CN111830147A - 一种高粱中单宁浓度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种高粱中单宁浓度的检测方法，包括：提取高粱样品中的单宁组分作为单宁样品；对单宁样品及单宁标准溶液进行液相色谱–质谱联用分析，其中液相色谱为亲水作用液相色谱，液相色谱的检测器为荧光检测器，质谱为飞行时间质谱；以及根据对单宁标准溶液进行液相色谱–质谱联用分析所得的结果得到标准曲线，计算单宁样品的单宁浓度。本申请的检测方法能有效分离酿酒用高粱单宁不同聚合度的聚合体，选择性和特异性好，鉴定了酿酒用高粱单宁各聚合度的组成。其方法精度高，分离样品高粱单宁至11聚体，标准曲线R2可达0.9978，线性良好，相较比色法定量准确度高；流动相能够使用常用的反相体系，便于开展酿酒用高粱中单宁的全面有效分析。
Description
技术领域
本申请涉及化学检测领域，更具体涉及一种高粱中单宁浓度的检测方法。
背景技术
单宁是很多植物中都存在的次生代谢产物，通常用作抵御病原体和捕食者的酚类物质存在。单宁根据其化学结构特征可被分为水解单宁及缩合单宁。水解单宁(或称可水解单宁)是棓酸，或与棓酸有生源关系的酚羧酸与多元醇组成的酯。而缩合单宁(原花色素)是羟基黄烷类单体组成的缩合物，单体间通常以C-C键连接，在水溶液中不易分解，在热的醇-酸溶液中能酸解生成花色素。研究表明高粱中的单宁几乎均为缩合单宁，也即原花色素。单宁的存在不仅能够影响高粱的口感与消化特性，也同时影响了高粱的生物利用度。
研究表明单宁在白酒的酿造过程中，对发酵以及白酒的风格、品味与特性的形成具有重要的影响。单宁与产酒率呈负相关，过多的单宁会阻碍酒精发酵，但同时，单宁的存在会增加白酒的风味，白酒中的芳香族化合物可经微生物发酵从原料中的单宁转化而来，适量的单宁还可抑制发酵中的有害微生物。
目前利用高效液相色谱技术对原花色素进行分离并分析是解析原花色素组成的最常用手段，主要方法包括：
一、反相高效液相色谱(RP-HPLC)
在反相高效液相色谱技术中，流动相比固定相更具极性，因此化合物以极性逐渐降低的顺序洗脱下来。RP-HPLC技术能用于分离低聚原花色素，但是很难分离聚合度高的原花色素，因为伴随聚合度的增加，原花色素的结构和立体异构体的可能组合也会变得更多，导致原花色素在色谱图上以单一的宽峰形式呈现。因此反相高效液相色谱常与酸降解相结合，用来识别原花色素的组成结构单元，即原花色素的末端单元与延伸单元。原花色素的延伸单元在亲核试剂的攻击下，C-4位与亲核试剂结合形成加成产物，而其末端单元形成相应的黄烷醇单体。间苯三酚和苄硫醇法是最常用于酸降解的亲核试剂，苄硫醇法能够用于识别A、B型连接键，但因其臭味而使用有限。
二、正相高效液相色谱(NP-HPLC)
正相-高效液相色谱技术使用二氧化硅作为极性固定相，而有机溶剂作为低极性流动相，其洗脱顺序与RP-HPLC相反，通常以聚合度的增加顺序洗脱原花色素。在1993年，NP-HPLC首次被用于从可可豆和葡萄籽中分离原花青素至四聚体。后来，此法经改进后能够进一步分离原花色素至十聚体，并成功地应用于水果、蔬菜、谷物、坚果、饮料和香料等39种不同食物中原花色素的测定。
三、亲水作用液相色谱(HILIC)
HILIC方法最早在1990年提出用于多肽和核酸的分析。它属于NP-HPLC的一种变形，分析物通过在亲水固定相上的水层和疏水洗脱液之间分配而保留，因此其洗脱顺序与NP-HPLC的一致，但是其流动相使用的是与RP-HPLC相似的半水溶性流动相，因此克服了原花色素这类强极性物质在NP-HPLC流动相中难保留的缺点，使待分析物和样品基质在流动相中的溶解度得以提高。典型的HILIC流动相构成是水或者挥发性缓冲盐溶液以及40–97％的乙腈，使得样品在质谱中的电离更具传导性。
目前分析高粱中的原花青素组成以正相为主，其流动相不利于环保；另外，对于酿酒用高粱中单宁的检测仅限于总量的比色测定，比色法误差较大。
发明内容
