KR20160098982A - 헛개나무 추출물의 품질 평가방법 - Google Patents

헛개나무 추출물의 품질 평가방법 Download PDF

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유혜현
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한양대학교 에리카산학협력단
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Abstract

본 발명은, 헛개나무 추출물에 함유된 약리성분을 빠른시간내에 뚜렷하게 분리할 수 있고, 분리된 복수의 약리성분에 대해 실시간으로 정성 및 정량 분석이 가능하며, 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계; 및 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성 분석 또는 정량 분석 단계를 포함하고, 상기 전개용매는 카복시산 화합물 및 나이트릴계 화합물을 포함하며, 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 초기(0분)에서 초기로부터 1분 내지 10분(t1)까지는 90:10 내지 70:30의 범위 내의 비율(R1)로 유지시키고, 상기 t1에서 초기로부터 20분 내지 30분(t2)까지는 상기 R1에서 50:50 내지 75:25의 비율(R2)까지 점차 변화시키고, 상기 t2에서 초기로부터 25분 내지 40분(t3)까지는 상기 R2에서 5:95 내지 20:80의 비율(R3)까지 점차 변화시키고, 상기 t3에서 초기로부터 30분 내지 40분(t4)까지는 R3의 비율로 유지시키는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법에 관한 것이다.

Description

헛개나무 추출물의 품질 평가방법{METHOD FOR QUALITY EVALUATION OF HOVENIA DULCIS EXTRACT}
본 발명은 헛개나무 추출물의 품질 평가방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 헛개나무 추출물에 함유된 약리성분을 빠른시간내에 뚜렷하게 분리할 수 있고, 분리된 복수의 약리성분에 대해 실시간으로 정성 및 정량 분석이 가능한 헛개나무 추출물의 품질 평가방법에 관한 것이다.
헛개나무는 일반적으로 한국, 중국, 일본에서 발견되며, 동양 의학에서 민간 요법으로 널리 사용되어 왔다. 특히, 최근에는 헛개나무의 열매 줄기가 알코올 중독, 간 보호 활성, 항산화 활성, 항당뇨병 활성, 항비만 활성, 항암 활성 이후 해독효과가 우수한 것으로 밝혀짐에 따라, 건강 기능 식품에 주원료로서 사용되고 있다.
구체적으로, 최근 발표된 보고서에 따르면, 헛개나무 추출물을 함유하는 음료 제품이 쥐 실험 결과 에탄올에 의한 숙취 해소효과가 뛰어남이 입증되었고, 또 다른 연구에서는 헛개 열매 추출물이 높은 항산화 활성과 알코올 탈수소 효소 활성을 가지고 있음을 보여 주었다.
헛개나무 추출물이 이와 같이 우수한 약리효과를 보이는 이유에 대해 연구가 계속되어 왔고, 구체적으로 헛개나무 추출물에는 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)으로 대표되는 4종의 주요한 약리 성분이 함유되어 있는 것으로 확인되고 있다.
암페롭신(Ampelopsin)은 알코올에 의한 근육 이완, 간 보호 활성 및 알코올 중독과 의존성에 대한 억제 효과가 있고, 탁시폴린(Taxifolin)은 항산화 활성을 통해 유전자를 조절함으로써 잠재적인 암 예방 효과가 있으며, 마이리세틴(Myricetin)은 항 알레르기, 항산화 및 항당뇨 효과가 있고, 케르세틴(Quercetin)은 암 치료의 효율성을 강화하고, 고지방식이에 의한 지방 축적을 감소시키는 효과가 있다.
따라서, 헛개나무 추출물이 함유된 건강기능식품의 품질은 상기 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)으로 대표되는 4종의 주요한 약리 성분에 대한 정성 및 정량분석을 통해 확인할 수 있다.
그러나, 헛개나무 추출물에 함유된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 뚜렷하게 분리하여 동시에 정성, 정량분석하는데에는 한계가 있었다.
이에, 헛개나무 추출물에 함유된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 간단한 방법으로 뚜렷하게 분리하면서 동시에 용이하게 정성, 정량분석이 가능한 기술의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 헛개나무 추출물에 함유된 약리성분을 빠른시간내에 뚜렷하게 분리할 수 있고, 분리된 복수의 약리성분에 대해 실시간으로 정성 및 정량 분석이 가능한 헛개나무 추출물의 품질 평가방법을 제공하기 위한 것이다.
