KR101166393B1 - 올리고머성 프로안토시아니딘 (ｏｐｃ)의 분석 방법 - Google Patents

올리고머성 프로안토시아니딘 (ｏｐｃ)의 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연 물질, 식품 및 음료, 약품 및/또는 화장품에 함유된 OPC를 분석하기 위한 신규 방법을 제공한다.
본 발명은 OPC의 가수 분해에 의해 수득된 안토시아니딘을 분석하여 OPC의 총량을 측정하고, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 OPC의 중합도 비율을 규명하여 OPC 내의 각 중합체의 함유량을 측정하는 신규의 OPC 분석 방법이다.

Description

올리고머성 프로안토시아니딘 (ＯＰＣ)의 분석 방법 {METHOD FOR ANALYZING OLIGOMERIC PROANTHOCYANIDIN (ＯＰＣ)}
본 발명은 천연 물질, 식품 및 음료, 의약품 및/또는 화장품과 같은 분석할 분석물 또는 시료에 함유된 올리고머성 프로안토시아니딘 (플라반-3-올의 n-중합체 혼합물에 대한 일반명: n≥2)을 측정하는 방법에 관한 것이다.
프로안토시아니딘 (OPC)은 와인에도 함유되어 있어, 프렌치 패러독스(French Paradox)의 유효 성분 중의 하나로 일컬어진다 (1995, Clin. Chim. Acta. 235, 207-219). 프로안토시아니딘의 의학적 장점으로는 항산화 작용, 말초 순환 개선 작용, 혈류 개선 효과, 간 기능 개선 효과 (2004, Japan Food Science, 403, January Issue, 40-45) 및 혈소판 응집 억제 효과 (Officially Published Patent Gazette 2003-527418)가 알려져 있다. 따라서 이와 같은 활성 성분인 OPC의 편리한 정성 및 정량 평가 방법의 개발이 요구된다.
공지된 프로안토시아니딘 분석 방법으로는 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC-MS)에 의한 역상 HPLC (2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, (5), 1140-1142) 및 LC-MS에 의한 기울기 용리를 수반하는 순상 HPLC (2003, J. Agric. Food Chem., 51, 7513-7521)가 포함된다. 그러나 상기 두 방법 모두 MS 검출기 를 필요로 함에 따라 편리하게 여겨지지는 않는다. 아울러 프로안토시아니딘의 구성 성분인 플라반-3-올의 입체이성 (stereoisomerism)으로 인하여 프로안토시아니딘은 매우 많은 입체이성질체로서 존재한다. 표준 물질로 사용 가능한 화합물에는 제한이 따른다. 그러므로 일부 공지된 화합물을 제외하고는 그 정량 분석이 불가능하였다. 게다가 프로안토시아니딘은 단량체 플라반-3-올에서 이량체, 삼량체 및 나아가 보다 큰 중합도의 n-량체에 이르는 형태로 자연계 내에 존재한다. 역상 HPLC에 의한 분석에서는 플라반-3-올 (단량체), 이량체 및 삼량체의 피크가 서로 겹치는 것으로 나타났다.
상술한 바와 같이, OPC의 편리한 정성 및 정량 평가 방법은 존재하지 않았다.
