CN103134877A - 测定烟草中c6-c3型酚酸类化合物含量的方法 - Google Patents

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赵会纳
丁福章
雷波
任竹
张捷
潘文杰
罗宝昌
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Abstract

本发明公开了测定烟草中C6-C3型酚酸类化合物含量的方法,涉及包括以下步骤:首先制备标准品溶液;之后制备供试样品溶液,其中又包括制备鲜烟叶样品、制备烤后烟叶样品和提取待测物质;最后进行含量的测定:分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪,根据色谱图中峰面积计算出标准曲线,然后分别计算出咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸含量。本发明的方法,实现了测定烟草中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸的含量,解决了鉴定烟草品质的问题;具有操作简便,灵敏度高,准确性强,重复性好,测定快速等诸多优点,可用于烟草鲜烟叶和烤后烟叶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸含量的测定。

Description

测定烟草中C6-C3型酚酸类化合物含量的方法
技术领域
本发明涉及烟草的种植与栽培,具体来说,涉及测定烟草中C6-C3型酚酸类化合物含量的方法。
背景技术
自然界物中发现的酚酸类化合物的主要骨架类型有以下两类:(1) C6-
C1型,基本骨架是苯甲酸,如原儿茶酸、香草酸、丁香酸和没食子酸等;(2) C6-C3型,主要是肉桂酸的衍生物,如咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、p-香豆酸等。烟草中的C6-C3型酚酸类化合物,是含有酚羟基和羧基的一类代谢产物成分,是烟草中苯丙烷代谢途径的中间产物,是木质素合成途径代谢产物,多以束缚形式存在,一般以酯键、糖苷键、醚键和其他化合物连接在一起,它与对逆境的抗性以及烟草的特色形成等生理活动有着密切的关系,可能是烟叶特色或表现型的直接体现者。其中:咖啡酸,又名3,4-二羟基肉桂酸3,4-二羟基苯丙烯酸(3,4-dihydroxy-cinnamic acid),黄色结晶;p-香豆酸,又称对羟基肉桂酸,即 3-(4-羟基苯基)-2丙烯酸(p-Hydroxycinnamic acid;p-Coumaric acid);阿魏酸,又称4-羟-3-甲氧基肉桂酸或3-(4-羟基-3-甲氧苯基)-2-丙烯酸(4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid);芥子酸,又称白芥酸,即3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸 (4-Hydroxy-3,5-dimethoxycinnamic acid )。 
C6-C3型酚酸类化合物是烟草中重要的代谢产物,与烟叶特色关系密切。因此,测定烟草中的C6-C3型酚酸类化合物含量对于判断烟草的质量和风味有着重要的意义。
经过检索,中国专利数据库中未发现关于测定烟草中C6-C3型酚酸类化合物含量方法的专利,现有的技术文献也没有相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供测定烟草中C6-C3型酚酸类化合物含量的方法,实现测定烟草中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸的含量,以为探明烟叶特色形成提供一些理论支持。
本发明的测定烟草中C6-C3型酚酸类化合物含量的方法包括以下步骤:
第一步 制备标准品溶液
分别取咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸标准品10mg,用乙腈定容至10mL,然后吸1 mL用乙腈定容至10mL制成标准品溶液,备用。
第二步 制备供试样品溶液
(1) 制备鲜烟叶样品:液氮取样,然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重(无水分),再将其研磨成粉备用。
(2) 制备烤后烟叶样品:烤后烟叶粉碎过40目筛备用。
(3) 提取待测物质:取烟叶粉末0.6g,精密称定,加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h,离心后上清液加入4mol/L的HCl调节pH至2,并加入NaCl至饱和,然后分别用20mL1∶1的乙醚/乙酸乙酯(体积比)萃取3次,合并有机相并加入适量无水Na2SO4过夜,再有旋转蒸发仪蒸干,最后用乙腈定容后过0.22μm的滤膜后进样。
 第三步 测定含量
 分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪,根据色谱图中峰面积计算出标准曲线,然后分别计算出咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸的含量。
 上述咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸购自Sigma公司,纯度≥98%,乙腈为天地公司生产的色谱纯试剂,乙酸为Fisher公司生产的色谱纯试剂,氢氧化钠、盐酸、无水硫酸钠、乙醚、乙酸乙酯、甲醇为国产分析纯。
上述检测烟叶色谱的色谱条件是:色谱柱:Waters C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:A为含2.5%乙酸的水-B为乙腈,柱温35℃,流速1.0mL.min-1,检测波长310nm,进样量2μL。
     上述梯度洗脱的条件是:初始-40min,95%A→70%A;40min-45min, 70%A→95%A。
各步骤所用的仪器设备是: Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪,Waters2996二极阵列管检测器(DAD)检测,Empower色谱工作站,万分之一电子天平,旋转蒸发仪,低温离心机、恒温摇床、冷冻干燥仪等。
本发明的方法,具有操作简便,灵敏度高,准确性强,重复性好,测定快速等诸多优点,可用于烟草鲜烟叶和烤后烟叶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸含量的测定。
附图说明
 图1为标准品HPLC图,
 图2为烟叶样品HPLC图。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明进一步说明,但不作为对本发明的限制。
实施例1  测定方法实施例
首先进行标准品溶液的制备:准确称取芥子酸标准品10mg,用乙腈定容至10mL,然后吸1 mL用乙腈定容至10mL制成标准品溶液,备用;
之后制备供试样品溶液,包括:
(1) 制备鲜烟叶样品:液氮取样,然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重,即为无水分,再将其研磨成粉备用;
(2) 制备烤后烟叶样品:烤后烟叶粉碎过40目筛备用;
(3) 提取待测物质:取烟叶粉末0.6g,精密称定,加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h,离心后上清液加入4mol/L的HCl调节pH至2,并加入NaCl至饱和,然后分别用20mL1∶1的乙醚/乙酸乙酯(体积比)萃取3次,合并有机相并加入适量无水Na2SO4过夜,再有旋转蒸发仪蒸干,最后用流动相定容后过0.22μm的滤膜后进样;
最后进行含量的测定:
 分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪,根据色谱图中峰面积计算出标准曲线,然后分别计算出咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸含量。
 其中,所述色谱条件为:色谱柱Waters C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相A(含2.5%乙酸的水)-B(乙腈),柱温35℃,流速1.0mL.min-1,检测波长310nm,进样量2μL。
梯度条件:初始-40min,95%A→50%A;40min-50min,50%A→95%A。
实施例2  线性关系考察及检测波长和流动相的选择
分别取上述标准品溶液0.5、1、2、3、5、10、20、30、50μL,按实施例1中色谱条件测定,记录色谱图及峰面积。以各标准品的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标计算,得到咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸的回归方程,列于下表:
物质 标准曲线 R2 线性范围 检测限
咖啡酸 y=8.16×103 x-1.82×103 0.9998 1.113~56.236 0.314
p-香豆酸 y=1.48×104x-1.45×103 0.9993 1.047~52.332 0.572
阿魏酸 y=7.55×103 x-5.99×102 0.9995 1.110~56.620 0.664
芥子酸 y=5.69×103 x-7.18×102 0.9992 1.067~53.881 0.955
    精密度试验:精密吸取供试样品溶液按上述色谱条件连续进样10次,进样量2μL,记录色谱图,测得咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸峰面积的RSD分别为0.13%、0.16%、0.21%和0.19%,结果表明仪器精密度良好。
 重复性试验:取同一批样品,按供试品制备方法平行6次样品,连续进样,进样量2μL,记录色谱图,计算咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸含量的的RSD分别为3.21%、4.76%、3.73%和4.52%,结果表明该实验重复性良好。
稳定性试验:取同一份供试样品溶液,在0, 4,12,24h进样,在上述色谱条件下测定,咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸峰面积的RSD分别为0.16%、0.31%、0.42%和0.35%,结果表明样品在24h内稳定性良好。
  检测波长的选择:对供试样品溶液进行色谱条件摸索时,在190-400nm进行全波长扫描,其中在两个范围230~240 nm、320~330 nm处有最大吸收,其中在310nm处分离度可以到达到指纹图谱要求的标准,因此选310nm为最大检测波长。
 流动相选择: 试验比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%乙酸水溶液和乙腈-2.5%乙酸水溶液3中不同的梯度洗脱溶剂系统,以乙腈-2.5%乙酸水溶液梯度洗脱溶剂系统所得图谱的峰形较好、分离度大,所以选用乙腈-2.5%乙酸水溶液梯度洗脱溶剂系统为流动相系统。
 实施例3  提取方法选择
 1、提取游离态C6-C3型酚酸类化合物
 本试验分别采用甲醇、80%甲醇、70%甲醇作为提取液,分别超声30min、1h、2h来提取烟草中的游离态C6-C3型酚酸化合物,但通过试验发现在检测限内未检测到烟草中C6-C3型游离态酚酸类化合物。
 2、提取结合态C6-C3型酚酸类化合物
 本试验分别采用1mol/L、2mol/L和4mol/L的NaOH作为提取液,分别用搅拌提取和摇床提取1h、2h、4h、8h和16h,萃取剂分别采用了乙醚、1:1乙醚:乙酸乙酯、乙酸乙酯来提取烟草中的结合态C6-C3型酚酸化合物,发现用4mol/L的NaOH 再摇床上提取4h提取效果较好且时间较短,最终选择此条件。