본 명세서에서는, 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계; 및 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성 분석 또는 정량 분석 단계를 포함하고, 상기 전개용매는 카복시산 화합물 및 나이트릴계 화합물을 포함하며, 상기 전개용매는 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액을 포함하며, 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 초기(0분)에서 초기로부터 1분 내지 10분(t1)까지는 90:10 내지 70:30의 범위 내의 비율(R1)로 유지시키고, 상기 t1에서 초기로부터 20분 내지 30분(t2)까지는 상기 R1에서 50:50 내지 75:25의 비율(R2)까지 점차 변화시키고, 상기 t2에서 초기로부터 25분 내지 40분(t3)까지는 상기 R2에서 5:95 내지 20:80의 비율(R3)까지 점차 변화시키고, 상기 t3에서 초기로부터 30분 내지 40분(t4)까지는 R3의 비율로 유지시키는 헛개나무 추출물의 품질 평가방법이 제공된다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 헛개나무 추출물의 품질 평가방법에 대하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
발명의 일 구현예에 따르면, 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계; 및 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성 분석 또는 정량 분석 단계를 포함하고, 상기 전개용매는 카복시산 화합물 및 나이트릴계 화합물을 포함하며, 상기 전개용매는 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액을 포함하며, 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 초기(0분)에서 초기로부터 1분 내지 10분(t1)까지는 90:10 내지 70:30의 범위 내의 비율(R1)로 유지시키고, 상기 t1에서 초기로부터 20분 내지 30분(t2)까지는 상기 R1에서 50:50 내지 75:25의 비율(R2)까지 점차 변화시키고, 상기 t2에서 초기로부터 25분 내지 40분(t3)까지는 상기 R2에서 5:95 내지 20:80의 비율(R3)까지 점차 변화시키고, 상기 t3에서 초기로부터 30분 내지 40분(t4)까지는 R3의 비율로 유지시키는 헛개나무 추출물의 품질 평가방법이 제공될 수 있다.
본 발명자들은 상술한 특정의 헛개나무 추출물의 품질 평가방법을 이용하면, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 투입되는 전개용매의 흐름조건(gradient elution)을 조절함으로써, 헛개나무 추출물에 함유된 4종의 주요 약리성분인 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 빠른 시간내에 뚜렷하게 분리할 수 있다는 점을 실험을 통하여 확인하고 발명을 완성하였다.
특히, 상기 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 분리과정에서는 특징적인 전개용매의 흐름조건에 따라, 분리 과정이 빠른 시간내에 진행되면서, 화학적으로 유사한 구조를 가져 일반적인 분리방법을 통해서는 효과적인 분리가 어려웠던 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 동시에 분리 및 분석할 수 있다.
구체적으로, 종전 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 분리과정에서 사용되던 등용매 용리(Isocratic elution)조건의 경우, 용매 조성에 따라 용출속도가 지나치게 느려져 검출대상인 모든 성분의 피크가 분리되기 까지 지나치게 많은 시간이 소요되거나, 용출속도가 지나치게 빨라져 검출대상 중 일부 성분이 피크 분리되지 못한채 다른 성분들과 함께 용출되어 크로마토그램 상에서 확인이 어려운 한계가 있었다.
한편, 상기 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에는 분리된 4종의 약리성분의 정성 및 정량분석에 필요한 광검출기가 장착되어 단일 장비내에서 단한번의 시료주입만으로 간편하게 성분 분리, 정성분석, 정량분석이 동시에 진행될 수 있다.
이에 따라, 기존의 헛개나무 추출물의 품질 평가방법에 비해 상기 일 구현예의 헛개나무 추출물의 품질평가방법은 헛개나무 추출물에 주로 함유되는 4종의 주요 약리성분인 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)에 대하여 동시에 정성 및 정량분석을 진행할 수 있고, 단일 장비내에서 간편하고 신속하게 품질을 평가할 수 있는 장점이 있다.
구체적으로, 상기 일 구현예의 헛개나무 추출물의 품질 평가방법은 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 시료는 헛개나무 추출물을 포함할 수 있다. 상기 헛개나무 추출물은 헛개나무에 대해 추출용매를 주입한 후, 추출과정을 통해 얻어진 물질을 의미하며, 구체적인 추출조건, 장치, 방법에 관한 내용은 기존에 알려진 식물 추출물에 관한 내용을 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 헛개나무 열매건조분말을 물을 이용하여 추출하는 방법을 들 수 있다.
상기 시료는 헛개나무 추출물과 함께 추출용매, pH 완충 용액, 및 내부 표준물질 등을 더 포함할 수 있다.
상기 내부 표준 물질(Internal Standard, IS)은 시료에 가하는 표준물질로서, 기기 등에 의해 정량분석을 하는 경우, 피검사시료에 일정량의 표준물질을 가한 후 분석조작을 통해 얻어진 분석치와 가한 표준물질의 양을 비교함으로써 시료 중의 성분을 정량하는 방법을 내부표준법에 이용되는 물질이다. 상기 내부 표준 물질의 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 코르티손(Cortisone) 등을 포함할 수 있다.
상기 헛개나무 추출물에 함유된 약리 성분으로는 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin), 케르세틴(Quercetin)을 들 수 있으며, 이들 약리 성분은 액체 크로마토그래피에 의해 머무름 시간의 차이를 통해 분리될 수 있다.
구체적으로, 상기 암페롭신(Ampelopsin)은 알코올에 의한 근육 이완, 간 보호 활성 및 알코올 중독과 의존성에 대한 억제 효과가 있는 물질로서, 하기 화학식1로 표시되는 구조를 가질 수 있다.
[화학식1]
Figure pat00001
또한, 상기 탁시폴린(Taxifolin)은 항산화 활성을 통해 유전자를 조절함으로써 잠재적인 암 예방 효과가 있는 물질로서, 하기 화학식2로 표시되는 구조를 가질 수 있다.
