JP2011058900A

JP2011058900A - 酸化還元種濃度測定方法

Info

Publication number: JP2011058900A
Application number: JP2009207696A
Authority: JP
Inventors: Shinji Tanaka; 真司田中
Original assignee: Panasonic Corp
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2009-09-09
Filing date: 2009-09-09
Publication date: 2011-03-24

Abstract

【課題】試料中に含まれる低濃度の酸化還元種濃度の定量を行うこと。
【解決手段】微小くし型電極を用いて第１の電極に一定の酸化電位を印加し、第２の電極に一定の還元電位を印加するレドックスサイクルを用いた測定方法において、前記第２の電極に還元電位を印加したときからの経時時間ｔ１における第１の電極と対極における電流ｉ_t1 ^(total)および前記第２の電極に還元電位を印加したときからの経時時間ｔ２における第１の電極と対極における電流ｉ_t2 ^(total) を測定し、あらかじめ定めた式から酸化還元種の濃度を算出することを特徴とする測定方法であり、前記式は経時時間ｔと酸化還元種の濃度Ｃ^(Redox)に下記の関係にある式であることを特徴とする酸化還元種濃度測定方法。ｉ_t1 ^(total)／ｉ_t2 ^(total)＝ｔ１＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝／ｔ２＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝
【選択図】図１

Description

本発明は、試料中に含まれる被測定物質の定量を行うための測定方法に関するものである。

生体試料中に微量に混入しているマーカーを検出するために信号を増幅する方法として、マーカーと酸化還元種の複合体を形成し、微小櫛形電極（ＩＤＡ）を用いてレドックスサイクルにおいて増幅検出する方法が提案されている（特許文献１）。ＩＤＡを使用した場合における最低検出濃度は１０^-8Ｍ程度であり、これ以下の濃度での測定は困難といわれている（非特許文献１）。

特許第２５９０００２号公報

極微細くし形電極を用いた電気化学分析の研究−高感度分子認識−，ＮＴＴＲ＆Ｄ，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．１（１９９３），Ｐ８９−Ｐ９６「電気化学測定法（上）」、技報堂出版、ｐ７９Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６（１９８８）２６０−２８２

このように、検体中に微量に混入しているマーカーを検出するために酸化還元種とマーカーの複合体（たとえば、抗原抗体複合体）を定量する際に１０^-9Ｍ以下の低濃度の際には困難であるという課題があった。特に実用的な面から考えると、もっとも実用的で単純な測定方法であるクロノアンペロメトリーを用いて検体中の酸化還元種の濃度を測定するのが理想的であるが、現状では１０^-9Ｍ以下の低濃度を検出することはできなかった。

上記従来の課題を解決するために、本発明の発明者は鋭意検討の結果、特に１０^-8Ｍ〜１０^-10Ｍの酸化還元種の濃度域におけるクロノアンペロメトリーを用いた実験を通して、下記の３点の傾向を見出した。

電流ｉ^(total)は経過時間ｔに対してｔの指数関数的に減衰する曲線を示す。

酸化還元種が低濃度であるほどｔの指数部は、負に大きくなる。

ｔの指数部は、試料中の酸化還元種の濃度の指数部に反比例する。

これらの傾向を元に電流の測定データを解析フィッティングしたところ、数１のようなｉ−ｔ曲線の関連を示す式を導き出した。

（数１）
ｉ^(total)＝ α×ｔ^(-1/[1+0.5×^{(10+log(C(Redox))]}
ただし、１０^-8Ｍ≦Ｃ^(Redox)≦１０^-10Ｍ
α：定数、ただしクロノアンペロメトリー測定ごとに異なる値、ｔ：経過時間
Ｃ^(Redox)：酸化還元種の濃度

もし経過時間ｔにおける測定電流からｉ^(total)酸化還元種の濃度を求めたい場合、数１では不明なパラメータが右辺にαとＣ^(Redox)の２つがあり、この式から求めることは不可能である。そこで、電流を別の経過時間においてもう一度測定し、数２の式によって不明なパラメータのうちαを消すことによりを一意的に求めることができることを見出した。

（数２）
ｉ_t1 ^(total)／ｉ_t2 ^(total) ＝
ｔ１＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝／ｔ２＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝

