CN104122312B - 一种生物电极及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物电极及其制备方法。所述生物电极包括绝缘外壳和电极线，所述电极线包括多个工作电极线、一个或多个参比电极线和对电极线，所述电极线侧表面包覆有绝缘蜡，树脂封装于绝缘外壳中，所述外壳尖端开口，其尖端开口口径在0.4mm至2mm之间，所述电极线的检测端通过所述开口与待测生物样本接触。其制备方法包括以下步骤：(1)将绝缘蜡溶解于易挥发的有机溶剂中得到绝缘液，均匀涂覆在电极线侧表面，待有机溶剂挥发；(2)将电极线同时插入绝缘外壳中，将树脂灌入外壳，固化后，将外壳尖端打磨光滑。本发明提供的生物电极，能同时同点载体检测多种信号，具有良好的机械性能，适用于活体检测，所述方法适应性强。

Description

一种生物电极及其制备方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种生物电极及其制备方法。

背景技术

传感检测技术在生物分析领域中发挥了重要的作用。目前，利用电化学传感器进行生物分子的离体检测与分析已较为成熟，将其用于生物活性物质的在体检测也引起了越来越多的研究者关注。目前已经有很多研究用电化学的方法检测生物体中的活性分子，例如用碳纤维电极检测植物在水胁迫下的过氧化氢含量变化[Ren Qiong-qiong,etal.Biosensors and bioelectronics,2013,50:318-324]，利用铂微电极检测老鼠肾脏中的NO含量[Youngmi Lee,et al.Analytical chemistry,2007,79:7665-7675]，利用硼掺杂金刚石微电极检测胃部pH变化[Stéphane Fierro,et al.Scientific reports,2013,3:3257]等。对研究生物体的生理、病理机制具有很重要的意义。

目前，活体检测电极，不能在微型化的前体下，保证机械强度，因此检测多种物质时，要么先后检测，要么采取不同的检测位点，尤其是在植物中，难以做到同时同点检测。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种生物电极，其目的在于通过将多个工作电极线和参比电极线、对电极线集成在小尺寸生物电极上，由此解决现有技术不能实现同时同点多种生物信号同时在体检测的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种生物电极，包括绝缘外壳和电极线，所述电极线包括多个工作电极线、一个或多个参比电极线和对电极线，所述电极线侧表面包覆有绝缘蜡，树脂封装于绝缘外壳中，所述外壳尖端开口，其尖端开口口径在0.4mm至2mm之间，所述电极线的检测端通过所述开口与待测生物样本接触。

优选地，所述生物电极，其包括三个工作电极线。

优选地，所述生物电极，其三个工作电极线分别为第一工作电极线、第二工作电极线和第三工作电极线；其中：

第一工作电极线，用于电流测量，获得过氧化氢浓度；

第二工作电极线，用于电流测量，获得一氧化氮浓度；

第三工作电极线，用于电位测量，获得pH值。

优选地，所述生物电极，其第一工作电极线为铂丝；所述第二工作电极线为铂丝，其检测端表面电化学沉积有铂颗粒；所述第三工作电极线为金丝，其检测端表面电化学沉积有氧化铱颗粒。

优选地，所述生物电极，其包括两个参比电极线。

优选地，所述生物电极，其两个参比电极线分别为第一参比电极线、第二参比电极线；其中：

第一参比电极线，用作电流测量参比电极；

第二参比电极线，用作电位测量参比电极。

优选地，所述生物电极，其两个参比电极线为银丝，其检测端表面电化学沉积有氯化银颗粒。

优选地，所述生物电极，其电极线检测端表面覆盖有抗干扰层，所述抗干扰层优选为Nafion膜、纤维素膜或聚四氟乙烯膜。

按照本发明的另一方面，提供了一种所述的生物电极的制备方法，包括以下步骤：

(1)电极线绝缘：将绝缘蜡溶解于易挥发的有机溶剂中，得到绝缘液，将绝缘液均匀涂覆在电极线侧表面，待有机溶剂挥发，制得侧表面绝缘的电极线；

(2)电极线集成固定：将步骤(1)中获得的侧表面绝缘的电极线同时插入绝缘外壳中，将树脂灌入外壳，固化后，将外壳尖端打磨光滑，即获得所述生物电极；

优选地，所述制备方法，还包括以下步骤：

(3)电极线检测端修饰：将步骤(2)中获得的生物电极通过电化学的方法，将电极线表面分别进行电化学修饰。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

