JP2007085868A - 飲食品中のポリフェノールの定量分析方法、定量分析装置および飲食品の設計方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 飲食品または飲食品素材中に含まれる主要な呈味／機能性成分であるポリフェノールを、特別な前処理なしに、自動的に分離し、定量することのできる分析方法を提供する。
【解決手段】 ポリフェノールを含む飲食品または飲食品素材中からポリフェノールをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、分離したポリフェノールをポリフェノール特異的な発色定量法により定量するすることを特徴とする飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの定量分析方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は飲食品中に含まれる主要な呈味／機能性成分のひとつであるポリフェノールの分析方法、分析装置さらにこの方法および／または装置を用いて飲食品の呈味性、機能性を設計する方法に関する。

ポリフェノールとは、1分子中に複数のフェノール性水酸基を有する化合物の総称であり、植物に広く含まれる物質として知られている。ポリフェノールはホップ、りんご、お茶、ぶどう、カカオなど様々な食品に含まれており、特徴的な苦味や渋味を有するため、飲食品の呈味に大きな影響を与えている。苦味・渋味の強いポリフェノールは、一般に分子量の大きい縮合型のタンニンであるとされ、ポリフェノールの分子量の大きさと食品の呈味とは、密接に関連しているといえる（非特許文献１、非特許文献２）。

また近年、飲食品中に含まれるポリフェノールが、抗酸化作用、抗アレルギー作用、歯垢形成抑制作用などの、様々な機能性を有することが報告されており、注目を集めている（抗酸化：非特許文献３、抗アレルギー：非特許文献４、歯垢：非特許文献５）。ポリフェノールの機能性も、分子量の大きさにより変化することが報告されており、飲食品の機能性と飲食品に含まれるポリフェノールの分子量の大きさもまた、密接に関連していると言える。例えば、Tagashiraらは、虫歯菌が産生する歯垢形成酵素の阻害活性が、ポリフェノールの分子量の大きさに依存していることを報告している（非特許文献５）。

呈味性／機能性を有する分子量の大きいポリフェノールとしては、プロアントシアニジンが挙げられる。プロアントシアニジンは、カテキン、ガロカテキンなどのフラボノールを１単位とし、それらが炭素−炭素結合を介して結合し、加水分解によりシアニジン、デルフィニジンなどの赤色系色素を生じる物質の総称である。プロアントシアニジンには、少数のフラボノール単位から形成されるオリゴマーから、多数のフラボノール単位から形成されるポリマーが存在する。この物質中に含まれるフラボノール単位数の違いが、分子量の大きさの違いであり、また呈味性、機能性に影響すると考えられている。

飲食品中の総ポリフェノールを測定する方法としてはフォーリン・デニス（Folin Denis）法が、総プロアントシアニジン量を測定する方法としてはポーター（Porter）法が一般的に採用されている。

これらの方法は、飲食品中に含まれる総ポリフェノール量や総プロアントシアニジン量を発色的に定量する方法であり、これらの方法から得られた定量値からは、分子量に関する情報は一切得られない。そのため、飲食品の呈味と総ポリフェノールや総プロアントシアニジンの値とは、必ずしも相関を持たない。また、これらの方法は、フェノール性アミノ酸など、夾雑物の多い食品ではデータの信頼性に問題があった。

近年、HPLC装置を用いて詳細に飲食品の成分を分離、検出する方法が開発されているが、ポリフェノールの分離と検出にはそれぞれ問題があった。

ポリフェノールの分離では、例えば、非特許文献６のように、逆相系カラムとしてC18（ODS）カラムを使用する場合、1〜5量体までのプロアントシアニジンの分離は良好であるが、それ以上の高分子ポリフェノールはカラム充填剤に吸着され易い為、溶出されないという問題があった。更にこの方法では、ポリフェノールの検出にUV220nmを使用しており、カフェインやチロシンなどの夾雑成分の影響を受けやすい。

分離方法としてサイズ排除クロマトグラフィーを用いた場合では、分子量別にポリフェノールを分離できる利点があるが、これまでは検出方法としてUV-VIS装置やRI装置が用いられていた為、タンパク質など飲食品中の夾雑成分の影響を受けやすくポリフェノールを正しく定量分析することが困難であった。