이러한 상황 하에, 본 발명자들은 단량체인 플라반-3-올에 의한 간섭 없이 천연 물질, 식품 및 음료, 및 의약품에 함유된 n-량체의 존재비 및 함유량을 측정할 수 있는 신규 분석 방법을 개발하고자 주의를 집중하게 되었다. 그리하여 본 발명의 목적은, 천연 물질, 식품 및 음료와 같은 분석물에 함유된 OPC를 분석하기 위한 신규 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 순상 HPLC에 의한 카테킨, 및 플라반-3-올의 이량체 및 삼량체의 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 순상 HPLC에 의한, 카테킨 및 프로안토시아니딘이 혼합되어 함유된 분석물의 분석 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 전술한 문제들을 해결하기 위한 시도의 일환으로 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 그들은 실험의 양상 및 분자량을 토대로, (a) 올리고머성 프로안토시아니딘 (OPC)의 가수 분해에 의해 생성되는 안토시아니딘의 수가 OPC에 함유된 플라반-3-올의 중합도 n의 크기에 관계없이 항상 n/2라는 사실을 규명하였다. 이로써 그들은 편리한 OPC 분석 방법의 시초를 마련하게 되었다. 나아가 본 발명자들은 (b) 지금까지 크로마토그래피에 의해 분리하기 어려웠던, 중합도 n이 다른 플라반-3-올 중합체들이 순상 컬럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 쉽게 분리될 수 있다는 뜻밖의 사실을 밝혀냈다.
본 발명의 방법은 상기의 (a) 사실 및/또는 (b) 사실을 이용하여 편리한 방식으로 천연 물질, 식품 및 음료, 의약품 및/또는 화장품 내의 올리고머성 프로안토시아니딘 (OPC)의 양을 분석하고, 또한 OPC 내의 n-중합체의 비율 및/또는 함유량을 분석한다.
본 발명의 방법에 따르면, 올리고머성 프로안토시아니딘 (OPC)은 올리고머성 프로안토시아니딘에 대체로 함유되어 있는 플라반-3-올 단량체에 의한 간섭 없이 분석될 수 있다.
또한 본 발명의 방법은 질량 분석기 필요 없이, 분석물 내의 올리고머성 프로안토시아니딘의 각 중합체 별로 플라반-3-올 중합체를 분석할 수 있다. 따라서 본 방법은 천연 물질, 식품 및 음료, 의약품 및/또는 화장품 내의 올리고머성 프로안토시아니딘의 분석에 매우 적합하다.
본 발명의 방법의 대상이 되는 분석물은 천연 물질 (포도씨, 타마린드, 사과, 수피 (樹皮), 송피 (松皮) 추출 폴리페놀, 찻잎, 코코아 등 및/또는 이들의 가공 제품 (추출물 등)), 식품 및 음료, 의약품 및/또는 화장품과 같은 임의의 시료로서, 플라반-3-올의 n-중합체 (n≥2) 혼합물 (이하 올리고머성 프로안토시아니딘 또는 OPC로 칭함)을 함유하는 것으로 예상되는 시료이다.
올리고머성 프로안토시아니딘은 일반적으로 다음의 화학식에 의해 표시되는 하나 이상의 화합물을 함유한다:
Figure 112007011143562-pct00001
본 발명은 특히, n = 0인 구조식 1의 프로시아니딘 B1, B2, B3 및 B4, n1 = 1 및 n2 = 0인 구조식 2의 프로시아니딘 B5, B6, B7 및 B8, 그리고 n = 1인 구조식 1의 프로시아니딘 C1, C2 및 C4 중에 하나 이상을 함유하는 프로안토시아니딘인 상기 올리고머성 프로안토시아니딘을 대상으로 한다. 상기 B1, B2 ... C1, C2 ... 는 각 화합물의 입체이성질체이다. 주요 프로시아니딘, OPC 및 카테킨의 구조는 아래 도시하는 바와 같다.
Figure 112007011143562-pct00002
`
Figure 112007011143562-pct00003
(1) OPC의 총량 측정
본 발명에 따르면, 분석물 내의 올리고머성 프로안토시아니딘 (OPC)에 함유 된 플라반-3-올 중합체의 종류 및 중합도를 고려할 필요가 없으며, OPC의 가수 분해에서 생성된 안토시아니딘이 분석되면 그 값으로부터 OPC의 총량이 측정될 수 있다. 본 발명의 방법은 다음의 순서에 따라 이행될 수 있다:
OPC 의 가수 분해
올리고머성 프로안토시아니딘의 가수 분해는 산성 조건 하에 열분해에 의해 이행될 수 있다. 바람직한 조건은, 예컨대 산성 조건으로서 산/저급 알콜 혼합물의 사용을 포함하며, 이 때 산은 염산, 황산 또는 질산이, 저급 알콜은 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및/또는 이소펜탄올이 바람직하다. 열분해는 50 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 85 내지 95℃의 온도에서, 30분 이상, 바람직하게는 1시간 이상의 반응 시간 하에 이행될 수 있다. 산의 농도는 0.1 N 내지 2 N, 바람직하게는 0.4 N 내지 1 N의 범위에서 선택될 수 있다.