本申请的目的是提供一种更为绿色环保并且定量准确的检测高粱中单宁组分及浓度的方法。
为达成上述目的，本申请所采用的技术方案如下：
在一些实施例中，本申请的检测方法，包括如下步骤：提取高粱样品中的单宁组分作为单宁样品；对所述单宁样品及单宁标准溶液进行液相色谱–质谱联用分析，其中所述液相色谱为亲水作用液相色谱，所述液相色谱的检测器为荧光检测器，且所述质谱为飞行时间质谱；以及根据对单宁标准溶液进行液相色谱–质谱联用分析所得的结果得到标准曲线，根据所述标准曲线计算所述单宁样品的单宁浓度。
在一些实施例中，取得高粱的外种皮作为高粱样品进行提取。在一些实施例中，使用精米机富集高粱外种皮作为高粱样品进行提取。在一些实施例中，将高粱外种皮磨成粉末作为高粱样品进行提取。
在一些实施例中，所述提取包括使用丙酮水溶液从高粱样品中提取1次至10次得到提取液。在一些实施例中，所述提取包括使用丙酮水溶液从高粱样品中提取3次得到提取液。在一些实施例中，所述丙酮水溶液为70％丙酮水溶液。在一些实施例中，所述丙酮水溶液更包括0.1％(w/v)抗坏血酸。在一些实施例中，所述丙酮水溶液的使用量为每克高粱样品使用10mL丙酮水溶液。
在一些实施例中，所述提取还包括对所述提取液进行液–液萃取，从水相取得单宁样品。在一些实施例中，所述液–液萃取的有机相选自正己烷及/或二氯甲烷。
在一些实施例中，所述提取还包括经过树脂纯化。
在一些实施例中，所述提取还包括使用乙醇洗脱。
在一些实施例中，所述提取还包括冻干得到单宁样品的冻干粉末。
在一些实施例中，所述液相层析中，所述单宁样品及所述单宁标准溶液的溶剂为甲醇。在一些实施例中，所述单宁标准溶液的浓度为0.1–2μmol/mL。
在一些实施例中，所述单宁标准溶液的浓度包括0.1μmol/mL、0.25μmol/mL、0.5μmol/mL、1μmol/mL以及2μmol/mL中的一种、二种或多种。
在一些实施例中，所述液相层析中，流动相为乙腈溶液及甲醇溶液。在一些实施例中，所述液相层析中，流动相为0.1％乙酸的乙腈及乙酸/水/甲醇(0.1：3：96.9，v/v/v)。
在一些实施例中，所述荧光检测器激发波长为230nm，发射波长为321nm。
在一些实施例中，在开始所述液相层析时，流动相为乙腈溶液93％，甲醇溶液7％。在一些实施例中，在所述液相层析85分钟时，流动相为乙腈溶液0％，甲醇溶液100％。在一些实施例中，在所述液相层析0至85分钟时，流动相的乙腈溶液由93％到0％，甲醇溶液由7％到100％。在一些实施例中，在所述液相层析85分钟以后时，流动相的乙腈溶液由0％到93％，甲醇溶液由100％到7％。
在一些实施例中，在所述液相层析0至3分钟时，流动相的乙腈溶液为93％，甲醇溶液为7％；在所述液相层析3至15分钟时，流动相的乙腈溶液为93％到77％，甲醇溶液为7％到23％；在所述液相层析15至70分钟时，流动相的乙腈溶液为77％到35％，甲醇溶液为23％到65％；在所述液相层析70至85分钟时，流动相的乙腈溶液为35％到0％，甲醇溶液为65％到100％；在所述液相层析85至87分钟时，流动相的乙腈溶液为0％到93％，甲醇溶液为100％到7％；87-100分钟时，流动相的乙腈溶液为93％，甲醇溶液为7％。
本申请一些的实施例的检测方法，能够有效地对酿酒用高粱单宁不同聚合度的聚合体进行分离，并且选择性和特异性好，鉴定了酿酒用高粱单宁各聚合度的组成。其方法精度高，分离样品高粱单宁至11聚体，标准曲线R2可达0.9978，线性良好，相较于比色法定量准确度高；流动相能够使用常用的反相体系，便于开展酿酒用高粱中单宁的全面有效分析。
附图说明
图1为实施例1的儿茶素标准品的液相色谱图。
图2为实施例1的儿茶素摩尔浓度标准曲线。
图3为实施例1的样品液相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容的进一步限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所做的等同替换或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