特許文献１に示す方法では、分離方法として分配クロマトグラフィーを、検出方法としてケミルミネッセンスの原理によるポリフェノール特異的な発光方法を用いている。しかしながら、本方法では、試料からポリフェノールを分離する第１の工程と、ポリフェノール化合物を発光させる第２の工程からなるポリフェノールの定量方法が記載されている。本方法では、試料（飲食品）からポリフェノールを分離する第１の工程は記載されているが、その分離されたポリフェノールを分子量別に分離することは記載されていない。また、試料を発光させるため、過酸化水素、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド等の酸化剤またはアセトアルデヒド等の水素受容体を発光試薬として用いているが、これらの試薬はポリフェノールも発光させるが、試料中のポリフェノール以外の成分にも反応してしまう。また、本方法はエピガロカテキンガレートを検出するために最適化された方法であり、第１の工程、第２の工程で検出する前に、複雑な前処理工程（除タンパク工程）を経なければならない。具体的には実施例３で血漿中よりエピガロカテキンガレートが選択的に検出されているように見えるのは、血漿試料中の蛋白質をメタノールで変性させてあらかじめ除くなどの、低分子ポリフェノール検出のために最適化された特殊な前処理法を用いているためである。よって、本方法では飲食品などに含まれる低分子のポリフェノール量を測定することは可能であるが、ポリフェノールの分子量に応じた分布を検出することはできない。また、本方法は適切な前処理を施さないと、実用に問題があることは明白であるが、本発明の方法では有機溶媒による除蛋白などの前処理を必要としないため、簡便にポリフェノール量を測定することが可能である。

また、飲食品中のポリフェノール分子量情報に関する記述は全くなされておらず、分子量と渋味成分、機能性成分との関係を解明することができていない。特に、本方法に示されているＯＤＳカラムを用いた逆相クロマトグラフィ法では、機能性や特異味を有する高分子ポリフェノールをピークとして検出することができない。

サイズ排除クロマトグラフィー法は、試料を分子量毎に分離できる液体クロマトグラフィーで、高分子成分の分離が可能である。通常サイズ排除クロマトグラフィー法の検出法としては、RI検出またはUV吸収が用いられる。検出法としてＲＩ検出器を用いた場合、ポリフェノール以外の化合物も全て検出されてしまう。またＵＶ検出器を用いた場合、例えばカフェインなど分子内に共役を持つ化合物が夾雑物となってしまう。すなわち、ポリフェノールを特異的に検出することのできるサイズ排除クロマトグラフィー法はこれまで報告されていなかった。

以上のように、飲食品中の苦味・渋味に関与する呈味成分であり、重要な機能性成分であるポリフェノール類を、飲食品中から分離精製することなしに、その分子量ごとに定量することはこれまで技術的に困難であった。飲食品の呈味や機能性を予測評価するためには、飲食品試料の分離精製などの煩雑な前処理を行わなければならず、多大の労力と時間を要していた。

すなわち、飲食品試料中のポリフェノール類を、特別な前処理なしに、その分子量ごとに自動的に定量する方法／装置が開発されれば、産業上大いに利用されうるものである。また、そのような方法／装置は食品中の機能性成分の定量も可能であるので、例えば近年市場が拡大している特定保健用食品の機能性成分の定量法としても利用することができる。

特開平10-287605号公報 Ludwig Narziss, Die Technologie der Wuerzebereitung, p.276, 1995 Dennis E. Briggs, Brewing: Science and Practice, p.556, 2004 Journal of Cereal Science 40 (2004) 283-288 J. Agric. Food Chem. 1999,47,1906-1910 Biosci. Biochem.1997,61(2),332-335 Biosci. Biotechnol. Biochem., 66(9) 1972-1975 2002

本発明は、飲食品中に含まれる主要な呈味／機能性成分であるポリフェノールを、特別な前処理なしに、自動的に分離し、定量することのできる分析方法および装置、さらにこの方法および／または装置を用いて飲食品の呈味性、機能性を設計する方法を提供することを課題とする。

発明者らは鋭意検討の結果、サイズ排除などのクロマトグラフィーを用いた分離技術と、ポリフェノールに特異的な定量法であるフォーリンデニス法、またはプロアントシアニジンに特異的な定量法であるポーター法を組み合わせた新たな分析法を開発した。さらにこの方法を自動化できるよう溶離液組成・システム条件及び反応条件を検討し、分析システムを構築した。

