CN102749399A

CN102749399A - 测定烟草中咖啡酸含量的方法

Info

Publication number: CN102749399A
Application number: CN2012102570782A
Authority: CN
Inventors: 任竹; 赵会纳; 雷波; 丁福章; 张捷; 潘文杰; 罗宝昌
Original assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2012-07-24
Filing date: 2012-07-24
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-07-24
Also published as: CN102749399B

Abstract

本发明公开了测定烟草中咖啡酸含量的方法，是采用超高效液相色谱法测定烟草中咖啡酸含量，该方法是：第一步，制备咖啡酸标准品，准确称取咖啡酸标准品，用乙腈定容，制成标准品溶液；第二步，制备供试样品溶液，包括（1）制备鲜烟叶样品，（2）制备烤后烟叶样品，烟叶粉碎过40目筛，（3）提取咖啡酸；最后测定咖啡酸含量：分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出咖啡酸含量。本发明的方法具有操作简便、灵敏度高、准确性强、重复性好、测定快速等诸多优点，适用于烟草鲜烟叶和烤后烟叶中咖啡酸含量的测定。

Description

测定烟草中咖啡酸含量的方法

技术领域

本发明涉及烟草的种植与栽培，具体来说，涉及测定烟草中咖啡酸含量的方法。

背景技术

咖啡酸，又名3,4-二羟基肉桂酸或3,4-二羟基苯丙烯酸（3,4-dihydroxy-cinnamic acid），黄色结晶，是烟草中苯丙烷代谢途径的中间产物，也是木质素合成途径代谢产物，主要以葡萄糖苷和酯的形式存在，是烟草中的酚类物质。烟草酚类化合物是产生烟草香气的重要成分之一，不仅直接影响烟叶颜色，对烟气质量和香吃味也有间接影响，其降解产物还可以改善烟草制品的吸味，是衡量烟叶品质的重要指标。因此，测定烟草中的咖啡酸含量对于判断烟叶的质量和风格特征有着重要的意义。

经过检索，中国专利数据库中未发现关于烟草中咖啡酸测定方法的专利，而现有的技术文献也鲜有相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供测定烟草中咖啡酸含量的方法，以为探明烟叶特色形成提供一些理论支持。

本发明提供的测定烟草中咖啡酸含量的方法，是采用超高效液相色谱法测定烟草中咖啡酸含量，包括以下步骤：

第一步制备咖啡酸标准品

准确称取咖啡酸标准品10mg，用乙腈定容至10mL，然后吸1 mL用乙腈定容至10mL制成标准品溶液，备用；

第二步制备供试样品溶液

（1）制备鲜烟叶样品：液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重（无水分），再将其研磨成粉，备用；

（2）制备烤后烟叶样品：烤后烟叶粉碎过40目筛，备用；

（3）提取咖啡酸：取鲜烟叶粉末0.6g或干烟叶粉末0.05g，精密称定，加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h，抽滤后加入4mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0.22μm的滤膜后进样；

第三步测定咖啡酸含量

分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出咖啡酸含量。

上述咖啡酸标准品购自Sigma公司，纯度≥98％；上述乙腈、乙酸为天地公司生产的色谱纯试剂，氢氧化钠、盐酸、无水硫酸钠、乙醚、乙酸乙酯为国产分析纯。

上述检测烟叶色谱的色谱条件是：色谱柱用Waters C18 ODS2色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；流动相A为水，B为乙腈，C为10%乙酸水溶液，梯度洗脱，柱温35℃，流速1.0mL.min^-1，检测波长310nm，进样量2μL。

上述梯度洗脱条件如下

时间	A	B	C
				初始	75%	5%	20%
30min	50%	30%	20%
				35min	75%	5%	20%

上述各步骤所用的仪器设备是：Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，Waters2996二极阵列管检测器(DAD)检测，Empower色谱工作站，万分之一电子天平，旋转蒸发仪，真空泵、恒温摇床等。

本发明的测定烟草中咖啡酸含量的方法具有灵敏度高、准确性强、重复性好、使用有机试剂少等诸多优点，可用于烟草鲜烟叶和烤后烟叶中咖啡酸含量的测定。

附图说明

图1为标准品与烟叶样品HPLC图；

图2为标准品标准曲线图。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明进一步说明，但不作为对本发明的限制。

实施例1 测定方法实施例

首先进行标准品溶液的制备：准确称取咖啡酸标准品10mg，用乙腈定容至10mL，吸1 mL用乙腈定容至10mL制成标准品溶液，备用；

然后制备供试样品溶液：

（2）制备烤后烟叶样品：烤后烟叶粉碎过40目筛，备用；

（3）提取咖啡酸：取鲜烟叶粉末0.6g或烤后烟叶粉末0.05g，精密称定，加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h，抽滤后加入4mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0.22μm的滤膜后进样；

