CN113156036B - 亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，包括以下步骤：黄烷‑3‑醇单体分析；原花色素酸降解，得到作为待分析的酸降解产物；将待分析的酸降解产物利用反相液相色谱RPLC进行分析，根据RPLC和Hilic分析的黄烷‑3‑醇种类和含量的差异分析原花色素末端单元种类和含量，根据RPLC分析的黄烷‑3‑醇‑间苯三酚加成产物以及花色素分析原花色素延伸单元种类和含量；然后根据原花色素延伸单元和末端单元摩尔数计算原花色素平均聚合度。该方案取代传统方法中直接去除样品中黄烷‑3‑醇的步骤(耗时长)，极大地提高了原花色素的末端单元的分析速度。
Description
技术领域
本发明涉及一种亲水作用色谱和反相液相色谱联用快速分析原花色素结构的方法。
背景技术
原花色素是一类以黄烷-3-醇为结构单元的聚合型多酚，因单元种类、聚合度和连接方式不同而表现不同结构。原花色素的结构单元包括(表)儿茶素、(表)没食子儿茶素、(表)阿福豆素及其没食子酸酯。结构单元以C4→C6和C4→C8连接为B型原花色素，附加C2→O7连接为A型原花色素。大量研究表明，原花色素具有良好的抗氧化性、预防心脑血管疾病和减肥等多种活性功能，而这些功能与其结构密切相关，尤其是单元种类和聚合度。因此，分析原花色素结构对于其准确应用于功能产品至关重要。
已报导的原花色素结构分析技术方案涉及原花色素纯化、酸降解和降解产物分析。原花色素纯化一般采用Sephadex LH20树脂吸附含原花色素样品，50％甲醇水溶液洗脱5个柱体积以去除低分子量黄烷-3-醇单体，然后以70％丙酮水溶液洗脱3个柱体积，干燥获得纯化的原花色素。酸降解采用亲核试剂-间苯三酚于酸性甲醇溶液中解聚原花色素，产生原花色素延伸单元黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物和末端单元黄烷-3-醇。然后利用反相高效液相色谱分析加成产物和末端单元，获得原花色素结构信息。但是酸降解采用的酸性有机溶剂体系易引发原花色素降解生成花色素，会影响结构分析结果。
综上所述，目前已知的原花色素结构分析技术方案涉及的花色素生成会影响分析结果的准确性，而且原花色素纯化耗时长，导致该技术方案效率低。
发明内容
本发明针对原花色素结构分析结果不准确、耗时长的问题，提供一种亲水作用色谱(Hilic)和反相液相色谱(RPLC)联用快速分析原花色素结构的方法，该方法分析快速、结果准确，适用于各种含原花色素样品。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，包括以下步骤：
1)、黄烷-3-醇单体分析：
称取含原花色素的待测样品5.0mg，溶于1.0mL 97％(体积％)乙腈水溶液，作为待测样品溶液；将待测样品溶液过0.22μm滤膜后利用Hilic分析待测样品中的黄烷-3-醇单体；
2)、原花色素酸降解：
称取100mg间苯三酚和20mg抗坏血酸，溶于2mL 0.1mol/L盐酸甲醇溶液，配置成酸降解反应液；
将10.0mg含原花色素的待测样品溶于所述酸降解反应液中，于50℃反应20min，得酸降解产物，过0.22μm滤膜后，作为待分析的酸降解产物(可存储于-20℃)；
3)、酸降解产物分析：
将步骤2)所得的待分析的酸降解产物利用RPLC进行分析(即，分析样品酸降解产物)，以280nm检测待分析的酸降解产物中的黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物和黄烷-3-醇；
4)、数据分析：
根据RPLC和Hilic分析的黄烷-3-醇种类和含量的差异分析原花色素末端单元种类和含量，根据RPLC分析的黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物分析原花色素延伸单元种类和含量，然后计算原花色素平均聚合度(根据原花色素延伸单元和末端单元摩尔数计算原花色素平均聚合度)。
作为本发明的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法的改进：
所述步骤3)还包括：以550nm检测待分析的酸降解产物的花色素(为酸降解副产物)；
所述步骤4)对应为：根据RPLC分析的黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物以及花色素分析原花色素延伸单元种类和含量。
作为本发明的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法的进一步改进：
黄烷-3-醇单体包括：(表)儿茶素、(表)没食子儿茶素、(表)儿茶素没食子酸酯、(表)没食子儿茶素没食子酸酯；
黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物包括：儿茶素-间苯三酚加成产物、(表)儿茶素-间苯三酚加成产物、儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物、(表)儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物、没食子儿茶素-间苯三酚加成产物、(表)没食子儿茶素-间苯三酚加成产物、没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物、(表)没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物；