上記課題を解決するための本発明は下記のとおりである。
（１） ポリフェノールを含む飲食品または飲食品素材中からポリフェノールをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、分離したポリフェノールをポリフェノール特異的な発色定量法により定量することを特徴とする飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの定量分析方法。
（２） 前記ポリフェノール特異的な発色定量法が、フォーリンデニス法および／またはポーター法であることを特徴とする請求項１に記載の飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの分析方法。
（３） ポリフェノールを含む飲食品または飲食品素材中からポリフェノールを分離するサイズ排除クロマトグラフ手段と、該サイズ排除クロマトグラフ手段により分離したポリフェノールを定量するポリフェノール特異的な発色定量手段からなることを特徴とする飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの定量分析装置。
（４） 前記ポリフェノール特異的な発色定量手段がフォーリンデニス法による発色定量手段および／またはポーター法による発色定量手段であることを特徴とする請求項３に記載の飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの定量分析装置。
（５） 上記（３）、（４）に示す装置および／又は（１）、（２）に示す方法を用いて、飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの分子量分布を確認することで、飲飲食品の機能性及び／または呈味性を設計する方法。
（６） ポリフェノールをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、分離したポリフェノールをポリフェノール特異的な発色定量法により定量することを特徴とする定量分析方法によって得られた飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの分子量ごとの定量値を
（１）特定の分子領域ごとに細分化し領域ごとの呈味特性（領域面積）を求める工程、
（２）その領域面積から呈味指数を演算する工程
（３）呈味指数から飲食品の混合比率を演算する工程
を含むことを特徴とする飲食品の機能性および／または呈味性の設計方法。
（７） （５）または（６）に記載の方法により設計された飲食品。

本発明により、飲食品または飲食品素材試料中に含まれるポリフェノールを、特段の試料の分離や前処理を行うことなしに、分子量毎に定量することが可能になり、飲食品の呈味および機能性の設計／評価が大幅に簡略化された。具体的には、ビール・発泡酒などの飲料に含まれるポリフェノールの分子量分布（特に分子量600〜3000のタンノイド領域）と渋味など官能評価との関係や、ホップやリンゴ未熟果に由来するポリフェノールを含有する食品の機能性の予測／評価などが簡便に可能となった。

本発明の検体となるポリフェノールを含む飲食品とは、例えばビール、発泡酒、雑酒、ワインなどの酒類、緑茶、ウーロン茶、プーアル茶、紅茶などの茶類、コーヒー、コーヒーゼリーなどのコーヒー豆を原料とする飲食品、ココア、チョコレートなどのカカオ豆を原料とする飲食品、ブドウ、リンゴ、モモ、コケモモなどの果物およびその果物を原料とする飲食品、大豆、えんどう豆、黒豆、小麦、大麦、燕麦、米などの穀類およびその穀類を原料とする飲食品が挙げられる。

本発明におけるサイズ排除クロマトグラフィー（以下、「ＳＥＣ」と略称することがある）とは、固定相に三次元網目構造を有する多孔性粒子を用いたクロマトグラフィーで、分離する試料成分を多孔性粒子のもつ細孔内への浸透性の差により分離するクロマトグラフィーである。固定相には、多孔性のシリカゲルやガラス、有機ポリマーゲルなど通常のサイズ排除クロマトグラフィーに用いる固定相を、特に制限なく用いることができる。移動相には、水のほか、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトンなど水と任意の割合で混和できる有機溶媒およびそれらの水溶液、1-ブタノール、ヘキサン、クロロホルムなど水と混和しない有機溶媒など、通常のサイズ排除クロマトグラフィーで用いることのできる移動相を特に制限なく用いることができる。また、分離を良好にするために、移動相に金属イオンなどを添加することもできる。固定相は通常カラムに充填され分析に供されるが、そのカラムの大きさおよび移動相の流速にも特に制限はなく、試料に応じて設定することが可能である。好適な分析条件の例としては、固定相にポリビニルアルコール系粒子を充填した 7.5mm × 30cm のカラム、移動相に10mMの臭化リチウムを含有するN,N-ジメチルホルムアミドを用い、温度40℃、移動相の流速0.4 mL/min にて試料を分離する条件が挙げられる。 本発明は、ポリフェノールを含む飲食品または飲食品素材中からポリフェノールをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、分離したポリフェノールをポリフェノール特異的な発色定量法により定量することを特徴とするものである。本発明における、ポリフェノール特異的な発色定量法とは、フォーリンデニス法、ポーター法である。