[화학식2]
Figure pat00002
또한, 상기 마이리세틴(Myricetin)은 항 알레르기, 항산화 및 항당뇨 효과가 있는 물질로서, 하기 화학식3으로 표시되는 구조를 가질 수 있다.
[화학식3]
Figure pat00003
또한, 상기 케르세틴(Quercetin)은 암 치료의 효율성을 강화하고, 고지방식이에 의한 지방 축적을 감소시키는 효과가 있는 물질로서, 하기 화학식4로 표시되는 구조를 가질 수 있다.
[화학식4]
Figure pat00004
상술한 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)은 각각의 화학구조를 통해 확인할 수 있듯이, 상당히 유사한 형태의 화학구조를 가짐에 따라, 종래 사용되던 분리분석 기법을 통해서는 구별해내기가 어려운 한계가 있었다.
반면, 상기 일 구현예의 헛개나무 추출물의 품질 평가방법을 이용하면, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 투입되는 전개용매의 흐름조건(gradient elution)을 조절함으로써, 헛개나무 추출물에 함유된 4종의 주요 약리성분인 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)이 머무름시간의 차이가 명확해짐에 따라, 효과적인 분리가 가능해질 수 있다.
한편, 상기 일 구현예의 헛개나무 추출물의 품질 평가방법은 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 상기 4종의 약리성분을 분리시킬 수 있다.
상기 액체 크로마토그래피(liquid chromatography, LC)는 크로마토그래피를 어떤 액체성분의 이동상에 의해 수행하는 방법의 일종으로서, 이동상을 기체로 사용하는 가스크로마토그래피와 대비되는 크로마토그래피를 의미하며, 고정상의 형태, 고정상­이동상 사이의 물질분배기구 등이 구체적인 종류에 대해서는 크게 한정되지 않으며, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance liquid chromatography, HPLC)로서 Shield RP18 컬럼을 사용할 수 있다.
한편, 상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료는 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시킬 수 있다. 상기 전개용매(Mobile phase)는 크로마토그래피를 사용하여 성분 분리를 할 때, 칼럼에 충전된 고정상에 대해 상대적으로 이동하여 나가는 기체 또는 액체의 상을 의미하며, 상기 전개용매는 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액을 포함할 수 있다.
상기 카복시산 화합물 용액은 순수한 카복시산 화합물, 또는 카복시산 화합물과 용매의 혼합물로서, 상기 카복시산 화합물은 탄소수 1 내지 10의 모노카르복시산을 포함할 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 10의 모노카르복시산의 예가 크게 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, 선형 또는 분지형의 포름산, 아세트산, 프로판산, 부틸산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산 등을 들 수 있다. 용매로는 물 등의 수계용매 뿐 아니라, 널리 알려진 다양한 종류의 유기 또는 무기 용매를 제한없이 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 카복시산 화합물 용액은 농도가 0.01% 내지 10%, 또는 0.05% 내지 1%인 아세트산 수용액을 포함할 수 있다.
또한, 상기 나이트릴계 화합물 용액은 순수한 나이트릴계 화합물, 또는 나이트릴계 화합물과 용매의 혼합물로서, 상기 나이트릴계 화합물은 나이트릴 화합물 또는 이의 유도체 화합물을 포함할 수 있다. 상기 유도체란 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물을 의미하며, 대개 화합물 중의 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 말한다.
상기 나이트릴계 화합물의 예로는 아세토니트릴(acetonitrile), 프로피오니트릴(propionitrile), 부티로니트릴(butyronitrile), t-부틸 시아나이드(t-butyl cyanide), 발레로니트릴(valeronitrile), 카프릴로니트릴(caprylonitrile 또는 heptylcyanide), 헵탄니트릴(heptanenitrile), 사이클로펜탄 카보니트릴(cyclopentane carbonitrile), 사이클로헥산 카보니트릴(cyclohexane carbonitrile), 2-플루오로벤조니트릴(2-fluorobenzonitrile), 4-플루오로벤조니트릴(4-fluorobenzonitrile), 디프루오로벤조니트릴(difluorobenzonitrile), 트리플루오로벤조니트릴(trifluorobenzonitrile), 2-클로로벤조니트릴(2-chlorobenzonitrile), 4-클로로벤조니트릴(4-chlorobenzonitrile), 디클로로벤조니트릴(dichlorobenzonitrile), 트리클로로벤조니트릴(trichlorobenzonitrile), 2-클로로-4-플루오로벤조니트릴(2-chloro-4-fluorobenzonitrile), 4-클로로-2-플루오로벤조니트릴(4-chloro-2-fluorobenzonitrile), 페닐아세토니트릴(phenylacetonitrile), 2-플루오로페닐아세토니트릴(2-fluorophenylacetonitrile) 및 4-플루오로페닐아세토니트릴(4-fluorophenylacetonitrile)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 들 수 있다. 용매로는 물 등의 수계용매 뿐 아니라, 널리 알려진 다양한 종류의 유기 또는 무기 용매를 제한없이 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 나이트릴계 화합물 용액은 농도가 90% 이상, 또는 90% 내지 100%인 아세토니트릴(acetonitrile) 용액을 포함할 수 있다.