분석물이 올리고머성 프로안토시아니딘을 저농도로 함유하는 액체 시료인 경우, 가수 분해를 수행함에 있어 시료는 감압 하에 적절한 방법, 예컨대 동결건조 또는 건조 또는 응결에 의해 건조 상태로 농축될 수 있다.
분석물 (농축물 포함)은 0.01 내지 1 %, 바람직하게는 0.05 내지 0.2 % (0.5 내지 2 mg/ml)의 농도로 상기 산/저급 알콜 혼합물에 용해됨으로써 가수 분해될 수 있다.
가수 분해의 구체적인 예는 다음과 같다: 프로안토시아니딘을 함유하는 시료 (0.5 mg)를 유리 시험관에 담긴 1 ml의 0.6 N HCl/부탄올에 용해한 후, 그 용액을 90℃ 수조에서 2시간 동안 정치시킨다. 반응이 끝난 이후, UV-265 (Shimadzu Corp.)로 700 내지 400 nm에서의 흡수 스펙트럼을 측정한다. 551 nm에서의 흡광도 측정을 통해 가수 분해 반응이 완전히 수행되어 안토시아니딘이 생성되었는지 여부를 확인한다.
안토시아니딘의 양 측정
가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘의 양 측정은 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있는데, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 또는 흡광도법에 의해 용이하게 이행될 수 있다. 흡광도법은 불변하는 가수 분해물을 사용하여 이행될 수 있으며, 바람직하게는 안토시아니딘이 가시 흡수 스펙트럼 내에서 최대 흡수를 나타내는 550 내지 552 nm에서 흡광도를 측정한다. 상기 파장에서는 올리고머성 프로안토시아니딘의 가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘 이외의 성분들의 영향 (예를 들어, 카테킨: 최대 흡수 270 nm)은 무시할 수 있다.
HPLC 공정의 예는 구체적으로 다음과 같이 설명된다: 안토시아니딘은 HPLC 컬럼 YMC-ODS-A312 (6 mm x 150 mm, YMC), 1 ml/분의 아세트산:메탄올:물 = 15:17.5:67.5 혼합물, 및 4O℃의 컬럼 온도를 사용하여, A520 nm에서의 영역값이 검출되도록 분석된다. 표준 물질로는 염화 시아니딘, 염화 델피니딘 및 염화 펠라르고니딘 (모두 Funakoshi로부터 입수 가능)이 사용될 수 있다. 상기 표준 물질의 체류 시간은 모두 상이하며, 그들의 혼합물 또는 그들 중 선택된 임의의 한 물질이 표준 물질로 사용될 수 있다. HPLC 컬럼으로는, 그것이 역상 수지인 한, 상기한 C18-기재 수지뿐만 아니라 C8-, C30-, 또는 중합체-기재 C18 수지 역시 유사하게 분석을 이행할 수 있다.