数２により、２度の電流測定時間ｔ１，ｔ２における測定電流ｉ_t1 ^(total)、ｉ_t2 ^(total)から、一意的に酸化還元種の濃度Ｃ^(Redox)を求めることができるようになった。

以上より、本発明における測定方法は、
微小くし型電極を用いて第１の電極に一定の酸化電位を印加し、第２の電極に一定の還元電位を印加するレドックスサイクルを用いた測定方法において、
前記第２の電極に還元電位を印加したときからの経時時間ｔ１における第１の電極と対極における電流ｉ_t1 ^(total)および
前記第２の電極に還元電位を印加したときからの経時時間ｔ２における第１の電極と対極における電流ｉ_t2 ^(total)を測定し、
あらかじめ定めた式から酸化還元種の濃度を算出する
ことを特徴とする測定方法であり、
前記式は経時時間ｔと酸化還元種の濃度Ｃ^(Redox)に下記の関係にある式であることを特徴とする。

ｉ_t1 ^(total)／ｉ_t2 ^(total) ＝
ｔ１＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝／ｔ２＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝

本構成にすることにより、低濃度域において試料中の酸化還元種の濃度を正しく見積もることができる。

また、本発明における測定方法は、前記ｔ１およびｔ２が１０秒から１２０秒の、それぞれ異なる経過時間であることを特徴とする。

本構成にすることにより、確実に低濃度域において試料中の酸化還元種の濃度を正しく見積もることができる経過時間において濃度を算出することができる。

本発明の測定方法によれば、低濃度の酸化還元種を含む試料を電気化学的に定量することができる。

本発明の一実施の形態におけるクロノアンペロメトリー実験の経時変化グラフ本発明の一実施の形態におけるクロノアンペロメトリー実験のレドックスサイクル経時変化グラフ本発明の一実施の形態におけるクロノアンペロメトリー実験の経時変化フィッティンググラフ本発明の一実施の形態における数２による濃度相関グラフ

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。

（実施の形態１）
本発明の実施の形態１に係る測定方法について説明する。

＜酸化還元種を含む試料のクロノアンペロメトリー測定＞
実験条件を以下に示す。試料は、ＰＢＳ溶液内に酸化還元種としてフェロセンモノカルボン酸をあらかじめＣ^(Redox)＝１０^-6Ｍから１０^-10Ｍに調製した５０ｍｌのものを用いた。電極は、２μｍ幅、２ｍｍ長の電極をくし状に交互に６５組配置した微小ＩＤＡ電極を用いた。なお、参照電極は別途Ａｇ／ＡｇＣｌ飽和ＫＣＬ電極を用い、対極はコイル状の白金電極を用いた。ＩＤＡ電極の２組の電極には、デュアルポテンショスタットを用いて一方の電極（Ｇ極）には０Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌｉｎ飽和ＫＣＬ）を、もう一方の電極（Ｃ極）には０．３５２Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌｉｎ飽和ＫＣｌ）の一定電位を０−１２０ｓｅｃ継続して印加した。

図１は上記の方法にて実施したクロノアンペロメトリー実験の経時変化をグラフにしたものである。グラフは、電位の印加時間に対してＧ極の電流をプロットしたものである。このグラフから、１０^-6Ｍについては３０ｓｅｃ程度経過すると経過時間に関わらず一定の電流が観測された。これは、酸化還元種が十分高濃度であり、レドックスサイクルによる限界電流（数３にて表現される：非特許文献３）に相当する。数２からわかるように、レドックスサイクルに起因する項は経過時間に関わらず一定であることが特徴であり、酸化還元種の種類がわかっていれば濃度に伴う電流値が一意的に決定される。

（数３）
ｉ^(Redox)＝ｍｂｎＦＣ^(Redox)Ｄ^(Redox)［−６３７Ｌｎ（２．５５ｗ／ｇ）−０．１９（ｗ／ｇ）²］
ｍ：ＩＤＡのくし数、ｂ：ＩＤＡのくし長、ｎ：単位反応電子数、Ｆ：ファラデー定数、
Ｃ^(Redox)：酸化還元種濃度、Ｄ^(Redox)：拡散係数、ｗ：くし幅＋くし間ギャップ
ｇ：くし間ギャップ

