CN103472153B

CN103472153B - 辣椒原料及其制品中罗丹明b的检测方法

Info

Publication number: CN103472153B
Application number: CN201310438428.XA
Authority: CN
Inventors: 焦军伟; 文雁君; 李林正; 李轩; 黄振宇; 马国辉
Original assignee: HENAN KEEN BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: HENAN ZHONGDA BIOLOGICAL ENGINEERING CO.,LTD.
Priority date: 2013-09-24
Filing date: 2013-09-24
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-09-24
Also published as: CN103472153A

Abstract

本发明提供了一种辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法，将待测样品用体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷溶解，超声提取、定容、过膜后得到待净化液；待净化液用GPC净化后得到待测液；待测液进行HPLC-荧光检测，检测参数为：C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，柱温30℃～35℃；激发波长548～552nm，发射波长578～582nm；流动相A相0.1%～1.5%体积百分数的酸的水溶液，B相0.1%～1.5%体积百分数的酸的乙腈溶液，流速1.0mL/min；梯度洗脱程序0～20min，B相的体积百分数由40%至90%，20～26min，B相的体积百分数由90%至0%；酸的种类为甲酸或乙酸。

Description

辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法。

背景技术

罗丹明B又名罗丹明610、玫瑰红B、蕊香红B、若丹明B、玫瑰精B等，英文名：Rhodamine B，是一种偶氮类碱性人工合成工业染料，分子式：C₂₈H₃₁C_lN₂O₃，分子量：479.0175,CAS号为81-88-9，结构式如式（I）所示。性状为绿色结晶或红紫色粉末，易溶于水、乙醇，成玫瑰红色溶液，鲜艳美观，稀释时有荧光，微溶于丙酮、氯仿、盐酸和氢氧化钠溶液。常用于实验室中细胞荧光染色剂、工业染料。

罗丹明B2008年被国家列为第一批“食品中可能添加的非食用物质名单”之一，国际食品研究署（IARC）化学品致癌风险评价表明：摄取、吸入以及皮肤接触该物质均会造成急性和慢性的中毒危害。同时，有动物实验表明，该物质吸入时由致癌作用，可引起诱变或致畸。

但由于罗丹明B具有持久鲜艳的颜色特性，易于在辣椒制品上染色且不易褪色，成本低，因此一些不法商贩用罗丹明染料对这些食品进行染色、以次充好、以假冒真，欺骗消费者，危害消费者的身体健康。2011年重庆市查出上万斤含罗丹明B的毒花椒，市场上也不断查出多种食品中非法添加罗丹明B。

现有的食品中罗丹明B的检测方法主要有SN/T2430-2010国标的方法，但该方法采用的仪器为超高压液相色谱仪，价格昂贵，不适合普通企业使用。如果采用普通液相色谱仪，将会受到柱压等参数的限制，并且在检测辣椒红等样品时容易出现分离度不高、分离效果差的现象。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法，本发明提供的辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法降低了色谱仪对于自身参数的要求，特别是对于柱压的限制，分离度高、检测精度高、定量限低。

一种辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法，包括以下步骤：

A）将待测样品用体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷溶解，超声提取、定容、过膜后得到待净化液；

B）将待净化液用GPC净化后得到待测液；

C）将待测液进行HPLC-荧光检测，检测参数如下：

色谱柱为C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，柱温为30℃～35℃，

激发波长548～552nm，发射波长578～582nm；

流动相A相为0.1%～1.5%体积百分数的酸的水溶液，流动相B相为0.1%～1.5%体积百分数的酸的乙腈溶液，流动相流速为1.0mL/min；梯度洗脱程序为0min～20min，B相的体积百分数由40%至90%，20min～26min，B相的体积百分数由90%至0%；

所述酸的种类为甲酸或乙酸。

优选的，所述待测样品的质量和乙酸乙酯-环己烷的体积比为1g～2g：25mL。

优选的，所述柱温为35℃。

优选的，所述激发波长550nm，发射波长580nm。

优选的，所述酸的种类为甲酸。

优选的，所述酸的体积百分数为0.1%。

优选的，所述GPC净化具体为：将待净化液至于GPC样品管中，设置GPC净化参数进行净化，收集洗脱液，蒸发至干，残渣用甲醇溶解，得到待测液。

优选的，所述GPC净化参数具体为：凝胶柱为200mm×20mm；色谱柱填料粒度为74～148μm；流动相为体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷；流速为5mL/min；收集时间为7min～19min。