黄烷-3-醇包括：儿茶素、(表)儿茶素、没食子儿茶素、(表)没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、(表)儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、(表)没食子儿茶素没食子酸酯；
花色素包括：矢车菊素、飞燕草素。
作为本发明的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法的进一步改进：
当不检测待分析的酸降解产物中的花色素时，步骤4)中原花色素平均聚合度的计算公式为：
当检测待分析的酸降解产物中的花色素时，步骤4)中原花色素平均聚合度的计算公式为：
说明：黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物，是指其对应所有成分的浓度之和；其余以此类推。
作为本发明的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法的进一步改进：
步骤1)中：
液相色谱仪为Waters e2695色谱仪，检测器为Waters 2489紫外-可见光检测器，检测波长为280nm，色谱柱为Luna Hilic柱(250×4.6mm,5.0μm；Phenomenex)，柱温为30℃，进样量为10μL，洗脱速度为0.35mL/min；
流动相为含0.5％乙酸的乙腈(A)和含0.5％乙酸的水(B)，即A由0.5％的乙酸和99.5％的乙腈组成，B由0.5％乙酸和99.5％水组成，％为体积％；
洗脱梯度：0～30min,3％～13％B；
所得的峰面积利用以下曲线方程进行计算黄烷-3-醇单体的浓度：
(表)儿茶素：Y＝15.5X+4.7,R2＝0.996；
(表)没食子儿茶素：Y＝3.9X+2.1,R2＝0.993；
(表)儿茶素没食子酸酯：Y＝38.7X-0.3,R2＝0.998；
(表)没食子儿茶素没食子酸酯：Y＝27.4X-21.6,R2＝0.993；
Y是黄烷-3-醇峰面积(mAU*min)，X是对应黄烷-3-醇浓度(μg/mL)。
作为本发明的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法的进一步改进，所述步骤3)中：
RPLC分析条件如下：
液相色谱仪为Waters e2695色谱仪，检测器为Waters 2489紫外-可见光检测器，检测波长为280和550nm，色谱柱为Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5.0μm；Agilent)，柱温为30℃，进样量为10μL，洗脱速度为1.0mL/min；
流动相为含1％乙酸的水(A)和含1％乙酸的甲醇(B)。即，A由1％乙酸和99％的水组成，B由1％乙酸和99％甲醇组成，％为体积％；
洗脱梯度：0-10min，5％B；
10-30min，5％-20％B；
30-55min,20％-40％B；
①、所得的峰面积利用以下曲线方程进行计算待分析的酸降解产物中的黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物的浓度：
儿茶素-间苯三酚加成产物：Y＝14.1X+4.0,R2＝0.991；
(表)儿茶素-间苯三酚加成产物：Y＝13.8X+4.3,R2＝0.996；
儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y＝32.6X+1.3,R2＝0.991；
(表)儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y＝33.8X-0.2,R2＝0.995；
没食子儿茶素-间苯三酚加成产物：Y＝3.4X+3.7,R2＝0.997；
(表)没食子儿茶素-间苯三酚加成产物：Y＝3.6X+2.4,R2＝0.992；
没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y＝26.5X-32.1,R2＝0.992；
(表)没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y＝29.6X-13.7,R2＝0.996；
Y是黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物峰面积(mAU*min)，X是对应黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物浓度(μg/mL)；
②、所得的峰面积利用以下曲线方程进行计算待分析的酸降解产物中的黄烷-3-醇的浓度：
儿茶素：Y＝16.4X+2.4,R2＝0.992；
(表)儿茶素：Y＝15.2X+4.3,R2＝0.991；