フォーリン・デニス法はポリフェノールを含む試料にフォーリン液を添加し、その後のフェノール性水酸基による青紫色の発色を700ｎｍまたは760ｎｍでの吸光度を測定することにより、試料中に含まれる総ポリフェノール量を測定する方法である。

また、ポーター法は、プロアントシアニジンを特異的に測定する方法である。プロアントシアニジンは酸性下で加熱することによりその構成単位であるフラバノール間のインターフラバノイド結合が切れ、その際アントシアニジン（赤色色素）に変換されて赤色吸収スペクトルを示す。ポーター法により分解されたプロアントシアニジンの多くは530ｎｍの可視光付近に特異的なピークを示し、標準試薬のプロアントシアニジンを用いた検量線を作成することにより、試料中の総プロアントシアニジン量を測定する方法である。

本発明の分析方法を具現化した分析装置の一実施形態を以下に示す。

第一の方法としては、クロマトグラフィー用のカラムを装備したHPLC装置の検出部に、フォーリンデニス反応をポストカラム方式で組み込んでポリフェノール特異的な検出ができることを特徴とした。

装置の概略を図１に示す。

まず、移動相１はポンプ２により流通し、インジェクター３により試料（食品または飲食品素材）が供給される。供給された試料（飲食品または飲食品素材）は、サイズ排除クロマトグラムが充填されたカラム４を通過し、試料中のポリフェノールが分離される。ＵＶ検出器５を設けることにより、ＵＶ吸収が検出され、ＵＶ吸収を持つ試料の分離の様子を確認できる。次いで反応液Ａ（０．１Ｎ水酸化ナトリウム）７がポンプ６により供給され、ミキシングコイル８で試料と反応液Ａが十分混合される。さらに、反応液Ｂ（フェノール試薬希釈液）１０がポンプ９により供給される。反応層１１内の反応ループ１２で、試料、反応液Ａ、反応液Ｂが反応し、フォーリンデニス反応が起こる。反応ループから排出する反応液の発色を可視光検出器１３で検出し、試料（飲食品または飲食品素材）中のポリフェノールを定量する。

ここでクロマトグラフィー用のカラムとしては、一般にサイズ排除用に用いられるカラムであれば特に制限なくこれを用いることができる。また、プロシアニジンの１〜５量体など、限られた物質の重合度別の分離を図る場合においては、逆相、順相のカラムを用いてもよい。

ここで移動相としては、親水系の移動相の場合、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびそれらの混合液などを用いることができる。疎水性の移動相の場合、ヘキサン、酢酸エチル、ブタノール、クロロホルム、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、およびそれらの混合液などを用いることができる。また、分離の向上のために、移動相に酸、アルカリ、塩などを添加することもできる。

ＵＶ検出器は、クロマトグラフィーにより分離された試料のＵＶ吸収を検出するものであり、ＵＶ吸収を持つ試料の分離の様子を確認できる。

反応液AおよびＢは、フォーリンデニス反応を進行させるために、分離した試料溶液に加えられるものである。反応液Ａには塩基が、反応液Ｂにはフェノール試薬が使われる。

反応ループは、反応液Ａ、Ｂを加えられた試料を発色させるための装置であり、試料はここを通過する間に十分に発色する。

移動相、反応液ＡおよびＢを送液するポンプとしては、およそ流速0.1〜10 mL/minの流速を実現しうるポンプであれば何を用いてもよいが、移動相および反応液Ａ、Ｂ中に含まれる酸や塩基に耐性のある材質のポンプであることが望ましい。

可視光検出器は、フォーリンデニス反応により発色した色調を検出するものである。通常のフォーリンデニス反応で用いられる反応液をそのままＨＰＬＣ装置に導入した場合、濁りを発生してクロマトが詰まるなどの問題が発生し、本発明の課題を達成することができないことがある。しかし、本発明者らは反応液組成や条件を検討し、自動化されたサイズ排除クロマトグラフィー総ポリフェノール発色法を実現するために好適な装置条件を達成した。

好適な発色法の装置条件としては、
・ カラム：Shodex Asahipak GF-310 HQ（温度40℃）
・ 移動相：DMF (10 mM LiBr) …0.4 mL/min
・ 反応液A：0.1N NaOH溶液 …2.0 mL/min、
・ 反応液B：フェノール試薬希釈液 …0.25 mL/min
・ 反応ループ：0.5 mm ID×10 m
・ 検出器：760 nm
・ 反応槽温度：40℃
を挙げることができる。この条件でサイズ排除クロマトグラフィーで分離したポリフェノールのポリフェノール特異的検出を行うことができる。

