CN104569085A - 高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高灵敏高选择的金属汞离子(Hg2+)电化学传感器。基于Au-S键合作用，在金电极表面自组装巯基修饰的DNA捕获探针，构建Hg2+电化学传感器界面。利用DNA的胸腺嘧啶(T)与Hg2+间强的亲和作用，在Hg2+、DNA辅助探针及修饰电化学活性分子二茂铁(Fc)的DNA信号探针同时存在时，可产生协同杂交效应，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，使得Fc分子靠近电极表面。通过直接检测Fc的氧化电流大小，实现对溶液中Hg2+浓度的测定。由于单个Hg2+就能在电极表面诱导形成一个DNA“Y”型结构，致使其对Hg2+的检测具有很高的灵敏性和选择性。该传感器制备简单、分析时间短、重现性好、易于更新，可很好的应用于环境监测、食品安全等领域。
Description
一、技术领域
本发明为一种高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器。通过单个T-Hg2+-T键合促发协同杂交效应，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，利用电化学活性分子在电极表面的快速电子传递，实现对Hg2+的简单、快速、高灵敏、高选择性电化学检测。
二、背景技术
重金属汞离子(Hg2+)在水体中的污染日益引起人们的关注，其经过食物链的生物放大作用，进入人体积累在脑、肝和其他器官中，产生慢性中毒，损害肾、脑、胃和肠道，而且能够引起神经紊乱，甚至引起死亡。另外，Hg2+能与酶中的氨基、二巯基、羧基、羟基以及细胞膜内的磷酰基结合，使酶失活，造成功能和结构损伤，从而阻碍细胞的生物活性和正常代谢。传统的痕量Hg2+检测方法主要有原子吸收、电感耦合等离子体发射光谱、化学法(沉淀滴定及元素分析等)、电导检测法(电导率测定及电位滴定法)、光谱检测法(荧光及紫外-可见光吸收检测法)和等离子体质谱等技术。然而，这些方法普遍存在检测过程繁琐、仪器昂贵、运行费用高、复杂的样品预处理、需要专业操作人员等缺点，并不适合现场快速监测和连续在线分析。电化学方法具有设备简单、价格低廉、易自动化、便于携带、灵敏度高、能进行快速在线连续监测等优点，是一种具有发展前景的重金属离子检测方法。
现有的Hg2+电化学检测方法主要有溶出伏安法、离子选择性电极和场效应晶体场传感器。然而这些方法都有很大的缺点，限制了其实际应用，例如溶出伏安法的工作电极常采用液态汞电极或汞膜电极等，由于汞的毒性和挥发性均较大，长期使用对工作者的健康有害，对环境也造成很大污染；离子选择性电极使用寿命短、抗干扰能力不强、检测灵敏度低；场效应晶体场传感器制备繁琐、灵敏度低、电信号噪音大。因此，设计制备新的电化学传感器，实现Hg2+简单、快速、高灵敏、高选择性的检测势在必行。
研究表明，Hg2+能介导胸腺嘧啶(T)配对，形成T-Hg2+-T复合物，其稳定性比正常的Watson-Crick碱基对还要稳定。基于此特性，通过设计特殊的DNA结构，结合荧光猝灭、纳米金凝聚比色、荧光能量转移、电化学DNA开关等信号传导模式，近年来发展了一系列简单快速的均相Hg2+检测方法。然而在这些方法中，每个DNA结构的变化都需要多个T-Hg2+-T键合力来实现，大大限制了这些方法的检测灵敏度和选择性。
三、发明内容
本发明的内容是：通过单个T-Hg2+-T键合促发协同杂交效应，结合三臂的DNA“Y”型结构和电化学活性分子在电极表面的快速电子传递，构建一种简单、快速、高灵敏、高选择的金属汞离子电化学传感器。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种高灵敏高选择的金属汞离子(Hg2+)电化学传感器，如图1所示。其特征在于该传感器由捕获探针(P1)、信号探针(P2)与辅助探针(P3)组成：捕获探针(P1)为5’端修饰巯基(SH)的DNA单链，基于Au-S键合作用，在金电极(Au)表面进行自组装修饰，形成传感界面；信号探针(P2)为3’端修饰电化学活性分子二茂铁(Fc)的DNA单链；辅助探针(P3)为没有任何修饰的DNA单链。在Hg2+存在时，利用DNA的胸腺嘧啶(T)与Hg2+间强的亲和作用，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，使得Fc分子靠近电极表面，产生电流信号。