没食子儿茶素：Y＝3.7X+4.3,R2＝0.997；
(表)没食子儿茶素：Y＝3.9X+2.7,R2＝0.992；
儿茶素没食子酸酯：Y＝36.9X+6.4,R2＝0.991；
(表)儿茶素没食子酸酯：Y＝38.4X+2.7,R2＝0.994；
没食子儿茶素没食子酸酯：Y＝29.1X-33.4,R2＝0.999；
(表)没食子儿茶素没食子酸酯：Y＝32.5X-17.3,R2＝0.993；
Y是黄烷-3-醇峰面积(mAU*min)，X是对应黄烷-3-醇浓度(μg/mL)；
③、所得的峰面积利用以下曲线方程进行计算待分析的酸降解产物中的花色素的浓度：
矢车菊素：Y＝61.5X-32.8,R2＝0.999；
飞燕草素：Y＝66.3X-43.1,R2＝0.995；
Y是花色素峰面积(mAU*min)，X是对应花色素浓度(μg/mL)。
在本发明中，
以黄烷-3-醇标准品为参照，配制浓度为100μg/mL的黄烷-3-醇的标准液，然后梯度稀释至50.0、25.0、10.0、5.0、2.5和1.0μg/mL，以此稀释液按照步骤1)进行检测，从而获得峰面积与稀释液中黄烷-3-醇浓度之间的对应关系，从而建立相应的曲线方程。
以黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物(制备方法参照论文J.AGR.FOOD CHEM.,2001,49(4):1740-1746和J.AGR.FOOD CHEM.,2011,59(5):1622-1629)、黄烷-3-醇和花色素标准品为参照，分析酸降解产物中加成产物、黄烷-3-醇和花色素的种类和浓度。具体如下：
配制浓度为100μg/mL黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物的标准液；然后梯度稀释至50.0、25.0、10.0、5.0、2.5和1.0μg/mL，以此稀释液按照上述方法进行检测，从而获得峰面积与稀释液中黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物浓度之间的对应关系，从而建立相应的曲线方程。
配制浓度为100μg/mL的黄烷-3-醇的标准液，然后梯度稀释至50.0、25.0、10.0、5.0、2.5和1.0μg/mL，以此稀释液按照上述方法进行检测，从而获得峰面积与稀释液中黄烷-3-醇浓度之间的对应关系，从而建立相应的曲线方程。
配制浓度为100μg/mL花色素的标准液；然后梯度稀释至50.0、25.0、10.0、5.0、2.5和1.0μg/mL，以此稀释液按照上述方法进行检测，从而获得峰面积与稀释液中花色素浓度之间的对应关系，从而建立相应的曲线方程。
本发明具有如下技术优势：
1、利用Hilic分析富含原花色素样品溶液中的黄烷-3-醇种类和浓度，通过与酸降解反应液中黄烷-3-醇种类和浓度进行比较，判断样品中原花色素的末端单元种类和含量；该方案取代传统方法中直接去除样品中黄烷-3-醇的步骤(耗时长)，极大地提高了原花色素的末端单元的分析速度。
2、分析酸降解过程中花色素生成的副反应，进一步提高了结构分析的准确性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是Hilic分析黄烷-3-醇标准品、葡萄籽提取物溶液中的黄烷-3-醇单体的色谱图。原花青素B1是葡萄籽中分子量最小的原花色素，用于标定原花色素和黄烷-3-醇单体之间的界限。
图2是本发明方法RPLC分析的原花色素酸降解生成副产物矢车菊素色谱图和矢车菊素标准品色谱图。
图3为本发明方法和传统方法RPLC分析黄烷-3-醇-间苯三酚和黄烷-3-醇的色谱图。
1：儿茶素-间苯三酚，2：表儿茶素-间苯三酚，3：儿茶素，4：表儿茶素没食子酸酯-间苯三酚，5：表儿茶素，6：表儿茶素没食子酸酯。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚，下面对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，但并不以此来限制本发明。
一、Hilic分析：
以(表)儿茶素及其没食子酸酯为标准品计算葡萄籽提取物溶液中各黄烷-3-醇的浓度。
一.1)、Hilic分析条件：
液相色谱仪为Waters e2695色谱仪，检测器为Waters 2489紫外-可见光检测器，检测波长为280nm，色谱柱为Luna Hilic柱(250×4.6mm,5.0μm；Phenomenex)，柱温为30℃，进样量为10μL，洗脱速度为0.35mL/min；
流动相为含0.5％乙酸的乙腈(A)和含0.5％乙酸的水(B)，即A由0.5％的乙酸和99.5％的乙腈组成，B由0.5％乙酸和99.5％水组成，％为体积％；
洗脱梯度：0～30min,3％～13％B。
一.2)、以黄烷-3-醇标准品为参照，分析样品溶液中黄烷-3-醇种类和浓度。具体如下：
配制浓度为100μg/mL的黄烷-3-醇(黄烷-3-醇标准品)的标准液(以97％乙腈水溶液为溶剂，且以此溶剂为稀释剂)，然后梯度稀释至50.0、25.0、10.0、5.0、2.5和1.0μg/mL，以此稀释液按照上述方法进行检测，从而获得峰面积与稀释液中黄烷-3-醇浓度之间的对应关系，建立曲线方程如下：