第二の方法としては、クロマトグラフィー用のカラムを装備したHPLC装置の検出部に、ポーター反応をポストカラム方式で組み込んでプロアントシアニジン特異的な検出ができることを特徴とした。

装置の概略を図４に示す。

まず、移動相１はポンプ２により流通し、インジェクター３により試料（飲食品または飲食品素材）が供給される。供給された試料（飲食品または飲食品素材）は、サイズ排除クロマトグラムが充填されたカラム４を通過し、検体中のポリフェノールが分離される。ＵＶ検出器５を設けることにより、ＵＶ吸収が検出され、ＵＶ吸収を持つ試料の分離の様子を確認できる。次いで反応液Ａ（ｎ−ブタノール／塩酸溶液）７がポンプ６により供給され、ミキシングコイル８で試料と反応液Ａが十分混合される。さらに、反応液Ｂ（硫酸鉄アンモニウム溶液）１０がポンプ９により供給される。反応層１１内の反応ループ１２で、試料、反応液Ａ、反応液Ｂが反応し、ポーター反応が起こる。反応ループから排出する反応液の発色を可視光検出器１３で検出し、試料（飲食品）中のプロシアニジンを定量する。

ここでクロマトグラフィー用のカラムとしては、一般にサイズ排除用に用いられるカラムであれば特に制限なくこれを用いることができる。また、プロシアニジンの１〜５量体など、限られた物質の重合度別の分離を図る場合においては、逆相、順相のカラムを用いてもよい。

ここで移動相としては、親水系の移動相の場合、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびそれらの混合液などを用いることができる。疎水性の移動相の場合、ヘキサン、酢酸エチル、ブタノール、クロロホルム、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、およびそれらの混合液などを用いることができる。また、分離の向上のために、移動相に酸、アルカリ、塩などを添加することもできる。

ＵＶ検出器は、クロマトグラフィーにより分離された試料のＵＶ吸収を検出するものであり、ＵＶ吸収を持つ試料の分離の様子を確認できる。

反応液AおよびＢは、ポーター反応を進行させるために、分離した試料溶液に加えられるものである。反応液Ａにはアルコールと酸が、反応液Ｂには鉄イオン溶液が使われる。

反応ループは、反応液Ａ、Ｂを加えられた試料を発色させるための装置であり、試料はここを通過する間に十分に発色する。

移動相、反応液ＡおよびＢを送液するポンプとしては、およそ流速0.1〜10 mL/minの流速を実現しうるポンプであれば何を用いてもよいが、移動相および反応液Ａ、Ｂ中に含まれる酸や塩基に耐性のある材質のポンプであることが望ましい。

可視光検出器は、ポーター反応により発色した色調を検出するものである。通常のポーター反応をそのままＨＰＬＣ装置に導入した場合、発色が十分でなかったり、濁りを発生してクロマトが詰まるなどの問題点が発生し、本発明の課題を達成することはできないが、本発明者らは反応液組成や条件を検討し、自動化されたサイズ排除クロマトグラフィー総プロアントシアニジン発色法に好適な条件を達成した。最終的に決定した好適な装置条件は
・ カラム：Shodex Asahipak GF-310 HQ（温度40℃）
・ 移動相：DMF (10 mM LiBr) …0.4 mL/min
・ 反応液A：n-BuOH/HCl溶液…0.2 mL/min
・ 反応液B：硫酸鉄アンモニウム溶液…0.2 mL/min
・ 検出器：550 nm
・ 反応槽：90℃

また、反応液Aと反応液Bの間には0.5 mm ID×1 mのミキシングコイル、反応液Bの後ろに反応ループ0.5 mm ID×40 m、反応液や反応温度、コイルの材質を検討し、液体クロマトグラフィー後のプロアントシアニジン特異的検出を行えるよう条件を設定した。この条件で液体クロマトグラフィー後のプロシアニジン特異的検出を行うことができる。

なお、サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣのポストカラム部分の移動相を二分し、その一方をフォーリンデニス反応に、もう一方をポーター法に供し、第一の方法と第二の方法の分析を同時に実現する装置を作成することも可能である。