最后进行咖啡酸含量的测定：分别取标准品溶液配成浓度分别为0.5、1、2、3、5、10、20、30、50μm/mL的溶液取2μL注入超高效液相色谱仪，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出咖啡酸含量；

其中，所述色谱条件为：色谱柱Waters C18色谱柱（4.6mm×150mm,5μm）；流动相A为水，B为乙腈，C为10%的乙酸，柱温35℃，流速1.0mL.min^-1，检测波长310nm，进样量2μL。

梯度洗脱条件：

时间	A	B	C
				初始	75%	5%	20%
30min	50%	30%	20%
				35min	75%	5%	20%

实施例2 线性关系考察

分别取上述标准品溶液0.5、1、2、3、5、10、20、30、50μL，按实施例1中色谱条件测定，记录色谱图及峰面积。以各标准品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标计算，得咖啡酸的回归方程为y=8.16×10³ x-1.82×10³，R²=0.9998，线性范围为1.113~56.236μg/mL。

精密度试验：精密吸取供试样品溶液按上述色谱条件连续进样10次，进样量2μL，记录色谱图，测得咖啡酸峰面积的RSD为0.13%，结果表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批样品，按供试品制备方法平行10次样品，连续进样，进样量2μL，记录色谱图，计算咖啡酸含量的的RSD为3.21%，结果表明该实验重复性良好。

稳定性试验：取同一份供试样品溶液，在0, 4，12，24h进样，在上述色谱条件下测定，咖啡酸峰面积的RSD为0.16%，结果表明样品在24h内稳定性良好。

实施例3 检测波长的选择

在对供试样品溶液进行色谱条件摸索时，在190～400nm进行全波长扫描，其中在233和324nm处有最大吸收，在320nm处峰形较好，基线噪音较小，因此选320nm为最大检测波长。

实施例4 流动相选择

比较乙腈-水、乙腈-0.05%乙酸水溶液和乙腈-水-10%乙酸溶液3中不同的梯度洗脱溶剂系统，以乙腈-水-10%乙酸水溶液梯度洗脱溶剂系统所得图谱的峰形较好、分离度大，所以选用乙腈-水-10%乙酸水溶液梯度洗脱溶剂系统为本试验的流动相系统。

Claims

1.测定烟叶中p-香豆酸咖啡酸含量的方法，其特征是采用超高效液相色谱法测定烟叶中咖啡酸含量，包括以下步骤：

第一步制备咖啡酸标准品

第二步制备供试样品溶液

（1）制备鲜烟叶样品：液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重即无水分时，再将其研磨成粉，备用；

（2）制备烤后烟叶样品：烤后烟叶粉碎过40目筛，备用；

（3）提取咖啡酸：取鲜烟叶粉末0.6g或干烤后烟叶粉末0.05g，精密称定，加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h，抽滤后加入64mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0.22μm的滤膜后进样；

第三步测定咖啡酸含量

分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出咖啡酸含量；

包括：

(1) 制备p-香豆酸标准品

准确称取p-香豆酸标准品10mg，用乙腈定容至10mL，然后吸1 mL用乙腈定容至10mL制成标准品溶液，备用；

(2) 制备供试样品溶液

（1）鲜烟叶样品制备：液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重（无水分），再将其研磨成粉备用；

（2）烤后烟叶样品制备：烤后烟叶粉碎过40目筛备用；

（3）取烟叶粉末0.6g，精密称定，加入30mL的3mol/L的NaOH搅拌提取4h，抽滤后加入3mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯（v:v）萃取5次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0.22μm的滤膜后进样；

取事先干燥、粉碎的烟叶粉末0.5g，精密称定，加入30mL的80％的甲醇超声萃取1h，然后离心取上清液浓缩至5mL，过0.22μm有机滤膜后进样;

(3) 含量测定

分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出p-香豆酸含量。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述p-香豆酸咖啡酸标准品的纯度≥989％。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测烟叶色谱的色谱条件是：色谱柱用Waters C18 ODS2色谱柱，柱的大小为4.6mm×250mm，5μm；流动相A为水，B为乙腈，梯度洗脱，柱温35℃，流速1.0mL.min-1，检测波长310nm，进样量2μL；

色谱柱用Waters C18 ODS2色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；流动相为A（含2.5%乙酸的水）-B（乙腈），梯度洗脱，柱温35℃，流速1.0mL.min-1，检测波长310nm，进样量2μL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述梯度洗脱条件如下：

时间 A B C 初始 75% 5% 20% 30min 50% 30% 20% 35min 75% 5% 20%

。