(表)儿茶素：Y＝15.5X+4.7,R2＝0.996；
(表)没食子儿茶素：Y＝3.9X+2.1,R2＝0.993；
(表)儿茶素没食子酸酯：Y＝38.7X-0.3,R2＝0.998；
(表)没食子儿茶素没食子酸酯：Y＝27.4X-21.6,R2＝0.993；
Y是黄烷-3-醇峰面积(mAU*min)，X是对应黄烷-3-醇浓度(μg/mL)。
说明：
15.5min，对应的是(表)儿茶素；19.0min，对应的(表)没食子儿茶素；22.8min，对应的(表)儿茶素没食子酸酯；27.1min，对应的(表)没食子儿茶素没食子酸酯。
二、RPLC分析
二.1)、RPLC分析条件：
液相色谱仪为Waters e2695色谱仪，检测器为Waters 2489紫外-可见光检测器，检测波长为280和550nm，色谱柱为Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5.0μm；Agilent)，柱温为30℃，进样量为10μL，洗脱速度为1.0mL/min；
流动相为含1％乙酸的水(A)和含1％乙酸的甲醇(B)。即A由1％的乙酸和99％的水组成，B由1％乙酸和99％甲醇组成，％为体积％；
洗脱梯度：0-10min，5％B；
10-30min，5％-20％B；
30-55min,20％-40％B。
二.2)、以黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物(制备方法参照论文J.AGR.FOOD CHEM.,2001,49(4):1740-1746和J.AGR.FOOD CHEM.,2011,59(5):1622-1629)、黄烷-3-醇和花色素标准品为参照，分析酸降解产物中加成产物、黄烷-3-醇和花色素的种类和浓度。
具体如下：
①、配制浓度为100μg/mL黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物的标准液(以甲醇为溶剂，且以此溶剂为稀释剂)；然后梯度稀释至50.0、25.0、10.0、5.0、2.5和1.0μg/mL，以此稀释液按照上述方法进行检测，从而获得峰面积与稀释液中黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物浓度之间的对应关系。建立曲线方程如下：
儿茶素-间苯三酚加成产物：Y＝14.1X+4.0,R2＝0.991；
表儿茶素-间苯三酚加成产物：Y＝13.8X+4.3,R2＝0.996；
儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y＝32.6X+1.3,R2＝0.991；
表儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y＝33.8X-0.2,R2＝0.995；
没食子儿茶素-间苯三酚加成产物：Y＝3.4X+3.7,R2＝0.997；
表没食子儿茶素-间苯三酚加成产物：Y＝3.6X+2.4,R2＝0.992；
没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y＝26.5X-32.1,R2＝0.992；
表没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y＝29.6X-13.7,R2＝0.996；
Y是黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物峰面积(mAU*min)，X是对应黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物浓度(μg/mL)。
说明：
14.4min，对应的是儿茶素-间苯三酚加成产物，
17.4min，对应的是表儿茶素-间苯三酚加成产物，
32.7min，对应的是儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物，
28.5min，对应的是表儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物，
7.8min，对应的是没食子儿茶素-间苯三酚加成产物，
12.9min，对应的是表没食子儿茶素-间苯三酚加成产物，
25.3min，对应的是没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物，
23.2min，对应的是表没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物。
②、配制浓度为100μg/mL的黄烷-3-醇的标准液(以甲醇为溶剂，且以此溶剂为稀释剂)，然后梯度稀释至50.0、25.0、10.0、5.0、2.5和1.0μg/mL，以此稀释液按照上述方法进行检测，从而获得峰面积与稀释液中黄烷-3-醇浓度之间的对应关系，建立曲线方程如下：
儿茶素：Y＝16.4X+2.4,R2＝0.992；
表儿茶素：Y＝15.2X+4.3,R2＝0.991；