(1)本发明通过将多个工作电极集成到一个电极上，可同时检测多种不同的信号，由于检测是同时完成，并且是在同一位置做出的检测，因此多个信号之间不会出现时间和空间差异，检测结果为同时同点，可靠性高；

(2)本发明提供的生物电极，检测端尺寸小、机械强度高，可用于生物体活体检测；

(3)本发明提供的生物电极的制备方法，可根据不同的检测需要，制备用于检测多种生物信号的集成电极，适应性强。

附图说明

图1是实施例1中制备的生物电极结构示意图；

图2是实施例2中制备的生物电极尖端扫描电镜图；

图3是实施例2中利用循环伏安法在微电极上电沉积铂微粒的伏安图；

图4是实施例2中电位阶跃法电镀氧化铱颗粒的电位图；

图5是实施例2中计时电流法电沉积氯化银颗粒，电位为0.5V,溶液为0.5M氯化钾溶液；

图6是实施例3中30μM的H₂O₂和NO分别在第一工作电极线上不同电位下的响应电流；

图7是实施例3中30μM的H₂O₂和NO分别在第二工作电极线上不同电位下的响应电流；

图8是实施例3第三工作电极线在pH为2～10的不同标准缓冲液中的电势响应；

图9是实施例3中第一工作电极对不同的活性物质的抗干扰能力；

图10是实施例3中第二工作电极对不同的活性物质的抗干扰能力；

图11是实施例3中油菜受旱胁迫和未受旱胁迫时的H₂O₂、NO和pH变化。

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1为第一工作电极线，2为第二工作电极线，3为第三工作电极线，4为导电胶，5为绝缘外壳，6为对电极线，7为第一参比电极线，8为第二参比电极线，9为绝缘蜡，10为树脂，11为铜线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的生物电极，包括绝缘外壳和电极线，所述电极线包括多个工作电极线、一个或多个参比电极线和对电极线，所述电极线侧表面包覆有绝缘蜡，树脂封装于绝缘外壳中，所述外壳尖端开口，其尖端开口口径在0.4mm至2mm之间，所述电极线的检测端通过所述开口与待测生物样本接触。绝缘外壳优选采用聚丙烯材料，在微型化的前提下，保证机械强度。树脂封装优选环氧树脂，保证绝缘性能和机械强度。绝缘外壳尖端开口口径太小，则电极线过细导致信号不稳定；绝缘外壳尖端开口过大，则检测位点差异较大，并且不适合做较小的生物组织样本检测。

所述生物电极包括三个工作电极线，分别为第一工作电极线、第二工作电极线和第三工作电极线；其中：

第一工作电极线(WE1)，用于电流测量，获得过氧化氢浓度，优选为铂丝；

第二工作电极线(WE2)，用于电流测量，获得一氧化氮浓度，优选为铂丝，其检测端表面电化学沉积有铂颗粒；

第三工作电极线(WE3)，用于电位测量，获得pH值，优选为金丝，其检测端表面电化学沉积有氧化铱颗粒。

所述生物电极包括两个参比电极线分别为第一参比电极线、第二参比电极线，优选为银丝，其检测端表面电化学沉积有氯化银颗粒；其中：

第一参比电极线(RE1)，用作电流测量参比电极；

第二参比电极线(RE2)，用作电位测量参比电极。

所述对电极线(CE)为铂丝。

所述电极线检测端表面覆盖有抗干扰层，常用抗干扰层为Nafion膜、纤维素膜或聚四氟乙烯膜，优选为Nafion膜。

本发明提供的生物电极的制备方法，包括以下步骤：

(1)电极线绝缘：将绝缘蜡溶解于易挥发的有机溶剂中，得到绝缘液，将绝缘液均匀涂覆在电极线侧表面，待有机溶剂挥发，制得侧表面绝缘的电极线；优选的绝缘液为阿皮松蜡与有机溶剂二氯甲烷以1:1(w/v)混合的溶液，阿皮松蜡绝缘性能良好，且分布均匀，不会聚集成团，能保证结构紧凑，适用于本发明提供的生物电极。

(2)电极线集成固定：将步骤(1)中获得的侧表面绝缘的电极线同时插入绝缘外壳中，将树脂灌入外壳，固化后，将外壳尖端打磨光滑，即获得所述生物电极。

优选地，采用环氧树脂进行电极线集成，其操作步骤为：环氧树脂与乙二胺以质量比100:6.5的比例混合，并进行超声除泡；将除泡处理的环氧树脂溶液灌入绝缘外壳中；30℃干燥过夜。