図２に上記数３の式によって各酸化還元種の濃度における電流値を計算したグラフを示す。グラフは、電位の印加時間に対して電流の計算値をプロットしたものである。
１０^-6Ｍの濃度においては双方とも約５．０×１０^-9Ａのオーダーであり実測値と計算値がよく一致した。また実測値と理論式とから補足率を換算すると、捕捉率は９５．１％相当であった。算出に用いた各種パラメータは今実験の各種物性値に基づいている。各種パラメータは以下の表１のとおりである。

一方、同様に計算すると１０^-8Ｍでは５．０×１０−１１Ａオーダーとなり、実測データから比較すると３桁小さいオーダーであり、数２に基づく算出式では記述できないことがわかった。

そこで、われわれはこの傾向について次のように仮説立てた。
酸化還元種の濃度が低い場合、クロノアンペロメトリー信号ｉ^(total)は、レドックスサイクルに起因する項ｉ^(Redox) （非特許文献４）（数３）が小さくなることから、ｉ^(Redox)より溶存水素イオンの脱着波に起因する項ｉ^(H2O)が支配的に観測されるとして低濃度での信号の経時変化を記述することを考えた（数４）。

（数４）
ｉ^(total) ＝ｉ^(Redox) ＋ｉ^(H2O) ≒ ｉ^(H2O)
ただし、１０^-8Ｍ以下の低濃度域

脱着波は、電極の表面に対して吸着している溶存水素イオンが、電位を正に印加した場合に溶媒の水分子と結合して水素イオンが脱着する際に電極に電子を与える際に生じる微小な電流として知られている。白金電極の表面で比較的大きい電流として観測される現象であるが、金電極でも完全に存在しないわけではなく、微小ながら有限の電流が観測される。金電極の電位窓グラフで０−０．５Ｖの電位において微小に観測される電流は脱着波と考えられる（非特許文献２）。

ｉ^(H2O)については、酸化還元種の拡散係数や濃度には直接関係なく、基本的には水分子の拡散係数と濃度に関係するコットレル式（Ｃｏｔｔｒｅｌｌｅｑｕａｔｉｏｎ）として考えることができ、経過時間ｔに指数関数的に比例して、具体的にはｔ^-1/2に比例して経時的に減衰する信号変化として捕らえることができる。なお、水分子は十分多量に混入していると考えられることから拡散係数と濃度は経過時間ｔによって変化することはなく、一定値とみなしてよい。

このコットレル式（Ｃｏｔｔｒｅｌｌｅｑｕａｔｉｏｎ）として考える考え方に基づき、経過時間ｔに電流が指数関数的に比例しているという仮定の下に図１の実測データの波形を鋭意検討したところ、実際に電流ｉ^(total)は経過時間ｔが大きくなるほど減衰する曲線を示すという傾向が見て取れた。

ただし、１０^-8Ｍ以下の実測データでは、ｔの指数部は必ずしも−１／２ではなく、酸化還元種が低濃度であるほどｔの指数部は、負に大きくなるという傾向も見て取れた。

これらの傾向を元にｔの指数部を変数とした上で数５のようにフィッティング式を設定し、１０^-8Ｍ≦Ｃ^(Redox)≦１０^-10Ｍの電流の測定データについてフィッティングを試みた。

（数５）
ｉ^(total)＝α×ｔ^(-1/β^]
ただし、１０^-8Ｍ≦Ｃ^(Redox)≦１０^-10Ｍ
α：定数、ただしクロノアンペロメトリー測定ごとに異なる値、ｔ：経過時間

その結果、下記の値にて良好にフィッティングされることがわかった。
Ｃ^(Redox)＝１０^-8Ｍ時 α＝６．１×１０^-9，β＝２．０
Ｃ^(Redox)＝１０^-9Ｍ時 α＝１．３×１０^-8，β＝１．５
Ｃ^(Redox)＝１０^-10Ｍ時 α＝６．３×１０^-8，β＝１．０

図３に上記α、βによってフィッティングしたグラフを示す。グラフを見ればわかるとおり、１０^-8Ｍ≦Ｃ^(Redox)≦１０^-10Ｍについて実験をよく再現していることがわかる。