没食子儿茶素：Y＝3.7X+4.3,R2＝0.997；
表没食子儿茶素：Y＝3.9X+2.7,R2＝0.992；
儿茶素没食子酸酯：Y＝36.9X+6.4,R2＝0.991；
表儿茶素没食子酸酯：Y＝38.4X+2.7,R2＝0.994；
没食子儿茶素没食子酸酯：Y＝29.1X-33.4,R2＝0.999；
表没食子儿茶素没食子酸酯：Y＝32.5X-17.3,R2＝0.993；
Y是黄烷-3-醇峰面积(mAU*min)，X是对应黄烷-3-醇浓度(μg/mL)。
说明：
27.1min，对应的是儿茶素，
37.0min，对应的是表儿茶素，
15.5min，对应的是没食子儿茶素，
20.6min，对应的是表没食子儿茶素，
45.4min，对应的是儿茶素没食子酸酯，
43.7min，对应的是表儿茶素没食子酸酯，
41.5min，对应的是没食子儿茶素没食子酸酯，
39.2min，对应的是表没食子儿茶素没食子酸酯。
③、配制浓度为100μg/mL花色素的标准液(以甲醇为溶剂，且以此溶剂为稀释剂)；然后梯度稀释至50.0、25.0、10.0、5.0、2.5和1.0μg/mL，以此稀释液按照上述方法进行检测，从而获得峰面积与稀释液中花色素浓度之间的对应关系。建立曲线方程如下：
矢车菊素：Y＝61.5X-32.8,R2＝0.999；
飞燕草素：Y＝66.3X-43.1,R2＝0.995；
Y是花色素峰面积(mAU*min)，X是对应花色素浓度(μg/mL)。
说明：
48.2min，对应的是矢车菊素；
35.9min，对应的是飞燕草素。
实施例1、一种亲水作用色谱(Hilic)和反相液相色谱(RPLC)联用分析原花色素结构的方法，含原花色素的待测样品为葡萄籽提取物，依次进行以下步骤：
1)、黄烷-3-醇单体分析：
Hilic分析待测样品溶液中(表)儿茶素及其没食子酸酯，具体如下：
准确称取葡萄籽提取物5.0mg，溶于1.0mL 97％乙腈水溶液，作为待测样品溶液；过0.22μm滤膜后利用上述“一.1)、Hilic分析条件”进行检测，然后将所得的峰面积对应代入上述“一.2)”所得公式中，从而获得溶液中此4者的浓度。
Hilic分析色谱图如图1所示。
2)、原花色素酸降解：
称取100mg间苯三酚和20mg抗坏血酸，溶于2mL 0.1mol/L盐酸甲醇溶液，配置成酸降解反应液；
将10.0mg葡萄籽提取物溶于上述酸降解反应液中，于50℃反应20min，得酸降解产物，过0.22μm滤膜后，作为待分析的酸降解产物(可存储于-20℃)；
3)、酸降解产物分析：
利用RPLC分析样品葡萄籽原花色素酸降解产物，以280nm检测待分析的酸降解产物中的黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物和黄烷-3-醇，以550nm检测待分析的酸降解产物的花色素(为酸降解副产物)；RPLC分析色谱图如图2和3所示。
经检测，成分包括：(表)儿茶素、(表)没食子儿茶素及其没食子酸酯、间苯三酚加成产物和矢车菊素等。
即，将步骤2)所得的待分析的酸降解产物按照“二.1)、RPLC分析条件”进行检测，然后将所得的峰面积对应代入上述“二.2)”所得公式中，从而获得待分析的酸降解产物相应成分的浓度。
4)、数据分析：
RPLC和Hilic分析的各黄烷-3-醇浓度之差为葡萄籽原花色素末端单元浓度，RPLC分析的各黄烷-3-醇-间苯三酚和花色素浓度之和为葡萄籽原花色素末端单元浓度；延伸单元摩尔数/末端单元摩尔数+1为葡萄籽原花色素平均聚合度。
即，公式为：
实际检测结果如下：
步骤1)、葡萄籽提取物溶液中(表)儿茶素及其表儿茶素没食子酸酯的浓度分别为0.13和0.01μmol/mL。
步骤2)、
酸降解后反应液中儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的浓度分别为0.20、0.16和0.08μmol/mL；
酸降解后反应液中矢车菊素浓度为0.17μmol/mL；
酸降解后反应液中儿茶素-间苯三酚、表儿茶素-间苯三酚和表儿茶素没食子酸酯-间苯三酚的浓度分别为0.13、0.76和0.16μmol/mL。
因此步骤的4)具体计算公式如下：
综上，可得知采用本发明的方法：
1)酸降解后反应液中(表)儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的浓度均高于葡萄籽提取物溶液中(表)儿茶素及其没食子酸酯的浓度，说明萄籽提取物中原花色素的结构单元为儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯；
2)葡萄籽提取物中原花色素平均聚合度为5.07。
实施例2、取消上述实施例1中步骤3中关于“以550nm检测待分析的酸降解产物的花色素(为酸降解副产物)”，
因此步骤的4)具体计算公式也相应改成如下：
为了对比本发明方法和传统原花色素结构分析方法，下面对传统方法作详细说明。
对比例、传统方法：
1)、原花色素纯化：准确称取1.0g葡萄籽提取物，溶于4.0mL 50％甲醇水溶液，上样于50％甲醇水溶液平衡的Sephadex LH20柱，以50％甲醇水溶液洗脱5个柱体积，收集洗脱液1，然后以70％丙酮水溶液洗脱3个柱体积，收集洗脱液2，将洗脱液2干燥，获得纯化的葡萄籽原花色素。