优选的，所述步骤C中罗丹明B的定量采用标准曲线法。

优选的，所述步骤A中超声提取的提取时间为5min～15min。

与现有技术相比，本发明提供了一种辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法，包括以下步骤：将待测样品用体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷溶解，超声提取、定容、过膜后得到待净化液；将待净化液用GPC净化后得到待测液；将待测液进行HPLC-荧光检测，检测参数如下：色谱柱为C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，柱温为30℃～35℃；激发波长548～552nm，发射波长578～582nm；流动相A相为0.1%～1.5%体积百分数的酸的水溶液，流动相B相为0.1%～1.5%体积百分数的酸的乙腈溶液，流动相流速为1.0mL/min；梯度洗脱程序为0min～20min，B相的体积百分数由40%至90%，20min～26min，B相的体积百分数由90%至0%；所述酸的种类为甲酸或乙酸。本发明提供的罗丹明B的检测方法采用常规的C18，4.6μm大内径的柱子进行检测，不仅使用方便，适用性强，同时降低了对于液相色谱仪仪器自身技术参数的要求，特别是柱压的限制；采用本发明的流动相以及梯度洗脱程序更有利于目标峰与干扰峰的分离，提高了检测精度和分离度。并且本发明提供的辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法定量限低，仅为1.0μg/kg。实验结果表明，本发明提供的辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法精密度高、重现性好、稳定性高、准确度好。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的0.3μg/kg的罗丹明B标准品的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例1提供的试剂空白高效液相色谱图；

图3为本发明实施例7提供的不含罗丹明B的样品的高效液相色谱图；

图4为本发明实施例7提供的添加罗丹明B标准品的辣椒红样品的高效液相色谱图；

图5为本发明实施例8提供的辣椒红样品中罗丹明B的高效液相色谱图；

图6是本发明比较例1提供的辣椒红样品中罗丹明B的高效液相色谱图。

具体实施方式

B）将待净化液用GPC净化后得到待测液；

C）将待测液进行HPLC-荧光检测，检测参数如下：

色谱柱为C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，柱温为30℃～35℃，

激发波长548～552nm，发射波长578～582nm；

所述酸的种类为甲酸或乙酸。

本发明首先将待测样品用体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷溶解，超声提取、定容、过膜后得到待净化液。具体为将待测样品置于容量瓶中，用体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷溶解，超声提取、定容、过膜后得到待净化液。所述超声提取的时间优选为5min～15min。所述样品可以为辣椒原料及其制品，如辣椒、辣椒颗粒、辣椒红或辣椒油树脂。所述过膜优选为过0.45μm或0.22微米的微孔滤膜，更优选为过0.45μm的微孔滤膜。本发明对于所述超声仪器的厂家的型号并无限制，本领域技术人员熟知的厂家和型号即可。所述乙酸乙酯和环己烷优选为色谱纯，市售即可。所述待测样品的质量和乙酸乙酯-环己烷的体积比优选为1g～2g：25mL。

在本发明中，通过上述前处理可以使得样品中罗丹明B得到有效的提取，以便于后续检测。

得到待净化液后，将待净化液用GPC净化后得到待测液。所述GPC净化具体为：将待净化液置于GPC样品管中，设置GPC净化参数进行净化，收集洗脱液，蒸发至干，残渣用甲醇溶解，得到待测液。所述蒸发优选为使用旋转蒸发仪蒸发。所述甲醇优选为色谱纯、市售。所述GPC净化参数优选为：凝胶柱为（柱床）200mm×20mm；色谱柱填料粒度为74～148μm；流动相为体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷；流速为5mL/min；收集时间为7min～19min。

得到待测液后，将待测液进行HPLC-荧光检测，检测参数如下：

色谱柱为C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，柱温为30℃～35℃，

激发波长548～552nm，发射波长578～582nm；

所述酸的种类为甲酸或乙酸。

在本发明中，所述检测参数优选为：

色谱柱为C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，柱温为35℃，

激发波长550nm，发射波长580nm；

流动相A相为0.1%～1.5%体积百分数的酸的水溶液，流动相B相为0.1%体积百分数的酸的乙腈溶液，流动相流速为1.0mL/min；梯度洗脱程序为0min～20min，B相的体积百分数由40%至90%，20min～26min，B相的体积百分数由90%至0%；所述酸的种类为甲酸。在本发明的实施例中，采用上述优选参数对罗丹明B标准品以及样品进行测定。

对柱温的选择需考虑待分离物质本身的特性，柱温影响流动相对待测物质的溶解度也会影响柱压。一般情况下，提高柱温有利于提高分离度，但温度过高会导致柱压过低，不利于物质的分离。

