离子检测方法。

现有的Hg²⁺电化学检测方法主要有溶出伏安法、离子选择性电极和场效应晶体场传感器。然而这些方法都有很大的缺点，限制了其实际应用，例如溶出伏安法的工作电极常采用液态汞电极或汞膜电极等，由于汞的毒性和挥发性均较大，长期使用对工作者的健康有害，对环境也造成很大污染；离子选择性电极使用寿命短、抗干扰能力不强、检测灵敏度低；场效应晶体场传感器制备繁琐、灵敏度低、电信号噪音大。因此，设计制备新的电化学传感器，实现Hg²⁺简单、快速、高灵敏、高选择性的检测势在必行。

研究表明，Hg²⁺能介导胸腺嘧啶(T)配对，形成T-Hg²⁺-T复合物，其稳定性比正常的Watson-Crick碱基对还要稳定。基于此特性，通过设计特殊的DNA结构，结合荧光猝灭、纳米金凝聚比色、荧光能量转移、电化学DNA开关等信号传导模式，近年来发展了一系列简单快速的均相Hg²⁺检测方法。然而在这些方法中，每个DNA结构的变化都需要多个T-Hg²⁺-T键合力来实现，大大限制了这些方法的检测灵敏度和选择性。

三、发明内容

本发明的内容是：通过单个T-Hg²⁺-T键合促发协同杂交效应，结合三臂的DNA“Y”型结构和电化学活性分子在电极表面的快速电子传递，构建一种简单、快速、高灵敏、高选择的金属汞离子电化学传感器。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种高灵敏高选择的金属汞离子(Hg²⁺)电化学传感器，如图1所示。其特征在于该传感器由捕获探针P1、信号探针P2与辅助探针P3组成：捕获探针P1为5’端修饰巯基SH的DNA单链，基于Au-S键合作用，在金电极Au表面进行自组装修饰，形成传感界面；信号探针P2为3’端修饰电化学活性分子二茂铁Fc的DNA单链；辅助探针P3为没有任何修饰的DNA单链。在Hg²⁺存在时，利用DNA的胸腺嘧啶T与Hg²⁺间强的亲和作用，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，使得Fc分子靠近电极表面，产生电流信号。

上述的捕获探针P1含有16个碱基，从5’端开始的4碱基位点为胸腺嘧啶T；通过5’端修饰的巯基SH连接在金电极表面。

上述的信号探针P2含有17个碱基，从3’端开始的1、2、3、5、6、7、8碱基位点与捕获探针P1的5’端开始的1、2、3、5、6、7、8碱基位点完全碱基互补；从3’端开始的4碱基位点为胸腺嘧啶T。

上述的传感器通过T-Hg²⁺-T键合，使捕获探针P1的5’端开始的1-8碱基位点与信号探针P2的3’端开始的1-8碱基位点完全互补杂交，形成DNA“Y”型结构的臂1-2。

上述的辅助探针P3含有15个碱基，从5’端开始的1-7碱基位点与捕获探针P1的3’端开始的1-7碱基位点完全碱基互补，杂交形成DNA“Y”型结构的臂1-3；从3’端开始的1-8碱基位点与信号探针P2的5’端开始的1-8碱基位点完全碱基互补，杂交形成DNA“Y”型结构的臂2-3。

上述的三臂DNA“Y”型结构能使Fc分子靠近电极表面，直接产生电流信号。

上述的传感器，其特征在于如下检测步骤：

①将含Hg²⁺的样品、信号探针P2和辅助探针P3混合，并把混合液滴在电极表面进行温育；

②用冲洗液冲洗后，把电极插入检测溶液，用交流伏安法进行电化学检测。

③从工作曲线求出样品中的Hg²⁺浓度。

上述步骤②中的冲洗液为含100mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4；检测溶液为含1.0M NaClO₄的0.1M Tris-HCl缓冲液，pH 7.4。

上述的传感器，其特征在于检测完的电极表面可用100nM Na₂S再生，可重复使用。

本检测系统测定汞离子的原理：

本高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器检测原理如图1所示，基于Au-S键合作用，在金电极表面自组装巯基修饰的捕获探针P1，构建Hg²⁺电化学传感器界面；把含有Hg^{2 +}的待测溶液、信号探针P2与辅助探针P3混合，混合液滴于电化学传感器界面室温温育25分钟，通过单个T-Hg²⁺-T键合促发协同杂交效应，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，使得Fc分子靠近电极表面；最后，用交流伏安法电化学检测Fc的氧化电流，该信号与Hg²⁺浓度的对数值成正相关，通过工作曲线即可得到待测溶液中Hg²⁺的浓度。