优选地，外壳尖端打磨操作如下：将固化后的生物电极尖端分别在1μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝浆中打磨，并分别在水、稀硝酸、水中超声5分钟。

(3)电极线检测端修饰：将步骤(2)中获得的生物电极通过电化学的方法，将电极线表面分别进行电化学修饰，修饰后的电极尖端包覆抗干扰膜，常用如Nafion膜、纤维素膜或聚四氟乙烯膜，优选为Nafion膜。

对集生物电极进行修饰，制成针对不同物质的同时检测三种活性物质的生物电极，用于生物的在体检测。例如利用邻苯二胺修饰电镀有铂微粒的铂盘电极，制成过氧化氢传感器，检测植物体内受到致病因子侵染后产生的过氧化氢；利用依次利用导电聚合物(poly-TTCA)和细胞色素C修饰铂电极，能在体检测小鼠脑内的NO含量等。

以下为实施例：

实施例1

一种生物电极，如图1所示，包括绝缘外壳和电极线，所述电极线包括三个工作电极线、两个参比电极线和对电极线，所述电极线侧表面包覆有阿皮松蜡，环氧树脂封装于绝缘外壳中，所述外壳尖端开口，其尖端开口口径为1mm，所述电极线的检测端通过所述开口与待测生物样本接触，绝缘外壳采用聚丙烯材料。

所述生物电极三个工作电极线，分别为第一工作电极线、第二工作电极线和第三工作电极线；其中：

第一工作电极线，用于电流测量，为铂丝，直径50μm，长度4cm；

第二工作电极线，用于电流测量，为铂丝，直径50μm，长度4cm；

第三工作电极线，用于电位测量，为金丝，直径50μm，长度4cm。

所述两个参比电极线分别为第一参比电极线、第二参比电极线，为银丝，直径100μm，长度4cm；其中：

第一参比电极线，用作电流测量参比电极；

第二参比电极线，用作电位测量参比电极。

所述对电极线为铂丝，直径100μm，长度4cm。

所述生物电极的制备方法，包括以下步骤：

(1)电极线绝缘：将阿皮松蜡与有机溶剂二氯甲烷以1:1(w/v)混合，得到绝缘液，将绝缘液均匀涂覆在所有六根电极线表面，待有机溶剂挥发，制得侧表面绝缘的电极线。阿皮松蜡与有机溶剂二氯甲烷以1:1(w/v)混合溶液，挂浆性能良好，涂布均匀，推荐为优选绝缘液。

(2)电极线集成固定：将步骤(1)中获得的侧表面绝缘的电极线同时插入绝缘外壳中，将树脂灌入外壳，固化后，将外壳尖端打磨光滑，即获得所述生物电极。

采用环氧树脂进行电极线集成，其操作步骤为：环氧树脂与乙二胺以质量比100:6.5的比例混合，并进行超声除泡；将除泡处理的环氧树脂溶液灌入绝缘外壳中；30℃干燥过夜。

外壳尖端打磨操作如下：将固化后的生物电极尖端分别在1μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝浆中打磨，并分别在水、稀硝酸、水中超声5分钟，得到的生物电极干净尖端表面干净平整。

实施例2

一种生物电极，如图2所示，包括绝缘外壳和电极线，所述电极线包括三个工作电极线、两个参比电极线和对电极线，所述电极线侧表面包覆有阿皮松蜡，环氧树脂封装于绝缘外壳中，所述外壳尖端开口，其尖端开口口径为1mm，所述电极线的检测端通过所述开口与待测生物样本接触，绝缘外壳采用聚丙烯材料。

所述生物电极三个工作电极线，分别为第一工作电极线、第二工作电极线和第三工作电极线；其中：

第一工作电极线，用于电流测量，获得过氧化氢浓度，为铂丝，直径50μm，长度4cm；

第二工作电极线，用于电流测量，获得一氧化氮浓度，为铂丝，其检测端表面电化学沉积有铂颗粒，直径50μm，长度4cm；

第三工作电极线，用于电位测量，获得pH值，为金丝，其检测端表面电化学沉积有氧化铱颗粒，直径50μm，长度4cm。

所述两个参比电极线分别为第一参比电极线、第二参比电极线，为银丝，直径100μm，长度4cm，其检测端表面电化学沉积有氯化银颗粒；其中：

第一参比电极线，用作电流测量参比电极；

第二参比电极线，用作电位测量参比电极。

所述对电极线为铂丝，直径100μm，长度4cm。

所述电极线检测端表面覆盖有Nafion膜抗干扰层。

利用实施例1中制备的本实施例中修饰生物电极，方法如下：

(3)电极线检测端修饰：将步骤实施例1中获得的生物电极通过电化学的方法，将电极线表面分别进行电化学修饰，修饰后的电极尖端包覆Nafion膜抗干扰膜。具体操作步骤如下：