특히, 상기 전개용매로 사용되는 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 초기(0분)에서 초기로부터 1분 내지 10분(t1)까지는 90:10 내지 70:30의 범위 내의 비율(R1)로 유지시키고, 상기 t1에서 초기로부터 20분 내지 30분(t2)까지는 상기 R1에서 50:50 내지 75:25의 비율(R2)까지 점차 변화시키고, 상기 t2에서 초기로부터 25분 내지 40분(t3)까지는 상기 R2에서 5:95 내지 20:80의 비율(R3)까지 점차 변화시키고, 상기 t3에서 초기로부터 30분 내지 40분(t4)까지는 R3의 비율로 유지시킬 수 있다.
상기 초기(0분)이란 상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시키기 시작한 최초의 시점을 의미한다. 또한, 상기 t1, t2, t3, t4 시점은 각각 상기 초기(0분) 시점으로부터 일정 시간이 지난 후의 시점을 의미한다. 구체적인 예를 들면, 상기 t1은 초기(0분)으로부터 1분 내지 10분의 시간이 지난 후의 시점을 의미하며, 상기 t2은 초기(0분)으로부터 20분 내지 30분의 시간이 지난 후의 시점을, 상기 t3은 초기(0분)으로부터 25분 내지 40분의 시간이 지난 후의 시점을, 상기 t4은 초기(0분)으로부터 30분 내지 40분의 시간이 지난 후의 시점을 의미한다.
또한, 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율은 카복시산 화합물 용액:나이트릴계 화합물 용액으로 기재하였다. 구체적으로 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 초기(0분)에서 초기로부터 1분 내지 10분(t1)까지는 90:10 내지 70:30의 범위 내의 비율(R1)로 유지시켰다는 내용은, 초기(0분)에서 초기로부터 1분 내지 10분(t1)까지는 카복시산 화합물 용액:나이트릴계 화합물 용액의 부피비율을 90:10 내지 70:30 범위내로 유지시켰음을 의미한다.
보다 구체적으로 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 초기(0분)에서 초기로부터 3분(t1)까지는 80:20의 비율(R1)로 유지시키고, 상기 t1에서 초기로부터 27분(t2)까지는 상기 R1에서 62:38의 비율(R2)까지 점차 변화시키고, 상기 t2에서 초기로부터 28분(t3)까지는 상기 R2에서 10:90의 비율(R3)까지 점차 변화시키고, 상기 t3에서 초기로부터 33분(t4)까지는 R3의 비율로 유지시킬 수 있다.
이와 같이 전개용매의 부피비율을 시간에 따라 조절함에 따라, 피크(peak) 모양과 인텐시티(intensity)가 현저히 개선되며, 성분간의 머무름시간 차이가 명확해져 상술한 4종의 약리 성분을 뚜렷하게 분리해낼 수 있고, 머무름시간이 30분이내에 측정됨에 따라 빠른 시간내에 분리가 가능하다.
또한, 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 t3에서 초기로부터 30분 내지 40분(t4)까지는 R3의 비율로 유지시킨 후에는, 상기 t4에서 초기로부터 35분 내지 50분(t5)까지 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 R3에서 R1까지 점차 변화시킬 수 있다. 상기 t4에서 초기로부터 35분 내지 50분(t5)까지 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 R3에서 R1까지 점차 변화시키는 과정은 보다 구체적으로 상기 t4에서 초기로부터 39분(t5)까지 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 R3에서 R1까지 점차 변화시킬 수 있다.
또한, 상기 전개용매의 사용량은 0.1㎖ 내지 10㎖, 또는 2㎖ 내지 8㎖, 또는 4㎖ 내지 6㎖일 수 있다. 상기 전개용매의 사용량이 0.1㎖미만이면, 피크 모양과 인텐시티 개선 정도가 미미하며, 상기 전개용매의 사용량이 10㎖ 초과이면, 더 이상의 피크 모양과 인텐시티의 개선이 증가하지 않을 수 있다.
상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계는, 전개용매의 유속이 1.0 ㎖/min인 조건에서 30분 이내에 완료될 수 있다. 이와 같이, 상기 약리성분의 분리가 빠른 시간내에 완료됨에 따라, 상기 일 구현예의 헛개나무 추출물의 품질 평가방법의 효율성이 향상될 수 있다.
또한, 상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계에서, 상기 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)은 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin), 케르세틴(Quercetin)의 순으로 분리될 수 있다.
상기 순서의 기준은 용출되어 나오는 시간이 빠른 순서이며, 예를 들어, 암페롭신(Ampelopsin)이 가장 먼저 용출된 후에 차례로 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin), 케르세틴(Quercetin)이 용출되어 분리될 수 있다.
구체적으로, 상기 암페롭신(Ampelopsin)은 초기(0분)로부터 5분 이후에 분리되고, 상기 케르세틴(Quercetin)은 초기(0분)로부터 30분 이내에 분리될 수 있다. 상기 초기(0분)이란 상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시키기 시작한 최초의 시점을 의미한다.