装置の概要を図９に示す。装置の細目は上記図１および図４と同様である。

本発明の飲食品の機能性および／または呈味性の設計方法は、単純に飲食品中のポリフェノール成分の分析に用いるばかりでなく、以下のように応用することで、飲食品の呈味性、機能性を設計する方法として用いることも可能である。

方法１ 飲食品に用いる素材を本発明の方法によりあらかじめ評価選抜することで、最終的に得られる飲食品の呈味性、機能性を予測する方法。例えば、フォーリンデニス法やポーター法において同じポリフェノール含量を示す素材Ａ、Ｂを本発明の方法で分析した結果、分子量２，０００以上の領域においては素材Ａの方がＢよりも多くのプロシアニジン様ポリフェノールを含有することが判明したとすれば、素材Ａを配合した飲食品の方が、素材Ｂを配合した飲食品よりも歯垢形成抑制活性が強く、また渋味は強いことが予想される。実際に素材を配合した飲食品を製造しなくても呈味性や機能性の予測ができる。

方法２ 飲食品に配合する原料や製造法を様々に変えて製造した飲食品毎に、本発明の方法による分析結果を蓄積しておき、必要に応じ最適な原料や製造法のレシピを簡便に見つける方法。例えば、ビールは麦芽やホップ、酵母などの原料が同じでも、加熱の時間や熟成の温度によって、出来上がりのビールの呈味性は異なるものである。これらのレシピ毎に本発明の方法による分析結果を残しておけば、同じ総ポリフェノール定量値や総プロアントシアニジン値のビールであっても、異なる呈味性を示すことが確認できる。例えば、分子量６００以下のポリフェノール量は苦味に、分子量６００〜３，０００のタンニン領域のプロシアニジン量は渋味に、分子量３，０００以上のポリフェノール量はボディー感に寄与すると考えられる。呈味性をパネリストを用いた官能試験で評価し、記録しておくことも可能であるが、パネラーの体調や気温などの環境要因により官能試験結果が左右される他、パネリストの評価が一定になるようなトレーニングの実施や、評価の均一性を期待できるパネリストの人数の確保、維持には多大な労力を要する。一方本発明の方法による分析結果を、レシピごとにプロファイルしておけば、客観的に呈味と関連するポリフェノール量が定量されているので、開発しようとする呈味性のビールのレシピを、簡便に選抜することが可能であり、産業上大いに意義のあるものである。

実際に、ポリフェノールの分子量毎の含量と官能特性には、およそ以下の図１０に示すような相関があると考えられた。

すなわち、分子量３００以下の低分子のポリフェノールは主に苦味に寄与し、分子量３００〜３，０００の中分子量（タンノイド領域）のポリフェノールは主に渋味に寄与し、分子量３，０００以上の高分子のポリフェノールは主にボディ感に寄与する。

例えば、製法の異なるレシピＡ、Ｂで製造されたビールが、各々図１０に示すようなポリフェノール分子量プロフィールを示すとき、官能検査の結果からは苦味と渋味においてレシピＢの方がレシピＡより高い評価となり、ボディ感においてレシピＡの方がレシピＢよりも高い評価となることが確認できた。

この傾向を基に、ビールに含まれるポリフェノールの分子量プロフィールを本発明の方法で確認すれば、煩雑な官能検査を行わなくても、そのビールの持つ官能特性をあらかじめ把握することができる。

ＳＥＣ／フォーリンデニス法自動分析装置
図１に示すような装置を作成し、検体中の成分をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、連続的に成分中のポリフェノールをフォーリンデニス法により検出することのできる装置（ＳＥＣ／フォーリンデニス法自動分析装置）を開発した。なお、本装置は例えば以下のような条件下で、良好な分離および検出が得られた。

・ ポンプ：ギルソン製305
・ カラム：Shodex Asahipak GF-310 HQ（温度40℃）
・ UV検出器：ジーエルサイエンス株式会社製UV620（検出波長280nm）
・ 移動相：DMF (10 mM LiBr) …0.4 mL/min
・ 反応液A：0.1N NaOH溶液 …2.0 mL/min、
・ 反応液B：フェノール試薬8倍希釈液 …0.25 mL/min
・ 反応ループ：0.5 mm ID×10 m
・ 反応槽：株式会社島津製作所製CRB-6A（温度40℃）
・ 可視光検出器：株式会社島津製作所製SPD-20AV（検出波長760 nm）
・ ライン材質： ピーク（VICTREX社）