本发明选择C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，市售上述条件的色谱柱皆适用于本方法。

在本发明中，采用上述方法可以使得样品中辣椒红色素得到有效的分离，避免影响罗丹明Ｂ的测定结果，使得结果更加的准确。

在本发明中，罗丹明B的定量优选采用标准曲线法。具体为：准确称取罗丹明B标准品适量，加入甲醇溶解，配置成标准品母液。再取母液分别稀释，按照上述优选测定参数条件进行测定，以测得峰面积为纵坐标，进样浓度(μg/kg)为横坐标绘制标准曲线。

在本发明中，所用仪器优选为：

岛津LC-20A 高效液相色谱仪荧光检测器

凝胶色谱净化系统Accuprep(J2);

发明提供的罗丹明B的检测方法采用常规的C18，4.6μm大内径的柱子进行检测，不仅使用方便，适用性强，同时降低了对于液相色谱仪仪器自身技术参数的要求，特别是柱压的限制；采用本发明的流动相以及梯度洗脱程序更有利于目标峰与干扰峰的分离，提高了检测精度和分离度。并且本发明提供的辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法最低检出限（S/N＞3）为0.3μg/kg，定量限（S/N＞10）为1.0μg/kg。实验结果表明，本发明提供的辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法精密度高、重现性好、稳定性高、准确度好。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法进行详细描述。

实施例1

取罗丹明B标准品适量，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇制成每1kg含罗丹明B100μg作为标准品母液。4℃冰箱中保存，备用。

分别取标准品母液稀释至0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg，按照上述测定条件依次进样进行测定。以测得峰面积为纵坐标，进样浓度(μg/kg)为横坐标绘制标准曲线。同时做试剂空白对照。其结果如下：标注曲线为Y=0.0000504952X+0，R²=0.99998，线性范围为0.5μg/kg～20μg/kg。

将罗丹明B标准曲线工作液依次稀释成0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.3μg/kg、0.4μg/kg、0.5μg/kg，分别按照上述测定条件进行检测，并计算信噪比，结果表明，本发明检测方法的最低检出限（S/N＞3）为0.3μg/kg，定量限（S/N＞10）为1.0μg/kg。其中，图1为本发明实施例1提供的0.3μg/kg的罗丹明B标准品的高效液相色谱图。图2为本发明实施例1提供的试剂空白高效液相色谱图。

实施例2

采用实施例1提供的罗丹明B标准曲线工作液10μg/kg，在上述测定条件下连续进样6次，每次10μL，记录罗丹明B的峰面积，计算相对标准偏差，结果如表1所示，表1为本发明提供的罗丹明B检测方法的精密度。

表1本发明提供的罗丹明B检测方法的精密度

结果显示，采用本发明提供的方法连续测定6次检测罗丹明B相对标准偏差（RSD）不超过1%，表明本发明提供的方法具有良好的精密度。

实施例3

精密称取7份含罗丹明B的辣椒红样品1.0000g于25mL容量瓶中，然后加入20mL乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液，超声提取5min后，用乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液定容。取10mL溶液过0.45μm微孔滤膜后作待净化液。

取5mL待净化液于GPC样品管中，用GPC按照上述净化条件进行净化，收集洗脱液，并蒸发至干。残渣用2.0mL甲醇溶解后，得到待测液，供HPLC-荧光测定。

按照上述测定条件对上述待测液分别进样10μL测定，结果如表2所示，表2为本发明提供的罗丹明B检测方法的重复性。

表2本发明提供的罗丹明B检测方法的重复性

结果显示，采用本发明提供的方法，7次检测中罗丹明B含量的RSD值为1.33，表明本发明提供的方法具有良好的重复性。

实施例4

精密称取含罗丹明B的辣椒红样品10.0000g于100mL容量瓶中，然后加入20mL乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液，超声提取5min后，用乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液定容。分别间隔0h、2h、4h、8h、12h、16h、24h重复测定。测定时每次取10mL溶液过0.45μm微孔滤膜后作待净化液。

按照上述测定条件对上述待测液分别进样10μL测定，结果如表3所示，表3为本发明提供的罗丹明B检测方法的稳定性。

表3本发明提供的罗丹明B检测方法的稳定性

结果显示，采用本发明提供的方法，连续检测放置24小时内罗丹明B的相对标准偏差不足1%，表明本发明提供的方法在24h内具有良好的稳定性。

实施例5

分别精密称取6份不含罗丹明B的辣椒红样品1.0000g于50mL容量瓶中，分别加入1mL100μg/kg的罗丹明B标准溶液，同时做一份空白样品，然后加入20mL乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液，超声提取5min后，用乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液定容至50mL。取10mL溶液过0.45μm微孔滤膜后作待净化液。

按照上述测定条件对上述待测液分别进样10μL测定，样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围之内，应进行适当稀释后测定。加标样品测定值减去空白样品测定结果为最终结果，结果如表4所示，表4为本发明提供的罗丹明B检测方法的加标回收率。