상기 암페롭신(Ampelopsin)은 초기(0분)로부터 5분 이후에 분리됨에 따라, 상기 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin), 케르세틴(Quercetin)이 다른 성분들과 함께 용출되면서 크로마토그램상에서 구별이 어려워지는 것을 방지할 수 있다.
상기 암페롭신(Ampelopsin)이 초기(0분)로부터 5분 이전에 분리될 경우, 초기(0분)으로부터 5분 이전의 시간에 함께 용출되는 다양한 성분과 구별이 어려워질 수 있다.
한편, 상기 케르세틴(Quercetin)은 초기(0분)로부터 30분 이내에 분리됨에 따라, 크로마토그래피에 의한 분리과정이 30분이내에 모두 완료되어, 품질평가방법의 효율성이 향상될 수 있다.
또한, 상기 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)은 3분 내지 10분의 간격으로 분리될 수 있다. 이에 따라, 상기 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 간에도 서로 겹치치 않으면서 명확한 분리를 달성할 수 있다.
구체적인 예를 들면, 하기 도1에 나타난 바와 같이, 상기 암페롭신(Ampelopsin)은 상기 일구현예의 분리단계에서 초기(0분)로부터 6.215 분, 상기 탁시폴린(Taxifolin)은 초기(0분)로부터 10.774 분, 상기 마이리세틴(Myricetin)은 초기(0분)로부터 18.055 분, 상기 케르세틴(Quercetin)은 초기(0분)로부터 26.040 분 후에 용출되어 분리될 수 있다.
상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계 이전에, 헛개나무 추출물을 원심분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 원심분리는 원심분리기를 이용하여 상온에서 10,000 xg 내지 15,000 xg, 또는12,000 xg 내지 14,000 xg, 또는 13,000 xg 내지 13,500 xg 로 2분 내지 10분동안 1회 이상 진행될 수 있다. 상기 상온이란, 평상시의 온도로서 20℃ 내지 30℃의 온도를 의미한다.
상기 원심분리 이후, 수득한 상등액을 시료로서 사용할 수 있다. 상기 상등액은 침전 또는 침전물의 상부에 존재하는 투명한 액체를 의미하며, 상기 상등액의 수득 방법의 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 마이크로 피펫 등을 이용하여 획득할 수 있다.
또한, 상기 일 구현예의 헛개나무 추출물의 품질 평가방법은 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성 분석 또는 정량 분석 단계를 포함할 수 있다.
상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계; 및 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성 분석 또는 정량 분석 단계는 동시 또는 순차적으로 진행될 수 있다.
상술한 분리단계와 정성 분석 또는 정량 분석단계가 동시에 진행되는 경우라 함은, 상기 분리단계와 분석단계가 단일 장비내에서 진행됨을 의미한다. 상기 일 구현예의 헛개나무 추출물의 품질 평가방법에서는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 정성분석에 필요한 광검출기가 장착되어 있어, 단일 장비내에서 단한번의 시료주입만으로 간편하게 성분 분리, 정성분석, 정량분석이 동시에 진행될 수 있다.
구체적으로, 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성분석 단계는, 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)에 200 ㎚ 내지 400 ㎚ 파장에 대한 흡광도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)은 200 ㎚ 내지 400 ㎚ 파장에 대한 흡광도 측정 결과가 상이하여, 이를 통해 분리된 성분에 대한 정성분석을 진행할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)에 대해 200 ㎚ 내지 400 ㎚ 파장에 대한 흡광도를 측정하는 단계 이후, 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 표준용액의 흡광도를 이용하여 정성 또는 정량분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 표준용액은 특정 농도를 갖도록 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 용매에 용해시킨 용액을 의미하며, 이러한 표준용액의 흡광도를 이용하여 정성 분석 내지 정량분석을 진행할 수 있다.
상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin), 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성분석은 상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 UV 스펙트럼의 형태, 최대 흡수 파장의 위치를 상기 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 표준용액의 UV 스펙트럼의 형태, 최대 흡수 파장의 위치와 비교하여 대응되는 성분을 정성적으로 평가할 수 있다.
상기 정성분석은 상술한 바와 같이, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 장착된 광검출기에 의해 수행할 수 있다. 상기 광검출기의 예로는 포토 다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector)를 들 수 있다.
상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정량분석 단계에서, 정량분석의 구체적인 방법의 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 표준용액의 농도-흡광 면적 검정곡선을 이용하는 방법을 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 각각 80% 메탄올 수용액에 용해시켜 10, 20, 50, 100, 200, 500 μg/mL의 농도를 갖는 총 24개의 표준용액을 제조한 다음, 각각의 표준용액에 대하여 200 ㎚ 내지 400 ㎚ 파장에 대한 흡광 면적을 구하여, 표준용액의 농도와 200 ㎚ 내지 400 ㎚ 파장에 대한 흡광 면적간의 관계식인 일차식의 검정곡선을 유도할 수 있다.
그리고, 상기 일 구현예의 헛개나무 추출물이 함유된 시료에 대한 200 ㎚ 내지 400 ㎚ 파장에 대한 흡광 면적을 상기 검정곡선식에 대입하여 시료에 함유된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 함량을 구할 수 있다.