OPC 의 총량 계산
상기와 같이 분석된 안토시아니딘의 양을 기초로 하여 분석물 내의 올리고머성 프로안토시아니딘의 양을 측정하기 위해, 다음의 절차가 이행된다: a) 가수 분해에 의해 하나의 n-중합체로부터 생성된 안토시아니딘의 양은, OPC에 함유된 플라반-3-올 중합체의 중합도 n의 크기에 관계없이 n/2이다. 이러한 사실에 기초하여, 가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘의 양에 인수 2를 곱함으로써 기측정된 양의 분석물에 함유된 OPC의 총량을, 예컨대 mg 단위로 알아낼 수 있다. 다르게는, b) OPC의 가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘의 양은 OPC에 함유된 플라반-3-올 중합체의 중합도 n의 크기에 관계없이 OPC의 총량에 비례한다. 이러한 사실에 기초하여, 가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘의 양을 기지량의 OPC 표준 물질의 가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘의 양과 비교한 후, 보정 곡선 또는 다음의 식에 의해 분석물 내의 OPC의 총량 (예컨대, mg 단위) 및/또는 분석물 내의 OPC의 비율 (a%)을 측정할 수 있다:
OPC의 총량 (mg) = (시료에 관한 측정값/표준 물질에 관한 측정값) x 표준 물질의 양 (mg) (식 1)
분석물 내 OPC의 비율 (a%) = (OPC의 총량 (mg)/분석물의 양) x 100 (식 2)
사용되는 표준 물질은, 적절하게는 프로시아니딘 B1 및 프로시아니딘 B2 (둘 모두 Funakoshi로부터 입수 가능) 중에서 선택될 수 있다.
(2) OPC를 구성하는 각 n-중합체의 분석
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서는, 상기 (1)에서 이루어진 기측정된 중 량의 분석물에 함유된 OPC의 총 중량의 측정과 더불어 또는 그와는 별도로, OPC 내의 여러 플라반-3-올 중합체의 비율을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 명확히 알 수 있다. 그럼으로써, 기측정된 중량의 분석물에 함유된, 중합도 n이 다른 각 중합체의 중량을 측정하는 신규의 OPC 분석 방법 또한 제공된다.
고성능 액체 크로마토그래피에 사용되는 컬럼은 바람직하게는 순상 컬럼, 특히 바람직하게는 실리카겔 기재 수지로 충전된 순상 컬럼이다. 본 발명자들에 의한 연구에서는 상이한 중합도 (이 경우, n = 1 역시 포함됨)를 갖는 프로안토시아니딘이 순상 컬럼 상의 크로마토그래피에 의해 성분별로 매우 만족스럽게 분리될 수 있음이 밝혀졌다. 플라반-3-올의 극성이 크다는 사실로 미루어 보아, 지금까지는 순상 컬럼에 의해 플라반-3-올이 분리될 수 있다고 여겨지지 않았다. 아울러 본 발명의 방법에서는 자외선 검출기를 사용하여 측정하는 것이 가능함에 따라, 질량 분석 검출기가 필요하지 않다.
고성능 액체 크로마토그래피에 대한 조건은 원하는 대로 정할 수 있다. 구체적으로 설명하자면, 컬럼으로는 예컨대 Inertsil SIL (4.6 mmφ x 150 mm, GL Sciences Inc.)이 사용되고, 용리제는 예컨대 헥산, 메탄올, 테트라히드로퓨란, 및 포름산의 혼합물이다. 바람직하게는, 헥산:MeOH:THF:HCOOH = 45:40:14:1을 이용하는 등용매 용리 (약 1 ml/분)가 이행된다. 분석은 헥산:MeOH:THF:HCOOH = 40-60:30-50:10-20:0.1-5를 이용하여 0.3 내지 1.5 ml/분의 유속에서도 이루어질 수 있다. 컬럼 온도는 10 내지 60℃, 바람직하게는 4O℃이고, 검출기는 바람직하게는 240 내지 400 nm에서 스펙트럼 데이터를 수집하는 데 사용되는 광다이오드 어레이 검출기이다. 이는 OPC가 280 nm에서 최대 흡수를 보이는 반면 혼합 형태로 다른 폴리페놀을 포함한 시료의 경우에는 280 nm 이외의 파장에서 다른 피크들이 최대 흡수를 나타내기 때문이며, 그로 인해 상기 다른 폴리페놀을 OPC와 구별하여 배제할 수 있는 것이다. 그러나 단일 파장의 검출기만이 사용될 수 있는 환경에서는, A280 nm에서의 흡수를 이용한 분석만이 이루어질 수 있다.