つぎに、上記βの値がＣ^(Redox)によって記述できないかを検討した。その結果、下記の関数によって記述できることがわかった。
β＝１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）
よって、数６は以下のように記述される。

（数６）
ｉ^(total)＝α×ｔ^(-1/[1+0.5×^{(10+log(C(Redox))]}
ただし、１０^-8Ｍ≦Ｃ^(Redox)≦１０^-10Ｍ

なお、１０^-10Ｍが１０^-8Ｍや１０^-9Ｍより大きい電流を観測しているのは下記のように考えることができる。

酸化還元種が低い濃度のみ含まれる試料であるほど、ＩＤＡの電極表面にて酸化還元種が関与しない表面が相対的に露出することが考えられる。すなわち、酸化還元種の濃度が低いほど溶存水素イオンの脱着波が大きく測定されることが考えられ、その結果、ｉ^(total)は初期的には酸化還元種がより低濃度において大きい値になると考えられる。

また、溶存水素イオンの脱着現象を考えたところ、酸化還元種の濃度が高いほど水分子が水素イオンに接近するのを酸化還元種により妨げられる程度が高いことが考えられる。そのため、見かけの水分子の拡散係数が低い状態であると考えることができる。
また、溶存水素イオンの脱着現象は非可逆的なものであり、現象が進行するといずれは脱着するイオンがなくなって脱着波もなくなることがわかっている。
これらのことより、酸化還元種の濃度が低いほど、もともと多く吸着していた溶存水素イオンが速やかに脱着し、消費される傾向を想定できる。

以上、酸化還元種が関与しない表面が相対的に多く露出しているため、低濃度において初期的な電流値が大きくなっていると考えられる。

よって、１０^-8Ｍ≦Ｃ^(Redox)≦１０^-10Ｍの濃度域でのαの傾向は、溶存水素イオンの脱着波が起因していることが考えられる。

つぎに、経過時間ｔにおける測定電流からｉ^(total)酸化還元種の濃度を求めることを検討した。

もし経過時間ｔにおける測定電流ｉ^(total)から酸化還元種の濃度Ｃ^(Redox)を求めたい場合、数１では不明なパラメータが右辺にαとの２つがあり、この式から求めることは不可能である。そこで、電流ｉ^(total)を別の経過時間においてもう一度測定し、
その上で２度の電流測定時間ｔ₁，ｔ₂における測定電流ｉ_t1 ^(total)、ｉ_t2 ^(total)について、ｉ_t1 ^(total)をｉ_t2 ^(total)で除することによりαを消すことができることを見出した。

具体的には、数７の式によって不明なパラメータのうちαを消すことによりＣ^(Redox)を一意的に求めることができることを見出した。

（数７）
ｉ_t1 ^(total)／ｉ_t2 ^(total) ＝
ｔ₁＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝／ｔ₂＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝

数７により、２度の電流測定時間ｔ₁，ｔ２における測定電流ｉ_t1 ^(total)、ｉ_t2 ^(total)から、一意的に酸化還元種の濃度Ｃ^(Redox)を求めることができるようになった。

図４に１０^-8Ｍ≦Ｃ^(Redox)≦１０^-10Ｍの濃度域で、ｔ₁＝１２０ｓｅｃ，ｔ₂＝３０ｓｅｃにおいて数７によって計算した計算値と、実際のデータから得られた電流値から計算した結果を示す。よく一致していることがわかり、この指標の有用性を実証できた。

なお、図１では表示していないが、経過時間ｔ₁，ｔ₂が３０ｓｅｃより短い場合はまだ試料の対流が収まっていないなどのノイズ要因が大きいことが考えられるため、避けたほうがよい。

また、ユーザが待機できることのできると思われる現実的な待機時間として、ｔ₁，ｔ₂が１２０ｓｅｃを超えないほうができれば好ましい。ただし、これは特に制限するものではない。

このことより、上記式が実際の実験における経時変化をよく再現することが実証された。すなわち、今までは困難とされてきた１０^-9Ｍから１０^-10Ｍの酸化還元種濃度の試料を数７による新しい指標によって定量可能となった。
さらにこれにより求めた仮説より、まず標準液を用いてこの方法で経時変化を示す式を確定し、未知の試料の測定を行った電流の印加時間ｔと観測電流ｉ^(total)から酸化還元種の濃度を求めることができることが実証された。