본 발명에 따르면, 헛개나무 추출물에 함유된 약리성분을 빠른시간내에 뚜렷하게 분리할 수 있고, 분리된 복수의 약리성분에 대해 실시간으로 정성 및 정량 분석이 가능한 헛개나무 추출물의 품질 평가방법이 제공될 수 있다.
도 1은 실시예에서 측정된 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2은 비교예1에서 얻어진 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 비교예2에서 얻어진 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예에서 얻어진 UV 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 표준용액에 대한 UV 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
발명을 하기의 실시예에서 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1 내지 4: 헛개나무 추출물의 제조>
제조예1
헛개나무(H. dulcis) 열매건조분말[sample 0703] 25g을 100℃의 물 1L로 3시간 동안 추출하고, 추출액을 4000rpm의 속도로 10분동안 원심분리하여 얻은 헛개나무 추출물(Lifetree Biotech Co., Ltd 제조)을 80% 메탄올 수용액(J. T. Baker(Phillipsburg,NJ.USA) 제조)에 용해시켜, 250 ㎎/㎖ 농도의 추출용액을 제조하였다.
상기 추출용액을 13200rpm의 속도로 5분동안 원심분리하고, 상등액을 취해 0.45 ㎛의 PTFE 시린지 필터를 통해 여과시켜 검출용 시료를 제조하였다.
제조예2
상기 헛개나무(H. dulcis) 열매건조분말로 sample 0703 대신 수확시기와 입수처가 상이한 sample 0701을 사용한 점을 제외하고는 상기 제조예1과 동일한 방법으로 검출용 시료를 제조하였다.
제조예3
상기 헛개나무(H. dulcis) 열매건조분말로 sample 0703 대신 수확시기와 입수처가 상이한 sample 0807-5을 사용한 점을 제외하고는 상기 제조예1과 동일한 방법으로 검출용 시료를 제조하였다.
제조예4
상기 헛개나무(H. dulcis) 열매건조분말로 sample 0703 대신 수확시기와 입수처가 상이한 sample 0807-6을 사용한 점을 제외하고는 상기 제조예1과 동일한 방법으로 검출용 시료를 제조하였다.
<실시예: 헛개나무 추출물 품질평가방법>
(1) HPLC를 이용한 성분 분리
상기 제조예에서 얻어진 검출용 시료를 20℃에서 포토 다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector)가 탑재된 Agilent 1260 HPLC 측정기의 Shield RP18 컬럼으로 통과시켜 주요성분을 각각 분리하였다.
이때, 전개용매로는 0.1% 농도의 아세트산 수용액(이하, 용액 A)과 100% 농도의 아세토니트릴 용액(이하, 용액 B)을 사용하였고, 유속은 1.0 ㎖/min으로 10㎕을 흘려주었으며 분석시의 전개용매 주입 조건(gradient elution)은 다음과 같았다.
(가) 초기(t0)에서 초기로부터 3분(t1)까지 3분간 용액 A:용액 B의 부피비율을 80:20(R1)으로 일정하게 유지하였다.
(나) 상기 3분(t1)에서 초기로부터 27분(t2)까지 24분간 용액 A:용액 B의 부피비율을 80:20(R1)에서 62:38(R2)까지 변화시켰다.
(다) 상기 27분(t2)에서 초기로부터 28분(t3)까지 1분간 용액 A:용액 B의 부피비율을 62:38(R2)에서 10:90(R3)까지 변화시켰다.
(라) 상기 28분(t3)에서 초기로부터 33분(t4)까지 5분간 용액 A:용액 B의 부피비율을 10:90(R3)에서 일정하게 유지시켰다.
(마) 상기 33분(t4)에서 초기로부터 39분(t5)까지 6분간 용액 A:용액 B의 부피비율을 10:90(R3)에서 80:20(R1)으로 변화시켰다.
(2) UV 스펙트럼을 이용한 정성분석 및 정량분석
상기 분리된 주요성분에 대해 Agilent 1260 HPLC 측정기 내에 탑재된 포토 다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector)를 이용하여 200 ㎚ 내지 400 ㎚ 파장의 자외선 영역에서의 흡광스펙트럼을 통해 흡광도와 피크 면적을 측정하였다.
이후, 헛개나무 추출물의 주요 약리성분으로 알려진 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 표준용액에 대해서도 동일한 방법으로 흡광도와 피크 면적을 측정하였다.
그리고, 상기 분리된 주요성분의 흡광도 및 피크 면적과 표준용액의 흡광도 및 피크 면적을 상호비교하는 방법을 통해, 헛개나무 추출물에 포함된 주요성분의 종류 및 함량을 측정하여, 헛개나무 추출물의 품질을 평가하였다.
<비교예 1 내지 2: 헛개나무 추출물 품질평가방법>
비교예1
분석시의 전개용매 주입 조건(gradient elution)을 다음과 같이 변경한 것을 제외하고, 상기 실시예1과 동일하게 헛개나무 추출물의 품질을 평가하였다.
초기(t0)에서 초기로부터 39분(t5)까지 39분간 용액 A:용액 B의 부피비율을 90:10(R1´)으로 일정하게 유지하였다.