크로마토그래피에 의해 분리된 모든 중합체 (이량체 또는 보다 큰 중합도의 중합체를 포함하는 모든 중합체)의 총 피크 영역은 280 nm에서 최대 흡수를 갖는 피크들의 A280 nm에서의 영역값의 총합이다. 컬럼은 Inertsil SIL (4.6 mmφ x 150 mm, GL Sciences Inc.) 뿐만 아니라, Shimpack PREP-SIL(H) (4.6 mmφ x 300 mm, Shimadzu Corp.) 또는 Supersher Si60 (4.5 mmφ x 100 mm, Merck & Co.) 역시 사용 가능하다.
OPC를 구성하는 각 n-중합체의 비율 (b%)은 고성능 액체 크로마토그래피에서 수득된 피크 영역에 기초하여 다음의 식으로부터 계산할 수 있다:
b% = {피크 영역 (각 n-중합체)}/{총 피크 영역 (모든 중합체)} x 100 ... (식 3)
이와 같이 수득된 각 n-중합체의 비율 및 상기 (1)에서 수득된 OPC의 중량에 기초하여, 기측정된 중량의 분석물에 함유된 각 n-중합체의 중량은 다음의 식에 의해, 예컨대 mg 단위로 측정될 수 있다:
n-중합체의 양 (mg) = OPC의 총량 (mg) x n-중합체의 비율 (b%)/100 ... (식 4)
이어서 실시예를 통하여 본 발명에 대해 더욱 구체적으로 설명할 것이다. 그러나 본 발명이 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 산 가수 분해 조건에 대한 조사
산에 의한 플라반제놀의 분해는 경시적으로 관찰되었다. 플라반제놀 (1 mg)을 1 ml의 0.6 N HCl/BuOH에 용해한 다음, 그 용액을 90℃ 뜨거운 수조에서 가열하였다. 20분이 경과한 이후 140분이 될 때까지 20분 간격으로 시료를 채취하였다. 채취된 시료는 부탄올과 1:10으로 희석한 후, 400 내지 700 nm의 가시 흡수 스펙트럼에 대하여 측정하였다. 최대 흡수는 모든 시료에 대하여 551 nm에서 나타났다. 상기 측정 결과는 표 1에 제시되어 있다.
표 1 산 분해된 플라반제놀의 경시적 변화
Figure 112007011143562-pct00004
그 결과는 흡광도가 산 분해 시에 시간이 경과함에 따라 서서히 증가하여 120분 후에 피크에 도달했다는 것이었다. 이러한 결과에 기초하여, 이후 실험에서 가수 분해 시간은 120분 (2시간)으로 설정하였다.
실시예 2 산 가수 분해에서의 안토시아니딘의 생성 및 분석
프로안토시아니딘을 함유하는 시료 (0.5 mg)를 유리 시험관에 담긴 1 ml의 0.6 N HCl/부탄올에 용해한 후, 그 용액을 90℃ 수조에서 2시간 동안 정치시켰다. 반응이 끝난 이후, UV-265 (Shimadzu Corp.)로 700 내지 400 nm에서의 흡수 스펙트럼을 측정한 다음, 551 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 반응 종료 이후의 용액에 대해서는 안토시아니딘을 분석하기 위해 다음의 조건 하에 HPLC를 이행하였다:
컬럼: YMC-ODS-A312, 6 mmφ x 150 mm
이동상: CH3COOH:MeOH:H2O = 15:17.5:67.5
검출: A520 nm (PDA에 의해 400 내지 600 nm에서 측정)
분석용 표준 물질로는 Funakoshi의 델피니딘, 시아니딘 및 펠라르고니딘을 구입하였다. 표준 물질, 즉 델피니딘은 535 nm의 λmax으로 4.2분 내에, 시아니딘은 525 nm의 λmax으로 5.5분 내에, 펠라르고니딘은 515 nm의 λmax으로 8.0분 내에 용리시켰다. 이러한 조건에 따라, 시료의 산 가수 분해물에 함유된 성분들은 델피니딘, 시아니딘 및 펠라르고니딘으로 분석되었다.