上述的捕获探针(P1)含有16个碱基，从5’端开始的4碱基位点为胸腺嘧啶(T)；通过5’端修饰的巯基(SH)连接在金电极表面。
上述的信号探针(P2)含有17个碱基，从3’端开始的1、2、3、5、6、7、8碱基位点与捕获探针(P1)5’端开始的1、2、3、5、6、7、8碱基位点完全碱基互补；从3’端开始的4碱基位点为胸腺嘧啶(T)。
上述的传感器通过T-Hg2+-T键合，使捕获探针(P1)5’端开始的1-8碱基位点与信号探针(P2)3’端开始的1-8碱基位点完全互补杂交，形成DNA“Y”型结构的臂1-2。
上述的辅助探针(P3)含有15个碱基，从5’端开始的1-7碱基位点与捕获探针(P1)3’端开始的1-7碱基位点完全碱基互补，杂交形成DNA“Y”型结构的臂1-3；从3’端开始的1-8碱基位点与信号探针(P2)5’端开始的1-8碱基位点完全碱基互补，杂交形成DNA“Y”型结构的臂2-3。
上述的三臂DNA“Y”型结构能使Fc分子靠近电极表面，直接产生电流信号。
上述的传感器，其特征在于如下检测步骤：
①将含Hg2+的样品、信号探针(P2)和辅助探针(P3)混合，并把混合液滴在电极表面进行温育；
②用冲洗液冲洗后，把电极插入检测溶液，用交流伏安法进行电化学检测。
③从工作曲线求出样品中的Hg2+浓度。
上述步骤②中的冲洗液为含100mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4；检测溶液为含1.0M NaClO4的0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.4。
上述的传感器，其特征在于检测完的电极表面可用100nM Na2S再生，可重复使用。
本检测系统测定汞离子的原理：
本高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器检测原理如图1所示，基于Au-S键合作用，在金电极表面自组装巯基修饰的捕获探针(P1)，构建Hg2+电化学传感器界面；把含有Hg2+的待测溶液、信号探针(P2)与辅助探针(P3)混合，混合液滴于电化学传感器界面室温温育25分钟，通过单个T-Hg2+-T键合促发协同杂交效应，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，使得Fc分子靠近电极表面；最后，用交流伏安法电化学检测Fc的氧化电流，该信号与Hg2+浓度的对数值成正相关，通过工作曲线即可得到待测溶液中Hg2+的浓度。
本发明与现有技术相比，具有以下特点：
本发明通过单个T-Hg2+-T键合促发协同杂交效应，结合三臂的DNA“Y”型结构和电化学活性分子在电极表面的快速电子传递，构建高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器。相对现有的Hg2+检测方法，具有以下特点：
(1)设计单T-Hg2+-T键合促发协同杂交效应，形成三臂的DNA“Y”型结构，大大提高了检测灵敏度，对Hg2+的检测可低至5×10-12M。
(2)结合单碱基错配原理和Hg2+与胸腺嘧啶(T)间高特异的亲和作用设计传感器，具有高的检测选择性，可在100倍高浓度杂离子存在下检测Hg2+。
(3)利用Au-S自组装原理制备传感界面，简单、重复性好。
(4)由于电化学活性分子的电子传递速率取决于其接近电极表面的距离，本传感器具有超低的背景信号，且可进行一步式检测。
(5)通过电化学手段进行检测，不需要昂贵的仪器设备，可微型化和便携化。
(6)通过Na2S在10分钟内可实现传感器的再生。
四、附图说明
图1.高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器检测示意图
五、具体实施方式
实施例1：结合附图1，高灵敏高选择的金属汞离子电化学传感器检测示意图
(1)基于Au-S键合作用，在金电极表面自组装巯基修饰的捕获探针(P1)，然后通过巯基己醇(MCH)封闭，排除非特异性吸附：在洁净的金电极表面滴加6μL1μM的捕获探针(P1)，室温温育2h后用冲洗液冲洗，氮气吹干后，再在电极表面滴加6μL1mM的MCH封闭液封闭30min，用冲洗液洗净，氮气吹干。
(2)配制样品温育液：把含有Hg2+的待测溶液、信号探针(P2)与辅助探针(P3)在含100mM NaCl的10mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液中混合，使得信号探针(P2)与辅助探针(P3)的浓度都为1μM。