비교예2
분석시의 전개용매 주입 조건(gradient elution)을 다음과 같이 변경한 것을 제외하고, 상기 실시예1과 동일하게 헛개나무 추출물의 품질을 평가하였다.
초기(t0)에서 초기로부터 39분(t5)까지 39분간 용액 A:용액 B의 부피비율을 60:40(R1˝)으로 일정하게 유지하였다.
<실험예 : 실시예 및 비교예의 품질평가방법의 성능 측정>
상기 실시예 및 비교예의 헛개나무 추출물 품질평가방법의 성능을 측정한 결과를 하기에 나타내었다.
실험예1: 크로마토그램 분석
상기 실시예의 헛개나무 추출물 품질평가방법에서 HPLC에 의한 크로마토그램을 하기 도1에, 상기 비교예1 및 비교예2의 헛개나무 추출물 품질평가방법에서 HPLC에 의한 크로마토그램을 각각 하기 도2 및 도3에 나타내었다.
하기 도1에 나타난 바와 같이, 실시예의 헛개나무 추출물 품질평가방법에서는 6.215분의 머무름 시간(retension time)을 갖는 성분1, 10.774분의 머무름 시간을 갖는 성분2, 18.055분의 머무름 시간을 갖는 성분3, 26.040분의 머무름 시간을 갖는 성분4, 이렇게 4종의 주요성분이 30분이내에 각각 명확히 분리된 상태로 용출됨을 확인할 수 있었다.
한편, 하기 도2에 나타난 바와 같이, 비교예1의 헛개나무 추출물 품질평가방법에서는 30분 이내에 4종의 주요성분이 모두 용출되지 않은 것을 확인할 수 있었고, 하기 도3에 나타난 바와 같이, 비교예2의 헛개나무 추출물 품질평가방법에서는 3.5분의 머무름 시간(retension time)을 갖는 성분3, 6.4분의 머무름 시간을 갖는 성분4, 이렇게 2종의 주요성분이 피크 분리 가능하였고, 나머지 2종의 주요 성분(상기 실시예의 성분1, 성분2에 해당)은 다른 성분들과 혼합된 상태로 지나치게 빨리 용출되어 정성, 정량 분석이 어려움을 확인할 수 있었다.
즉, 상기실시예의 품질평가방법은 특정한 용매 주입조건(기울기 용리 조건)을 사용함에 따라, 헛개나무 추출물에 함유된 주요 성분의 머무름 시간 차이를 이용하여, 4종의 주요 성분을 빠짐없이 빠른시간내에 뚜렷하게 구분해 낼 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예2: UV 흡광스펙트럼 분석
(1) 정성분석 결과
상기 실시예의 헛개나무 추출물 품질평가방법에서 측정된 제조예의 검출용 시료에 대한 UV 흡광스펙트럼을 하기 도4에 나타내었다. 그리고, 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 표준용액에 대한 UV 흡광스펙트럼을 하기 도5에 나타내었다.
하기 도4 및 도5에 기재된 UV스펙트럼의 형태와 최대 광흡수 피크의 파장을 비교할 때, 상기 실험예1에서 분리된 성분1은 암페롭신(Ampelopsin), 성분 2는 탁시폴린(Taxifolin), 성분3은 마이리세틴(Myricetin), 성분4는 케르세틴(Quercetin)임을 각각 확인할 수 있었다.
(2) 정량분석 결과
헛개나무 추출물의 주요 약리성분인 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 각각 80% 메탄올 수용액에 용해시켜 10, 20, 50, 100, 200, 500 μg/mL의 농도를 갖는 총 24개의 표준용액에 대한 UV 흡광스펙트럼상 피크 면적을 측정하였다.
이후, 상기 24가지 표준용액의 농도와 UV 흡광스펙트럼에서의 피크 면적 데이터를 이용하여, 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 각각의 물질별로 표준용액의 농도와 UV 흡광스펙트럼에서의 피크 면적간의 관계를 나타내는 일차의 검정곡선(Calibration curve)을 구하고, 이를 하기 표1에 나타내었다.
암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 표준용액의 농도와 UV 흡광스펙트럼에서의 피크 면적간의 관계
구분 검정곡선 r2 Linear range
(μg/mL)		 LOD
(μg/mL)		 LOQ
(μg/mL)
암페롭신
(Ampelopsin)		 y = 2.07964x +4.94688 0.999 10 - 500 0.5 2.0
탁시폴린
(Taxifolin)		 y = 2.06722x +10.26886 0.999 10 - 500 0.5 1.0
마이리세틴
(Myricetin)		 y = 22.43971x -237.69323 0.999 10 - 500 0.2 0.5
케르세틴
(Quercetin)		 y = 25.70407x -171.98022 0.999 10 - 500 0.1 0.3
*LOD(Limit of detection) : 정성분석 한계치
*LOQ(Limit of quantitation) : 정량분석 한계치
그리고, 상기 실시예의 헛개나무 추출물 품질평가방법에 따라 측정된 제조예 1 내지 4의 검출용 시료에 대한 UV 흡광스펙트럼 피크 면적을 통해, 제조예 1 내지 4의 검출용 시료에 포함된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 함량를 구하고, 이를 하기 표2에 나타내었다.