1)将所述生物电极在含有2mmol/L氯铂酸钾(K₂PtCl₆)0.5mol/L硫酸(H₂SO₄)的溶液中利用循环伏安法在WE2中的敏感区域第二工作电极线检测端上电沉积铂微颗粒，用仪器CHI660A记录到电化学方法电沉积铂微粒，如图3所示。可见随着循环扫描次数的增加，氧化还原电流不断增大，说明了由于铂微粒在第二工作电极检测端上的不断沉积，工作电极的有效表面积逐渐增大。该电极可以作为一氧化氮检测电极。

2)将所述生物电极在制备好的氧化铱溶液中，利用0.6V到0.7V的电位阶跃的方法在WE3中的敏感区域第三工作电极线检测端上电沉积氧化铱颗粒。用仪器CHI660A记录到电化学方法电沉积氧化铱微粒，如图4所示。可见随着脉冲次数的增加，电流不断增大，说明了由于氧化铱微粒在第三工作电极线检测端上的不断沉积，工作电极的有效表面积逐渐增大。该电极可以作为pH检测电极。

3)将所述生物电极在0.5M的KCl溶液中，利用计时电流法法，分别在第一、第二参比电极检测端电沉积AgCl，制成Ag/AgCl参比电极。用仪器CHI660A记录到电沉积AgCl的过程，如图5，可以看出随着时间增加电流逐渐减小，说明AgCl颗粒逐渐沉积在第一、第二参比电极检测端。

4)上述经电化学修饰的生物电极浸入5％的Nafion溶液中10秒后拿出，空气中干燥。得到能同时检测过氧化氢、一氧化氮和pH的微阵列。其中WE1用来检测过氧化氢，WE2用来检测一氧化氮，WE3用来检测pH；WE1和WE2共用CE和RE1，WE3单独使用RE2。

这种电化学传感微阵列经过扫描显微镜100倍放大后，对其进行观察，如图2所示。可以清晰的看到密封在聚丙烯外壳中的3个50μm，3个100μm的电极检测端，先分别密封在绝缘蜡中后密封在环氧树脂中。其中3个50μm电极线检测端分别是WE1,WE2，WE3，3个100μm电极线检测端分别是RE1,RE2，CE。

所述生物电极，通过导电胶与电化学检测装置的导电铜线相连，即组成生物传感器，可用于同时在体检测过氧化氢浓度、一氧化氮浓度和pH值。

实施例3

利用实施例2中制备的生物电极同时实时的在体检测植物受到旱胁迫后所产生的过氧化氢、一氧化氮和pH变化

A、实施例2中制备的生物电极对H₂O₂、NO和pH的电化学响应。

为确定WE1和WE2上的最佳工作电压，我们记录了在一系列不同的电位下这两个电极线对30 uM的H₂O₂和NO的响应电流。如图6，在0～0.8V范围内，WE1对H₂O₂的响应电流在0.6V时达到最大值。但是当电位小于等于0.4V时，WE1对NO没有响应。考虑到WE1的灵敏度和选择性，0.4V被用来做WE1的工作电压。如图7，对于WE2，在0～0.8V范围内，响应电流随着电位的增加而增大；然而WE2在0.4V时对H₂O₂有最大响应电流。因此0.8V被选择最为WE2的工作电压。

我们发现WE1对NO是没有响应的，所以WE1上的电流只由H₂O₂的电化学氧化提供，可以与H₂O₂的浓度直接对应。WE1测得的电流可以用方程1表达如下：

其中I是电流(A)，S是灵敏度(A/M)，C是浓度(M)，下标代表相应的电极或底物。

当NO和H₂O₂同时存在，WE2上测得的电流不仅由氧化NO提供还有H₂O₂的氧化电流。WE2的电流可以由方程2表示如下：

我们又检测该生物电极对pH的响应，结果如图8所示。WE3在一系列从2到10的标准pH缓冲溶液中，得到斜率为51±1.4mV/pH的近似能斯特响应。表明该生物电极对pH有很好的电势响应