本发明与现有技术相比，具有以下特点：

本发明通过单个T-Hg²⁺-T键合促发协同杂交效应，结合三臂的DNA“Y”型结构和电化学活性分子在电极表面的快速电子传递，构建高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器。相对现有的Hg²⁺检测方法，具有以下特点：

(1)设计单T-Hg²⁺-T键合促发协同杂交效应，形成三臂的DNA“Y”型结构，大大提高了检测灵敏度，对Hg²⁺的检测可低至5×10^-12M。

(2)结合单碱基错配原理和Hg²⁺与胸腺嘧啶T间高特异的亲和作用设计传感器，具有高的检测选择性，可在100倍高浓度杂离子存在下检测Hg²⁺。

(3)利用Au-S自组装原理制备传感界面，简单、重复性好。

(4)由于电化学活性分子的电子传递速率取决于其接近电极表面的距离，本传感器具有超低的背景信号，且可进行一步式检测。

(5)通过电化学手段进行检测，不需要昂贵的仪器设备，可微型化和便携化。

(6)通过Na2S在10分钟内可实现传感器的再生。

四、附图说明

图1.高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器检测示意图

五、具体实施方式

实施例1：结合附图1，高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器检测示意图

(1)基于Au-S键合作用，在金电极表面自组装巯基修饰的捕获探针P1，然后通过巯基己醇(MCH)封闭，排除非特异性吸附：在洁净的金电极表面滴加6μL 1μM的捕获探针P1，室温温育2h后用冲洗液冲洗，氮气吹干后，再在电极表面滴加6μL1mM的MCH封闭液封闭30min，用冲洗液洗净，氮气吹干。

(2)配制样品温育液：把含有Hg²⁺的待测溶液、信号探针P2与辅助探针P3在含100mMNaCl的10mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液中混合，使得信号探针P2与辅助探针P3的浓度都为1μM。

(3)滴加6μL样品温育液于(1)制备的金电极表面，室温温育25分钟，然后用冲洗液冲洗。

(4)把(3)得到的电极插入检测液，以此电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极，在0.0V至+0.70V电位范围进行交流伏安测定，脉冲振幅为25mV，脉冲频率为100Hz，脉冲宽度为4mV。根据记录的电化学信号，获得Hg²⁺检测的工作曲线。

(5)取出(4)中用过的传感器浸泡于100nM Na₂S溶液中10分钟进行再生，然后用冲洗液洗净，氮气吹干。

(6)更新的传感器根据(2)-(5)步骤进行另一个样品中Hg²⁺的检测和传感器再生。

Claims (6)

1.一种高灵敏高选择的金属汞离子Hg²⁺电化学传感器，其特征在于该传感器由捕获探针P1、信号探针P2与辅助探针P3组成：捕获探针P1为5’端修饰巯基SH的DNA单链，从5’端开始的第4碱基位点为胸腺嘧啶T，基于Au-S键合作用，捕获探针P1在金电极Au表面进行自组装修饰，形成传感界面；信号探针P2为3’端修饰电化学活性分子二茂铁Fc的DNA单链，从3’端开始的第4碱基位点为胸腺嘧啶T；辅助探针P3为没有任何修饰的DNA单链；在Hg²⁺存在时，捕获探针P1和信号探针P2上的胸腺嘧啶T与Hg²⁺形成单个T-Hg²⁺-T键合，进而促发捕获探针P1、信号探针P2与辅助探针P3进行协同杂交反应，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，使得Fc分子靠近电极表面，产生电流信号。

2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于通过单个T-Hg²⁺-T键合，使捕获探针P1的5’端开始的1-8碱基位点与信号探针P2的3’端开始的1-8碱基位点完全互补杂交，形成DNA“Y”型结构的臂1-2。

3.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的辅助探针P3含有15个碱基，从5’端开始的1-7碱基位点与捕获探针P1的3’端开始的1-7碱基位点完全碱基互补，杂交形成DNA“Y”型结构的臂1-3。

4.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的辅助探针P3从3’端开始的1-8碱基位点与信号探针P2的5’端开始的1-8碱基位点完全碱基互补，杂交形成DNA“Y”型结构的臂2-3。

5.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于如下检测步骤：

(1)将含Hg²⁺的样品、信号探针P2和辅助探针P3混合，并把混合液滴在电极表面进行温育；

(2)用冲洗液冲洗后，把电极插入检测溶液，用交流伏安法进行电化学检测；

(3)从工作曲线求出样品中的Hg²⁺浓度。

6.根据权利要求5所述的传感器，其特征在于检测完的电极表面可用100nM Na₂S再生，可重复使用。