분석된 시료는 플라반제놀, 포도씨 폴리페놀, 차 폴리페놀, 사과 폴리페놀 및 타마린드이었고, OPC용 표준 물질로는 프로시아니딘 B1 (Funakoshi)을 사용하였다.
상기 결과는 표 2 및 표 3에 제시되어 있다.
표 2 흡광도법에 의한 OPC 함유량
Figure 112007011143562-pct00005
표 3 HPLC법에 의한 OPC 함유량
Figure 112007011143562-pct00006
*: 시아니딘 1.84 μg/ml + 델피니딘 1.98 μg/ml
실시예 3 순상 HPLC에 의한 카테킨, 이량체 및 삼량체의 분석
카테킨 및 프로안토시아니딘용 표준 물질은 다음의 조건 하에 순상 HPLC에 의해 분석되었다:
(+)-카테킨 (Nacalai Tesque), (-)-에피카테킨 (Wako Pure Chemical Industries), 및 프로시아니딘 B1 (Funakoshi)의 시료 (각 0.1 mg)를 각각 1 ml의 이동상에 용해한 후, 그 용액을 0.45 μm 필터를 통해 여과시킨 다음, 하기 제시된 조건 하에 HPLC를 이행하였다.
삼량체는 하기 제시된 실시예 5에 설명되어 있는 방법에 의해 합성하였다.
컬럼: Inertsil SIL, 4.6 mmφ x 150 mm
이동상: 헥산:MeOH:THF:HCOOH = 45:40:14:1
검출: A280 nm (PDA에 의해 240 내지 400 nm에서 측정)
상기 조건 하에, 단량체 ((+)-카테킨 및 (-)-에피카테킨)는 2.9분 내에, 이량체는 3.6분 내에, 그리고 삼량체는 4.3분 내에 용리시켰다.
그에 대한 크로마토그램은 도 1에 제시되어 있다.
실시예 4 순상 HPLC에 의한 분석
혼합 형태로 카테킨 및 프로안토시아니딘을 함유하는 시료는 하기 제시된 조건 하에 순상 HPLC에 의해 분석되었다.
프로안토시아니딘을 함유하는 시료 (1 내지 2 mg)를 1 ml의 이동상에 용해한 후, 그 용액을 0.45 μm 필터를 통해 여과시킨 다음, 다음의 조건 하에 HPLC를 이행하였다.
사용된 시료는 사과 폴리페놀, 포도씨 폴리페놀, 플라반제놀 및 타마린드이었다.
컬럼: Inertsil SIL, 4.6 mmφ x 150 mm
이동상: 헥산:MeOH:THF:HCOOH = 45:40:14:1
검출: A280 nm (PDA에 의해 240 내지 400 nm에서 측정)
분석 패턴으로서의 크로마토그램은 도 2에 제시되어 있다. 상기 패턴에서 기호 X는 OPC와는 달리 280 nm에서 최대 흡수를 나타내지 않는 폴리페놀을 표시한 것이다.
각 시료 내의 이량체 및 삼량체의 농도는 식 c% = a% x b%에 의해 결정되었다. 결과는 표 4에 제시되어 있다.
표 4 이량체 및 삼량체의 함유량
Figure 112007011143562-pct00007
실시예 5 OPC의 합성
OPC의 합성은 한 논문 (1981, J.C.S. Perkin I. 1235-1245)에 따라 다음의 방식으로 이행되었다.