실시예에 의해 얻어진 제조예 1 내지 4의 시료에 포함된 성분 함량
구분 Ampelopsin
(㎎/g)		 Taxifolin
(㎎/g)		 Myricetin
(㎎/g)		 Quercetin
(㎎/g)
제조예1 0.88 ± 0.05 0.86 ± 0.05 0.17 ± 0.01 0.13 ± 0.01
제조예2 1.19 ± 0.03 0.15 ± 0.01 0.24 ± 0.01 0.03 ± 0.00
제조예3 1.17 ± 0.03 0.93 ± 0.02 0.06 ± 0.01 0.04 ± 0.01
제조예4 0.33 ± 0.07 1.64 ± 0.01 0.04 ± 0.01 0.05 ± 0.01
상기 표2에 나타난 바와 같이, 상기 실시예의 헛개나무 추출물 품질평가방법에 따른 제조예 1 내지 4의 헛개나무 추출 시료에는 암페롭신(Ampelopsin) 0.33 내지 0.88㎎/g, 탁시폴린(Taxifolin) 0.15 내지 1.64㎎/g, 마이리세틴(Myricetin) 0.04 내지 0.24㎎/g, 케르세틴(Quercetin) 0.04 내지 0.13㎎/g 가량이 함유되어 있는 것으로 측정되어, 주로 암페롭신(Ampelopsin)과 탁시폴린(Taxifolin)이 풍부하게 함유되어 있는 것으로 확인되었다.
이와 같이, 실시예의 방법을 이용하면, 단일한 장비내에서 한번의 시료주입만으로 거의 비슷하거나 동시에 용출된 성분들을 고감도로 완벽히 구별할 수 있고, 이에 동반한 정량 분석 결과를 제공할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (14)

  1. 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계; 및
    상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성 분석 또는 정량 분석 단계를 포함하고,
    상기 전개용매는 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액을 포함하며,
    상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을,
    초기(0분)에서 초기로부터 1분 내지 10분(t1)까지는 90:10 내지 70:30의 범위 내의 비율(R1)로 유지시키고,
    상기 t1에서 초기로부터 20분 내지 30분(t2)까지는 상기 R1에서 50:50 내지 75:25의 비율(R2)까지 점차 변화시키고,
    상기 t2에서 초기로부터 25분 내지 40분(t3)까지는 상기 R2에서 5:95 내지 20:80의 비율(R3)까지 점차 변화시키고,
    상기 t3에서 초기로부터 30분 내지 40분(t4)까지는 R3의 비율로 유지시키는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 t3에서 초기로부터 30분 내지 40분(t4)까지는 R3의 비율로 유지시킨 후에,
    상기 t4에서 초기로부터 35분 내지 50분(t5)까지 상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을 R3에서 R1까지 점차 변화시키는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 카복시산 화합물 용액 및 나이트릴계 화합물 용액의 부피 비율을,
    초기(0분)에서 초기로부터 3분(t1)까지는 80:20의 비율(R1)로 유지시키고,
    상기 t1에서 초기로부터 27분(t2)까지는 상기 R1에서 62:38의 비율(R2)까지 점차 변화시키고,
    상기 t2에서 초기로부터 28분(t3)까지는 상기 R2에서 10:90의 비율(R3)까지 점차 변화시키고,
    상기 t3에서 초기로부터 33분(t4)까지는 R3의 비율로 유지시키는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계; 및
    상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성 분석 또는 정량 분석 단계는 동시 또는 순차적으로 진행되는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계는,
    상기 전개용매의 유속이 1.0 ㎖/min인 조건에서 30분 이내에 완료되는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계에서,
    상기 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)은 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin), 케르세틴(Quercetin)의 순으로 분리되는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 암페롭신(Ampelopsin)은 초기(0분)로부터 5분 이후에 분리되고, 상기 케르세틴(Quercetin)은 초기(0분)로부터 30분 이내에 분리되는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)은 3분 내지 10분의 간격으로 분리되는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 카복시산 화합물 용액은 농도가 0.01% 내지 10%인 아세트산 수용액을 포함하는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 나이트릴계 화합물 용액은 농도가 90% 이상인 아세토니트릴(acetonitrile) 용액을 포함하는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)의 정성 분석 또는 정량 분석 단계는,
    상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)에 대해 200 ㎚ 내지 400 ㎚ 파장에 대한 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 분리된 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)에 대해 200 ㎚ 내지 400 ㎚ 파장에 대한 흡광도를 측정하는 단계 이후,
    암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin) 표준용액의 흡광도를 이용하여 정성 또는 정량분석하는 단계를 더 포함하는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 헛개나무 추출물이 함유된 시료를 전개용매에 의해 액체 크로마토그래피로 통과시켜 암페롭신(Ampelopsin), 탁시폴린(Taxifolin), 마이리세틴(Myricetin) 및 케르세틴(Quercetin)을 분리시키는 단계 이전에,
    헛개나무 추출물을 원심분리하는 단계를 더 포함하는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 원심분리는 10,000 rpm 내지 15,000 rpm의 속도로 2분 내지 10분동안 진행되는, 헛개나무 추출물의 품질 평가방법.
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