2)、原花色素酸降解：将上述步骤1)所得的纯化的葡萄籽原花色素替代实施例1中的“含原花色素的待测样品”，用量保持不变，其余等同于实施例1的步骤2)；
3)、酸降解产物分析：等同于实施例1的步骤3)；
即利用RPLC分析葡萄籽原花色素酸降解产物，包括(表)儿茶素及其没食子酸酯和间苯三酚加成产物等。RPLC分析色谱图如图3所示。
实际检测结果如下：
酸降解后反应液中儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的浓度分别为0.15、0.11和0.06μmol/mL；
酸降解后反应液中儿茶素-间苯三酚、表儿茶素-间苯三酚和表儿茶素没食子酸酯-间苯三酚的浓度分别为0.14、0.80和0.17μmol/mL。
4)、数据分析：
RPLC检测出的各黄烷-3-醇为葡萄籽原花色素末端单元，RPLC检测出的各黄烷-3-醇-间苯三酚为葡萄籽原花色素延伸单元，延伸单元摩尔数/末端单元摩尔数+1为葡萄籽原花色素平均聚合度。
综上，可得知采用常规传统方法：
1)酸降解后反应液中(表)儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的浓度均高于葡萄籽提取物溶液中(表)儿茶素及其没食子酸酯的浓度，说明萄籽提取物中原花色素的结构单元为儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯；
2)葡萄籽提取物中原花色素平均聚合度为4.47。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (8)
1.亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，其特征是包括以下步骤：
1）、黄烷-3-醇单体分析：
称取含原花色素的待测样品5.0 mg，溶于1.0 mL 97%乙腈水溶液，作为待测样品溶液；将待测样品溶液过0.22 µm滤膜后利用亲水作用色谱Hilic分析待测样品中的黄烷-3-醇单体；
检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为280 nm，色谱柱为Luna Hilic柱，柱温为30℃，进样量为10 μL，洗脱速度为0.35 mL/min；
流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为含0.5%乙酸的乙腈，流动相B为含0.5%乙酸的水；
洗脱梯度：0 ~ 30 min，3% ~ 13% B；
2）、原花色素酸降解：
称取100 mg间苯三酚和20 mg抗坏血酸，溶于2 mL 0.1 mol/L 盐酸甲醇溶液，得酸降解反应液；
将10.0 mg含原花色素的待测样品溶于所述酸降解反应液中，于50 ℃反应20 min，得酸降解产物，过0.22 µm滤膜后，作为待分析的酸降解产物；
3）、 酸降解产物分析：
将步骤2）所得的待分析的酸降解产物利用反相液相色谱RPLC进行分析，以280 nm检测待分析的酸降解产物中的黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物和黄烷-3-醇；
检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为280 和550 nm，色谱柱为Eclipse XDB-C18色谱柱，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，洗脱速度为1.0 mL/min；
流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为含1%乙酸的水，流动相B为含1%乙酸的甲醇；
洗脱梯度：0-10 min，5% B；
10-30 min，5%-20% B；
30-55 min, 20%-40% B；
4）、数据分析：
根据 RPLC和Hilic分析的黄烷-3-醇种类和含量的差异分析原花色素末端单元种类和含量，根据 RPLC分析的黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物分析原花色素延伸单元种类和含量，然后计算原花色素平均聚合度。
2.根据权利要求1所述的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，其特征是：
所述步骤3）还包括：以550 nm检测待分析的酸降解产物的花色素；
所述步骤4）对应为：根据 RPLC分析的黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物以及花色素分析原花色素延伸单元种类和含量。
3.根据权利要求1或2所述的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，其特征是：
所述黄烷-3-醇单体为：表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯；