一种酿酒用高粱中单宁组成的检测方法，包括如下步骤：
(1)使用精米机富集高粱外种皮后，称取10g样品粉末，用含0.1％(w/v)抗坏血酸的70％丙酮水溶液100mL在室温下提取2h，磁力搅拌提取3次。合并三次的丙酮萃取液，在40℃下旋转蒸发除去丙酮。得到的水相用正己烷和二氯甲烷依次萃取，萃余水相经旋转蒸发除去多余的有机溶剂，水相经过HPD-500大孔树脂纯化，使用乙醇洗脱，以去除糖类物质，然后旋转蒸发除去乙醇，剩余水相在真空条件下冻干，得到高粱单宁提取物88mg。取一定量的冻干粉末溶于甲醇配制成10mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，滤液用于高效液相色谱-质谱分析；
(2)用色谱甲醇为溶剂，分别配制0.1μmol/mL、0.25μmol/mL、0.5μmol/mL、1μmol/mL、2μmol/mL的标准溶液，注入高效液相色谱测定，以标准溶液浓度为横坐标、积分峰面积为纵坐标得到标准曲线。
HILIC测定条件
a)色谱柱：Luna HILIC(250mm×4.6mm；5.0μm；Phenomenex,U.K.)；
b)流动相A为含0.1％乙酸的乙腈，流动相B为乙酸/水/甲醇(0.1：3：96.9，v/v/v)；
c)进样量：10μL；
d)柱温：在25℃；
e)流速：0.5mL/min；
f)检测器条件：荧光检测器，激发波长设为230nm，发射波长设为321nm；
g)洗脱程序为：
0-3分钟：流动相A为93％，流动相B为7％；
3-15分钟：流动相A为93％到77％，流动相B为7％到23％；
15-70分钟：流动相A为77％到35％，流动相B为23％到65％；
70-85分钟：流动相A为35％到0％，流动相B为65％到100％；
85-87分钟：流动相A为0％到93％，流动相B为100％到7％；
87-100分钟：流动相A为93％，流动相B为7％。
质谱参考条件：
a)仪器：Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪；
b)电离源：负离子扫描模式；
c)扫描范围：m/z 100-1500；
d)雾化气(GS1)：50psi；
e)干燥气(GS2)：50psi；
f)气帘气(CUR)：35psi；
g)离子源温度(TEM)：550℃；
h)离子源电压(IS)：-4500V；
i)一级扫描：去簇电压(DP)：80V；聚焦电压(CE)：10V；
j)二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40
和-60V，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。
(3)依据标准曲线计算待测样品中高粱单宁的摩尔浓度，并据此计算出相应含量。
(4)结果分析
利用HILIC色谱柱结合荧光检测与QTOF-MS/MS分析，分离鉴定了样品高粱单宁的1-11聚体，各聚合度在HILIC柱下能够很好的分离开；根据质谱碎片信息确定了各聚合度的结构单元由(表)儿茶素组成。实施例1的样品经HILIC-QTOF-MS/MS鉴定的单宁组成，具体如表1。
表1
通过儿茶素的摩尔浓度标准曲线，计算得到了样品高粱单宁提取物粉末的各聚合度单宁含量，如表2。
表2
可以看到，其中以3-7聚的低聚体居多，高粱单宁在样品中的总含量为291.67±4.60mg/100g。相对地，基于常用的比色法，例如正丁醇法检测到的高粱单宁总量为841.90±32.47mg/100g氯化矢车菊素当量。由此可见，常用的比色法误差较大，而使用本申请的方法进行定量准确度高。