この装置に試料としてカテキンとカフェインを供した場合、図２に示すようにカテキンは検出されたがカフェインは検出されず、本装置がポリフェノールに対する選択性を有することが確認された。

また、この装置を用いて、カテキンの検量線を作成した。図３に示すように、本装置により、１０−５００ｐｐｍの範囲で直線性が確認され、この装置を定量的に用いることができることが確認できた。

ＳＥＣ／ポーター法自動分析装置
図４に示すような装置を作成し、検体中の成分をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、連続的に成分中のプロアントシアニジンをポーター法により検出することのできる装置（ＳＥＣ／ポーター法自動分析装置）を開発した。なお、本装置は例えば以下のような条件下で、良好な分離および検出が得られた。

・ ポンプ：ギルソン製305
・ カラム：Shodex Asahipak GF-310 HQ（温度40℃）
・ UV検出器：ジーエルサイエンス株式会社製UV620（検出波長280nm）
・ 移動相：DMF (10 mM LiBr)、流速：0.4 mL/min
・ 反応液A：n-BuOH/HCl溶液…0.2 mL/min
・ 反応液B：硫酸鉄アンモニウム溶液…0.2 mL/min
・ 反応槽：90℃
・ 反応ループ：0.5 mm ID×40 m
・ 反応槽：株式会社島津製作所製CRB-6A（温度40℃）
・ 可視光検出器：株式会社島津製作所製SPD-20AV（検出波長550 nm）
・ ライン材質：ピーク（VICTREX社）

この装置に試料としてカテキンとプロアントシアニジンのひとつであるプロシアニジンＢ２を供した場合、図５に示すようにプロシアニジンＢ２は検出されたがカテキンは検出されず、本装置がプロアントシアニジンに対する選択性を有することが確認された。

また、この装置を用いて、プロシアニジンＢ２の検量線を作成した。図６に示すように、本装置により、１０−５００ｐｐｍの範囲で直線性が確認され、この装置を定量的に用いることができることが確認できた。

ＳＥＣ／フォーリンデニス法自動分析装置を用いた食品成分の定量
実施例１の装置を用いてポリフェノール含有茶飲料中のポリフェノールを定量した。その結果を図７に示す。ポリフェノール含有茶飲料中のポリフェノール量は、カテキンに換算して643ppmと定量された。

ＳＥＣ／ポーター法自動分析装置を用いた食品中の機能性成分の定量
実施例２の装置を用いてポリフェノール含有茶飲料中のプロアントシアニジンを定量した。プロシアニジンＢ２に換算して635ppmと定量された。これにより本茶飲料の摂取により、十分な抗う蝕性が期待できることが予想された。また、この濃度から、本茶飲料は独特の苦味を有することが予想されたので、乳糖を苦味のマスキング効果を狙って加え、これにより嗜好性が大きく改善した。

ＳＥＣ／ポーター法自動分析装置を用いた食品の機能性の設計
「強い歯垢形成抑制活性を持つガム」を開発する際、実施例２の装置を用いて、緑茶由来ポリフェノール、ホップ苞由来ポリフェノールの２つの素材に含有される高分子プロアントシアニジン量を測定した。その結果、高分子プロアントシアニジン量が多かったホップ苞ポリフェノールを選抜し、ホップ苞ポリフェノールを配合したガムＡを以下の配合で製造した。

ガムベース ２０．０
炭酸カルシウム ２．０
乳糖 ７７．０
ステビオサイド ０．０９５
ホップ苞ポリフェノール ０．００５
香料 ０．９
合計 １００．０

なお、比較のために上記配合で、ホップ苞ポリフェノールを緑茶ポリフェノールに置き換えたガムＢも製造した。このふたつのガムを熱水で抽出し、抽出液の歯垢形成酵素抑制活性を、田頭らの方法（Tagashira et al., Biosci. Biochem.1997,61(2),332-335）に従って評価したところ、同濃度（５％添加）での評価において、ガムＡの抽出液に、ガムＢの抽出液よりも強い歯垢形成酵素抑制活性が確認された。歯垢形成酵素はＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ由来の酵素粗画分を使用した。