B、我们检测该生物电极的选择性，如图9、10，结果显示，WE1和WE2对AA,NaNO₂,OH^-和H⁺没有电流响应；如表1，WE3对Na⁺,K⁺,Mg⁺,Ca²⁺和NH⁴⁺有4.33到5.6mV的很小的电位漂移，对应0.0849到0.109的pH漂移。这些小的漂移和之前报道的基本相同并且被认为是可以忽略的[A.N.Bezbaruah,et al.Analytical chemistry,2002,74:5726-5733]。

C、利用该生物电极进行植物的在体检测。

首先将该生物电极插入植物的叶脉中，对WE1，WE2进行计时电流法检测，二者公用CE，RE1。其中WE1施加0.4V电位，WE2施加0.8V电位。同时对WE3进行电势测定，WE3与RE2构成独立回路。如图11，可以看出，植物在没有施加旱胁迫时，微阵列对NO,H₂O₂和pH的响应在48小时内保持不变。在旱胁迫的情况下，氧爆发(OB)在20.8小时开始缓慢增加，从38.8小时开始以较快的速度增加直至检测在48小时结束时。在旱胁迫的条件下，H₂O₂的含量在48.3小时时增加了2.5μM，这个结果与之前的报道基本相符[Sangmin Lee,et al.The plantjournal,2012,70:831-844][Devarshi S.Selote,et al.Protoplasma,2010,245:153-163]。在旱胁迫的条件下，NO在9.7小时开始被检测到，在11小时和22小时分别形成两个比较大的峰，这两个峰分别持续2.3小时和5.58小时。在旱胁迫的条件下，NO的含量在11小时时增加了3.1μM，在22小时时增加了2.6μM。植物在旱胁迫的情况下NO的积累与之前的报道一致[Xinshao Rui,et al.Journal of Plant Physiology,2010,167:472-479]。在旱胁迫的条件下，开环电位在18.7小时开始增加，在47.9小时达到最大值。最大的电位变化为55.2mV，对应的是油菜茎中的pH增加了1.08。这个结果与之前的报道0.5～1.1是相符的[Gollan T,et al.Plant,Cell and environment,1992,15(5):551-559]。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于同时同点多种生物信号测量的生物电极，其特征在于，包括绝缘外壳和电极线，所述电极线包括三个工作电极线、一个或多个参比电极线和对电极线，所述电极线侧表面包覆有绝缘蜡，树脂封装于绝缘外壳中，所述外壳尖端开口，其尖端开口口径在0.4mm至2mm之间，所述电极线的检测端通过所述开口与待测生物样本接触，所述三个工作电极线分别为第一工作电极线、第二工作电极线和第三工作电极线；其中：

第一工作电极线，用于电流测量，获得过氧化氢浓度；

第二工作电极线，用于电流测量，获得一氧化氮浓度；

第三工作电极线，用于电位测量，获得pH值。

2.如权利要求1所述的生物电极，其特征在于，所述第一工作电极线为铂丝；所述第二工作电极线为铂丝，其检测端表面电化学沉积有铂颗粒；所述第三工作电极线为金丝，其检测端表面电化学沉积有氧化铱颗粒。

3.如权利要求1所述的生物电极，其特征在于，包括两个参比电极线。

4.如权利要求3所述的生物电极，其特征在于，所述两个参比电极线分别为第一参比电极线、第二参比电极线；其中：

第一参比电极线，用作电流测量参比电极；

第二参比电极线，用作电位测量参比电极。

5.如权利要求4所述的生物电极，其特征在于，所述两个参比电极线为银丝，其检测端表面电化学沉积有氯化银颗粒。

6.如权利要求1至5任意一项所述的生物电极，其特征在于，所述电极线检测端表面覆盖有抗干扰层。

7.如权利要求6所述的生物电极，其特征在于，所述抗干扰层为Nafion膜、纤维素膜或聚四氟乙烯膜。

8.如权利要求1至7任意一项所述的生物电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)电极线绝缘：将绝缘蜡溶解于易挥发的有机溶剂中，得到绝缘液，将绝缘液均匀涂覆在电极线侧表面，待有机溶剂挥发，制得侧表面绝缘的电极线；

(2)电极线集成固定：将步骤(1)中获得的侧表面绝缘的电极线同时插入绝缘外壳中，将树脂灌入外壳，固化后，将外壳尖端打磨光滑，即获得所述生物电极。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：

(3)电极线检测端修饰：将步骤(2)中获得的生物电极通过电化学的方法，将电极线表面分别进行电化学修饰。