Claims (3)

1.测定烟草中C6-C3型酚酸类化合物含量的方法,其特征包括以下步骤:
第一步 制备标准品溶液
分别取咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸标准品10mg,用乙腈定容至10mL,然后吸1 mL用乙腈定容至10mL制成标准品溶液,备用;
第二步 制备供试样品溶液
(1) 制备鲜烟叶样品:液氮取样,然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重即无水分,再将其研磨成粉备用;
(2) 制备烤后烟叶样品:烤后烟叶粉碎过40目筛备用;
(3) 提取待测物质:取鲜烟叶粉末0.6g,精密称定,加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h,离心后上清液加入4mol/L的HCl调节pH至2,并加入NaCl至饱和,然后分别用20mL体积比为1∶1的乙醚/乙酸乙酯萃取3次,合并有机相并加入适量无水Na2SO4过夜,再有旋转蒸发仪蒸干,最后用流动相定容后过0.22μm的滤膜后进样;
 第三步 测定含量
 分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪,根据色谱图中峰面积计算出标准曲线,然后分别计算出咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸的含量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸标准品的纯度均≥98%。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述检测烟叶色谱的色谱条件是:检测烟叶色谱的色谱条件是:色谱柱:Waters C18色谱柱,大小为4.6mm×250mm,5μm;流动相:A为含2.5%乙酸的水,B为乙腈,柱温35℃,流速1.0mL.min-1,检测波长310nm,进样量2μL;所述梯度洗脱的条件是:初始-40min,95%A→70%A;40min-45min,70%A→95%A。
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