所述黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物为：儿茶素-间苯三酚加成产物、表儿茶素-间苯三酚加成产物、儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物、表儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物、没食子儿茶素-间苯三酚加成产物、表没食子儿茶素-间苯三酚加成产物、没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物、表没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物；
所述黄烷-3-醇为：儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯。
4.根据权利要求3所述的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，其特征是：
所述花色素为：矢车菊素、飞燕草素。
5.根据权利要求1所述的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，其特征是：
步骤4）中的原花色素平均聚合度的计算公式为：
6.根据权利要求2所述的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，其特征是：
步骤4）中的原花色素平均聚合度的计算公式为：
7.根据权利要求1所述的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，其特征是所述步骤1）中：
液相色谱仪为Waters e2695色谱仪，检测器为Waters 2489 紫外-可见光检测器；
所得的峰面积利用以下曲线方程进行计算黄烷-3-醇单体的浓度：
表儿茶素：Y=15.5X+4.7, R2=0.996；
表没食子儿茶素：Y=3.9X+2.1, R2=0.993；
表儿茶素没食子酸酯：Y=38.7X-0.3, R2=0.998；
表没食子儿茶素没食子酸酯：Y=27.4X-21.6, R2=0.993；
Y是黄烷-3-醇峰面积，单位为mAU*min；X是对应黄烷-3-醇浓度，单位为μg/mL。
8.根据权利要求7所述的亲水作用和反相液相色谱联用分析原花色素结构的方法，其特征是所述步骤3）中：
液相色谱仪为Waters e2695色谱仪，检测器为Waters 2489 紫外-可见光检测器；
①、所得的峰面积利用以下曲线方程进行计算待分析的酸降解产物中的黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物的浓度：
儿茶素-间苯三酚加成产物：Y=14.1X+4.0, R2=0.991；
表儿茶素-间苯三酚加成产物：Y=13.8X+4.3, R2=0.996；
儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y=32.6X+1.3, R2=0.991；
表儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y=33.8X-0.2, R2=0.995；
没食子儿茶素-间苯三酚加成产物：Y=3.4X+3.7, R2=0.997；
表没食子儿茶素-间苯三酚加成产物：Y=3.6X+2.4, R2=0.992；
没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y=26.5X-32.1, R2=0.992；
表没食子儿茶素没食子酸酯-间苯三酚加成产物：Y=29.6X-13.7, R2=0.996；
Y是黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物峰面积，单位为mAU*min；X是对应黄烷-3-醇-间苯三酚加成产物浓度为μg/mL；
②、所得的峰面积利用以下曲线方程进行计算待分析的酸降解产物中的黄烷-3-醇的浓度：
儿茶素：Y=16.4X+2.4, R2=0.992；
表儿茶素：Y=15.2X+4.3, R2=0.991；
没食子儿茶素：Y=3.7X+4.3, R2=0.997；
表没食子儿茶素：Y=3.9X+2.7, R2=0.992；
儿茶素没食子酸酯：Y=36.9X+6.4, R2=0.991；
表儿茶素没食子酸酯：Y=38.4X+2.7, R2=0.994；
没食子儿茶素没食子酸酯：Y=29.1X-33.4, R2=0.999；
表没食子儿茶素没食子酸酯：Y=32.5X-17.3, R2=0.993；
Y是黄烷-3-醇峰面积，单位为mAU*min；X是对应黄烷-3-醇浓度，单位为μg/mL；
③、所得的峰面积利用以下曲线方程进行计算待分析的酸降解产物中的花色素的浓度：
矢车菊素：Y=61.5X-32.8, R2=0.999；
飞燕草素：Y=66.3X-43.1, R2=0.995；
Y是花色素峰面积，单位为mAU*min；X是对应花色素浓度，单位为μg/mL。
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