歯垢形成（非水溶性グルカン生成）阻害率（％）
ガムＡの抽出液 ８８
ガムＢの抽出液 １８

ＳＥＣ／フォーリンデニス法自動分析装置を用いた食品の機能性の設計
「渋味が少なく、ボディ感と苦味を併せ持ったブレンド茶」を開発するにあたり、実施例１の装置を用いて、緑茶、紅茶、プーアル茶に含有される分子量毎のポリフェノール量を測定した。そのプロフィールから、高分子領域（分子量３，０００以上）、中分子領域（分子量３，０００〜３００）、低分子領域（分子量３００以下）の各面積を計算したところ、以下の表のようになった。

高分子領域（ボディ感） 中分子領域（渋味） 低分子領域（苦味）
緑 茶 ０ ２ ７１
番 茶 ３１ １３ ２５
玄米茶 ６ ３２ １４
麦 茶 ５１ ３ ２

この結果を基に、ブレンド茶の比率を「緑茶５、番茶１、麦茶４」と決定し、ブレンド茶を製造した。製造したブレンド茶を６名のパネリストに対し官能検査に供した結果、以下のようになり、目的の「渋味が少なく、ボディ感と苦味を併せ持ったブレンド茶」を製造することができた。

パネリスト番号 ボディ感 渋 味 苦 味
１ ３ １ ４
２ ４ １ ５
３ ３ １ ３
４ ５ ２ ４
５ ４ １ ３
６ ３ １ ４
平均 ３．７ １．２ ３．８

評点は１〜５点で評価。平均は小数点以下第一位を四捨五入して表示。

本発明により、食品中のポリフェノールを、何等前処理することなく定量することができるようになった。また定量結果をもとに食品の呈味性、機能性の設計を容易に行うことできる。

ＳＥＣ／フォーリンデニス法分析装置フロー ＳＥＣ／フォーリンデニス法分析によるカテキン及びカフェインの検出を示すクロマトグラフ ＳＥＣ／フォーリンデニス法分析の定量性 ＳＥＣ／ポーター法分析装置フロー ＳＥＣ／ポーター法分析によるプロアントシアニジンＢ及びカテキンの検出を示すクロマトグラフ ＳＥＣ／ポーター法分析の定量性 ＳＥＣ／フォーリンデニス法分析によるポリフェノール含有茶飲料の分析結果 ＳＥＣ／ポーター法分析によるポリフェノール含有茶飲料の分析結果 ＳＥＣ／フォーリンデニス−ポーター法分析装置フロー ポリフェノールの分子量と呈味性の相関図

符号の説明

１ 移動相
２，６，９ ポンプ
４ カラム
５ ＵＶ検出器
７ 反応液Ａ
８ ミキシングコイル
１０ 反応液Ｂ
１２ 反応ループ
１３ 可視光検出器

Claims (7)

1. ポリフェノールを含む飲食品または飲食品素材中からポリフェノールをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、分離したポリフェノールをポリフェノール特異的な発色定量法により定量することを特徴とする飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの定量分析方法。
2. 前記ポリフェノール特異的な発色定量法が、フォーリンデニス法および／またはポーター法であることを特徴とする請求項１に記載の飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの分析方法。
3. ポリフェノールを含む飲食品または飲食品素材中からポリフェノールを分離するサイズ排除クロマトグラフ手段と、該サイズ排除クロマトグラフ手段により分離したポリフェノールを定量するポリフェノール特異的な発色定量手段からなることを特徴とする飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの定量分析装置。
4. 前記ポリフェノール特異的な発色定量手段がフォーリンデニス法による発色定量手段および／またはポーター法による発色定量手段であることを特徴とする請求項３に記載の飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの定量分析装置。
5. 請求項３または４に示す装置および／又は請求項１または２に示す方法を用いて、飲食品または飲食品素材のポリフェノールの分子量分布を確認することで、飲食品の機能性及び／または呈味性を設計する方法。
6. ポリフェノールをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、分離したポリフェノールをポリフェノール特異的な発色定量法により定量することを特徴とする定量分析方法によって得られた、飲食品または飲食品素材中のポリフェノールの分子量ごとの定量値を
   （１）特定の分子領域ごとに細分化し領域ごとの呈味特性（領域面積）を求める工程、
   （２）その領域面積から呈味指数を演算する工程
   （３）呈味指数から飲食品の混合比率を演算する工程
   を含むことを特徴とする飲食品の機能性および／または呈味性の設計方法。
7. 請求項５または６に記載の方法により設計された飲食品。

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