(+)-탁시폴린 (500 mg)을 50 ml의 에탄올에 용해한 다음, 200 mg의 NaBH4를 첨가하였다. 이어서 1 g의 (+)-카테킨을 첨가한 후 용해하였다. 이어서 HCl을 첨가한 후, 그 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 그 반응 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제함으로써 삼량체를 수득하였다.

Claims (30)

  1. 기측정된 중량의 분석물에 함유된 플라반-3-올의 n-중합체 (n≥2) 혼합물 (상기 혼합물은 이하 올리고머성 프로안토시아니딘 또는 OPC로 칭하기로 한다)의 총 중량을 측정하는 방법으로서 하기를 포함하는 방법:
    가수 분해에 의해 하나의 n-중합체로부터 생성된 안토시아니딘의 양은 n의 크기에 관계없이 n/2라는 사실에 기초하여,
    분석물 내 OPC의 가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘의 중량을 측정한 다음,
    상기 측정된 안토시아니딘의 중량에 인수 2를 곱하여 분석물 내 OPC의 총 중량을 알아냄.
  2. 기측정된 중량의 분석물에 함유된 올리고머성 프로안토시아니딘 (OPC)의 총 중량을 측정하는 방법으로서 하기를 포함하는 방법:
    OPC의 가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘의 양은 OPC에 함유된 n-중합체의 양 비율 및 중합도 n의 크기 차이에 관계없이 OPC의 총량에 비례한다는 사실에 기초하여,
    분석물 내 OPC의 가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘의 중량을 측정하고,
    별도로 기지 중량의 OPC 표준 물질의 가수 분해에 의해 생성된 안토시아니딘의 양을 측정한 다음,
    보정 곡선 또는 다음의 식에 의해 분석물 내의 OPC의 총 중량, 분석물 내의 OPC의 중량비 (a%) 또는 이들 모두를 측정함:
    OPC의 총 중량 = (시료에 관한 측정값/표준 물질에 관한 측정값) x 표준 물질의 중량 (식 1)
    분석물 내 OPC의 중량비 (a%) = (OPC의 총 중량/분석물의 중량) x 100 (식 2)
  3. 제 2 항에 있어서, 표준 물질이 프로시아니딘 B1인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 가수 분해가 산성 조건 하에 열분해에 의해 수행되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 산성 조건이 산 및 저급 알콜의 혼합물인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 산이 염산, 황산, 또는 질산인 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 저급 알콜이 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 이소펜탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 열분해가 50 내지 100℃의 온도에서, 30분 이상의 반응 시간 동안 수행되는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 안토시아니딘의 양의 측정이 고성능 액체 크로마토그래피, 흡광도법 또는 이들 모두에 의해 이루어지는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 안토시아니딘이 가시 흡수 스펙트럼 내에서 최대 흡수를 나타내는 550 내지 552 nm에서 흡광도를 측정함으로써 흡광도법이 수행되는 방법.
  11. 중합도 n이 상이한 플라반-3-올의 n-중합체에 대해, 분석물에 함유된 올리고머성 프로안토시아니딘 (OPC)을 분석하는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는 방법:
    a) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 방법에 의해, 기측정된 중량의 분석물에 함유된 OPC의 총 중량을 측정함;
    b) a) 단계와는 별도로, OPC에 함유된, 중합도 n이 상이한 각 n-중합체를 분리하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석물을 분석한 후 모든 n-중합체, 즉 OPC의 양에 대한 각 n-중합체의 정량적 비율을 측정함; 및
    c) a) 및 b)의 결과에 의해 분석물 내의 각 n-중합체의 중량을 측정함.