实施例6

分别精密称取6份不含罗丹明B的辣椒红样品1.0000g于25mL容量瓶中，分别加入1mL100μg/kg的罗丹明B标准溶液，同时做一份空白样品，然后加入20mL乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液，超声提取5min后，用乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液定容至25mL。取10mL溶液过0.45μm微孔滤膜后作待净化液。

实施例7

分别精密称取6份不含罗丹明B的辣椒红样品1.0000g于10mL容量瓶中，分别加入0.8mL100μg/kg的罗丹明B标准溶液，同时做一份空白样品，然后加入8mL乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液，超声提取5min后，用乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液定容至10mL。取10mL溶液过0.45μm微孔滤膜后作待净化液。

按照上述测定条件对上述待测液分别进样10μL测定，样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围之内，应进行适当稀释后测定。加标样品测定值减去空白样品测定结果为最终结果，结果如表4所示，表4为本发明提供的罗丹明B检测方法的加标回收率。其中，图3为本发明实施例7提供的不含罗丹明B的样品的高效液相色谱图；图4为本发明实施例7提供的添加罗丹明B标准品的辣椒红样品的高效液相色谱图。

表4本发明提供的罗丹明B检测方法的加标回收率

结果表明，本发明提供的方法具有良好的准确度，回收率高。

实施例8

精密称取辣椒红样品1.0000g于25mL容量瓶中，然后加入20mL乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液，超声提取5min后，用乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液定容至10mL。取10mL溶液过0.45μm微孔滤膜后作待净化液。

按照上述测定条件对上述待测液分别进样10μL测定，样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围之内，应进行适当稀释后测定。其中，图5为本发明实施例8提供的辣椒红样品中罗丹明B的高效液相色谱图。

比较例1

采用本发明的高效液相色谱仪配荧光检测器，若使用SN/T2430-2010的条件进行测定，流动相流速为0.8mL/min时，仪器会显示超压状态。固本比较例采用降低流速、避免超压的方式，流速设置为0.4mL/min，其余参数不变。

具体步骤如下：

精密称取辣椒红2.0000g样品于25mL容量瓶中，标准溶液，然后加入20mL乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液，超声提取5min后，用乙酸乙酯-环己烷（V/V,1：1）溶液定容。取15mL溶液过0.22μm微孔滤膜后作待净化液。

取10mL待净化液于GPC样品管中，用GPC按照上述净化条件进行净化，收集洗脱液，于40℃下旋转蒸发至干。残渣用1.0mL甲醇溶解后过0.22μm微孔滤膜后，得到待测液，供HPLC-荧光测定。

测定条件：色谱柱：C18柱，2.1mm（内径）×150mm,5μm；流速0.40mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；激发波长（E_X）550nm，发射波长（E_m）580nm；流动相：甲醇-水，梯度洗脱程序如表5，表5SN/T2430-2010流动相梯度洗脱程序。

表5SN/T2430-2010流动相梯度洗脱程序

测定结果见图6，图6是本发明比较例1提供的辣椒红样品中罗丹明B的高效液相色谱图，由图6可以看出，采用普通高效液相色谱仪配荧光检测器，国标的方法仅仅降低了流速的情况下，样品分离不完全，分离度不高，分离效果差。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种辣椒原料及其制品中罗丹明B的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)将待测样品用体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷溶解，超声提取、定容、过膜后得到待净化液；

B)将待净化液用GPC净化后得到待测液；

C)将待测液进行HPLC-荧光检测，检测参数如下：

色谱柱为C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，柱温为30℃～35℃，

激发波长548～552nm，发射波长578～582nm；

流动相A相为0.1％～1.5％体积百分数的酸的水溶液，流动相B相为0.1％～1.5％体积百分数的酸的乙腈溶液，流动相流速为1.0mL/min；梯度洗脱程序为0min～20min，B相的体积百分数由40％至90％，20min～26min，B相的体积百分数由90％至0％；

所述酸的种类为甲酸或乙酸；

所述GPC净化具体为：将待净化液至于GPC样品管中，设置GPC净化参数进行净化，收集洗脱液，蒸发至干，残渣用甲醇溶解，得到待测液；

所述GPC净化参数具体为：凝胶柱为200mm×20mm；色谱柱填料粒度为74～148μm；流动相为体积比为1:1的乙酸乙酯-环己烷；流速为5mL/min；收集时间为7min～19min。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品的质量和乙酸乙酯-环己烷的体积比为1g～2g：25mL。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述柱温为35℃。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述激发波长550nm，发射波长580nm。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酸的种类为甲酸。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酸的体积百分数为0.1％。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤C中罗丹明B的定量采用标准曲线法。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A中超声提取的提取时间为5min～15min。