上述实施方式仅为本申请的优选实施方式，不能以此来限定本申请保护的范围，本领域的技术人员在本申请的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本申请所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种高粱中单宁浓度的检测方法，其特征在于，包括：
提取高粱样品中的单宁组分作为单宁样品；
对所述单宁样品及单宁标准溶液进行液相色谱–质谱联用分析，其中所述液相色谱为亲水作用液相色谱，所述液相色谱的检测器为荧光检测器，且所述质谱为飞行时间质谱；以及根据对单宁标准溶液进行液相色谱–质谱联用分析所得的结果得到标准曲线，根据所述标准曲线计算所述单宁样品的单宁浓度。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
以高粱的外种皮作为所述高粱样品进行提取；
可选地，使用精米机富集高粱外种皮作为所述高粱样品进行提取；
可选地，将高粱外种皮磨成粉末作为所述高粱样品进行提取。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
所述提取包括使用丙酮水溶液从高粱样品中提取1次至10次得到提取液；
可选地，所述提取包括使用丙酮水溶液从高粱样品中提取3次得到提取液。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，
所述提取还包括对所述提取液进行液–液萃取，从水相取得单宁样品；
可选地，所述液–液萃取的有机相选自正己烷及/或二氯甲烷。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取还包括使用乙醇洗脱。
可选地，所述提取还包括经过树脂纯化；
可选地，所述提取还包括冻干得到单宁样品的冻干粉末。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相层析中，所述单宁样品及所述单宁标准溶液的溶剂为甲醇。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单宁标准溶液的浓度为0.1–2μmol/mL；
可选地，所述单宁标准溶液的浓度包括0.1μmol/mL、0.25μmol/mL、0.5μmol/mL、1μmol/mL以及2μmol/mL中的一种、二种或多种。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相层析中，流动相为乙腈溶液及甲醇溶液；
可选地，所述液相层析中，流动相为0.1％乙酸的乙腈及乙酸/水/甲醇(0.1：3：96.9，v/v/v)。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光检测器激发波长为230nm，发射波长为321nm。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
在开始所述液相层析时，流动相为乙腈溶液93％，甲醇溶液7％；且/或
在所述液相层析85分钟时，流动相为乙腈溶液0％，甲醇溶液100％；
可选地，
在所述液相层析0至85分钟时，流动相的乙腈溶液由93％到0％，甲醇溶液由7％到100％；且/或
在所述液相层析85分钟以后时，流动相的乙腈溶液由0％到93％，甲醇溶液由100％到7％；
可选地，
在所述液相层析0至3分钟时，流动相的乙腈溶液为93％，甲醇溶液为7％；在所述液相层析3至15分钟时，流动相的乙腈溶液为93％到77％，甲醇溶液为7％到23％；在所述液相层析15至70分钟时，流动相的乙腈溶液为77％到35％，甲醇溶液为23％到65％；在所述液相层析70至85分钟时，流动相的乙腈溶液为35％到0％，甲醇溶液为65％到100％；在所述液相层析85至87分钟时，流动相的乙腈溶液为0％到93％，甲醇溶液为100％到7％；87-100分钟时，流动相的乙腈溶液为93％，甲醇溶液为7％。
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