  12. 제 11 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피에 사용되는 컬럼이 순상 컬 럼인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 순상 컬럼에 충전되는 수지가 실리카겔 기재 수지인 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피에서, 용리제가 헥산, 메탄올, 테트라히드로퓨란, 및 포름산의 혼합물이고, 혼합물의 혼합 비율이 헥산/메탄올/테트라히드로퓨란/포름산 = 40-60:30-50:10-20:0.1-5 이며, 컬럼 온도가 10 내지 6O℃이고, 280 nm에서의 흡광도가 측정되는 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 각 n-중합체의 정량적 비율 (b%)이 고성능 액체 크로마토그래피에서 수득된 피크 영역에 기초하여 다음의 식으로부터 계산되는 방법:
    b% = {피크 영역 (각 n-중합체)}/{총 피크 영역 (모든 중합체)} x 100 ... (식 3)
  16. 제 11 항에 있어서, (c) 단계에서의 각 n-중합체의 중량이 (a)에 의해 측정된 OPC의 중량 및 (b)에 의해 측정된 각 n-중합체의 비율에 기초하여 다음의 식에 의해 측정되는 방법:
    n-중합체의 양 (mg) = OPC의 총 중량 (mg) x n-중합체의 비율 (b%)/100 ... (식 4)
  17. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석되는 올리고머성 프로안토시아니딘이 다음의 화학식에 의해 표시되는 하나 이상의 화합물을 함유하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112010047709316-pct00008
  18. 제 17 항에 있어서, 올리고머성 프로안토시아니딘이 n = 0인 구조식 1의 프로시아니딘 B1, B2, B3 및 B4, n1 = 1 및 n2 = 0인 구조식 2의 프로시아니딘 B5, B6, B7 및 B8, 그리고 n = 1인 구조식 1의 프로시아니딘 C1, C2 및 C4 중 하나 이상을 함유하는 프로안토시아니딘인 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 천연 물질, 이의 가공 제품, 식품 또는 음료, 의약품, 화장품, 또는 이들의 둘 이상의 조합물인 방법.
  20. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해, 분석물에 함유된, 올리고머성 프로안토시아니딘 (OPC)의 중합도가 상이한 n-중합체들의 비율을 측정하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피에 사용되는 컬럼이 순상 컬럼인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 순상 컬럼에 충전되는 수지가 실리카겔 기재 수지인 방법.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피에서, 용리제가 헥산, 메탄올, 테트라히드로퓨란, 및 포름산의 혼합물이고, 혼합물의 혼합 비율이 헥산/메탄올/테트라히드로퓨란/포름산 = 40-60:30-50:10-20:0.1-5 이며, 컬럼 온도가 10 내지 60℃이고, 280 nm에서의 흡광도가 측정되는 방법.
  24. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 각 n-중합체의 비율 (b%)이 고성능 액체 크로마토그래피에서 수득된 피크 영역에 기초하여 다음의 식으로부터 계산되는 방법:
    b% = {피크 영역 (각 n-중합체)}/{총 피크 영역 (모든 중합체)} x 100... (식 3)
  25. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 20 항, 제 21 항 및 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 비알콜성 음료 또는 청량 음료, 차 음료, 또는 알콜성 음료를 포함하는 액체인 경우, 감압 하에 분석물을 건조 상태로 동결건조시키거나 응결시키는 단계 및 이어지는 분말화 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제 8 항에 있어서, 열분해가 80 내지 100℃의 온도에서, 1시간 이상의 반응 시간 동안 수행되는 방법.
  27. 제 14 항에 있어서, 혼합물의 혼합 비율이 등용매 용리시 헥산/메탄올/테트라히드로퓨란/포름산 = 45:40:14:1 이며, 컬럼 온도가 40℃인 방법.
  28. 제 23 항에 있어서, 혼합물의 혼합 비율이 등용매 용리시 헥산/메탄올/테트라히드로퓨란/포름산 = 45:40:14:1 이며, 컬럼 온도가 40℃인 방법.
  29. 제 19 항에 있어서, 천연 물질이 포도씨, 타마린드, 사과, 수피, 송피 추출 폴리페놀, 찻잎 및 코코아로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
  30. 제 19 항에 있어서, 상기 가공 제품이 추출물인 방법.
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