＜酸化還元種の換算係数Ｄ^(Redox)の算出実験＞
実験条件を以下に示す。試料は、ＰＢＳ溶液内に酸化還元種としてフェロセンモノカルボン酸をあらかじめＣ^(Redox)＝１０^-3Ｍに調製した５０ｍｌのものを用いた。電極は、半径１ｍｍのバルク用Ａｕ電極を用いた。なお、参照電極はＡｇ／ＡｇＣｌ飽和ＫＣｌ電極を用い、対極はコイル状の白金電極を用いた。サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）は室温（２５℃）において、ポテンショスタットを用いて行い、作用電極を０−０．６Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌｉｎ飽和ＫＣｌ）の範囲を０．０１Ｖ／ｓで１サイクルで掃引し、ピーク電流を求めた。

２５℃でのサイクリックボルタンメトリーの式は以下のようにＲａｎｄｌｅｓ−Ｓｅｖｃｉｋ式（数８）で表される。

（数８）
ｉ（ＣＶ）＝２６９Ａ^(Redox)ｎ^(3/2)Ｄ^(Redox)1/2Ｃ^(Redox)ｖ^1/2
ｉ（ＣＶ）：ピーク電流、ｖ：掃引速度

このときｉ（ＣＶ）＝１．２５×１０^-6Ａのピーク電流を観測した。
これから換算すると、Ｄ^(Redox)は１．２５×１０^-6（ｃｍ²／ｓｅｃ）と算出された。

本発明は、試料中に含まれる酸化還元種を含む被測定対象物の低濃度の量を定量する際に有用である。

１１酸化還元種濃度が１０^-6Ｍにおける電流実測値の経時変化プロット
１２酸化還元種濃度が１０^-7Ｍにおける電流実測値の経時変化プロット
１３酸化還元種濃度が１０^-8Ｍにおける電流実測値の経時変化プロット
１４酸化還元種濃度が１０^-9Ｍにおける電流実測値の経時変化プロット
１５酸化還元種濃度が１０^-10Ｍにおける電流実測値の経時変化プロット
２１酸化還元種濃度が１０^-6Ｍにおける数３の式による経時変化プロット
２２酸化還元種濃度が１０^-7Ｍにおける数３の式による経時変化プロット
２３酸化還元種濃度が１０^-8Ｍにおける数３の式による経時変化プロット
２４酸化還元種濃度が１０^-9Ｍにおける数３の式による経時変化プロット
２５酸化還元種濃度が１０^-10Ｍにおける数３の式による経時変化プロット
３３酸化還元種濃度が１０^-8Ｍにおける数５の式によるフィッティング経時変化プロット
３４酸化還元種濃度が１０^-9Ｍにおける数５の式によるフィッティング経時変化プロット
３５酸化還元種濃度が１０^-10Ｍにおける数５の式によるフィッティング経時変化プロット
４１数７の式による計算値
４２１２０ｓｅｃと３０ｓｅｃにおける電流実測値の比

Claims

微小くし型電極を用いて第１の電極に一定の酸化電位を印加し、第２の電極に一定の還元電位を印加するレドックスサイクルを用いた測定方法において、
前記第２の電極に還元電位を印加したときからの経時時間ｔ１における第１の電極と対極における電流ｉ_t1 ^(total)および
前記第２の電極に還元電位を印加したときからの経時時間ｔ２における第１の電極と対極における電流ｉ_t2 ^(total) を測定し、
あらかじめ定めた式から酸化還元種の濃度を算出する
ことを特徴とする測定方法であり、
前記式は経時時間ｔと酸化還元種の濃度Ｃ^(Redox)に下記の関係にある式であることを特徴とする酸化還元種濃度測定方法。
ｉ_t1 ^(total)／ｉ_t2 ^(total) ＝
ｔ１＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝／ｔ２＾（−１／｛１＋０．５×（１０＋ｌｏｇ（Ｃ^(Redox)）｝
前記ｔ１およびｔ２が３０秒から１２０秒の、それぞれ異なる経過時間であることを特徴とする請求項１記載の酸化還元種濃度測定方法。