(3)滴加6μL样品温育液于(1)制备的金电极表面，室温温育25分钟，然后用冲洗液冲洗。
(4)把(3)得到的电极插入检测液，以此电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为对电极，在0.0V至+0.70V电位范围进行交流伏安测定，脉冲振幅为25mV，脉冲频率为100Hz，脉冲宽度为4mV。根据记录的电化学信号，获得Hg2+检测的工作曲线。
(5)取出(4)中用过的传感器浸泡于100nM Na2S溶液中10分钟进行再生，然后用冲洗液洗净，氮气吹干。
(6)更新的传感器根据(2)-(5)步骤进行另一个样品中Hg2+的检测和传感器再生。
Claims (12)
1.本发明涉及一种高灵敏高选择的金属汞离子(Hg2+)电化学传感器。其特征在于该传感器由捕获探针(P1)、信号探针(P2)与辅助探针(P3)组成：捕获探针(P1)为5’端修饰巯基(SH)的DNA单链，基于Au-S键合作用，在金电极(Au)表面进行自组装修饰，形成传感界面；信号探针(P2)为3’端修饰电化学活性分子二茂铁(Fc)的DNA单链；辅助探针(P3)为没有任何修饰的DNA单链。在Hg2+存在时，利用DNA的胸腺嘧啶(T)与Hg2+间强的亲和作用，在金电极表面形成三臂的DNA“Y”型结构，使得Fc分子靠近电极表面，产生电流信号。
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的捕获探针(P1)含有16个碱基，从5’端开始的4碱基位点为胸腺嘧啶(T)。
3.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的捕获探针(P1)通过5’端修饰的巯基(SH)连接在金电极表面。
4.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的信号探针(P2)含有17个碱基，从3’端开始的1、2、3、5、6、7、8碱基位点与捕获探针(P1)5’端开始的1、2、3、5、6、7、8碱基位点完全碱基互补。
5.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的信号探针(P2)从3’端开始的4碱基位点为胸腺嘧啶(T)。
6.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于通过T-Hg2+-T键合，使捕获探针(P1)5’端开始的1-8碱基位点与信号探针(P2)3’端开始的1-8碱基位点完全互补杂交，形成DNA“Y”型结构的臂1-2。
7.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的辅助探针(P3)含有15个碱基，从5’端开始的1-7碱基位点与捕获探针(P1)3’端开始的1-7碱基位点完全碱基互补，杂交形成DNA“Y”型结构的臂1-3。
8.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的辅助探针(P3)从3’端开始的1-8碱基位点与信号探针(P2)5’端开始的1-8碱基位点完全碱基互补，杂交形成DNA“Y”型结构的臂2-3。
9.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于所述的三臂DNA“Y”型结构能使Fc分子靠近电极表面，直接产生电流信号。
10.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于如下检测步骤：
(1)将含Hg2+的样品、信号探针(P2)和辅助探针(P3)混合，并把混合液滴在电极表面进行温育；
(2)用冲洗液冲洗后，把电极插入检测溶液，用交流伏安法进行电化学检测。
(3)从工作曲线求出样品中的Hg2+浓度。
11.根据权利要求10所述的传感器，其特征在于冲洗液为含100mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4；检测溶液为含1.0M NaClO4的0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.4。
12.根据权利要求10所述的传感器，其特征在于检测完的电极表面可用100nMNa2S再生，可重复使用。
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