KR102275901B1

KR102275901B1 - 기능성 성분을 포함하는 주류 발효액

Info

Publication number: KR102275901B1
Application number: KR1020180129330A
Authority: KR
Inventors: 장혜원; 이장호; 이윤열; 김태완; 최희돈
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2021-07-08
Also published as: KR20200047192A

Abstract

본 발명은 4-비닐구아이아콜(4-vinylguaiacol) 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-di-tert-butylphenol)을 포함하는 주류 발효액 및 이를 효율적으로 확인하는 방법에 관한 것이다.

Description

기능성 성분을 포함하는 주류 발효액{Alcohol Fermented Liquid having functional components}

본 발명은 기능성 성분을 포함하는 주류 발효액 및 그 효과적인 확인 방법에 관한 것이다.

포도주, 맥주, 사케, 백주, 막걸리 등의 다양한 주류 음료 또는 주유 발효액에 등에 들어있는 기능성 물질과 향미 성분에 관한 연구는 주 생산국가를 중심으로 매우 활발하게 이루어져 왔다. 한국의 전통 주류인 막걸리는 여러 가지 미생물 (효모 및 진균)이 함유된 발효 스타터인 누룩으로 양조한 주류로서, 발효 과정에서 전분과 알코올의 당화가 동시에 일어난다. 표준 막걸리의 주요 구성 성분은 물 (80 %), 식이 섬유 (10 %), 알코올 (6-8 %), 단백질 (2 %), 탄수화물 (0.8 %), 비타민 및 유기산을 포함한다. 축적된 증거들은 막걸리가 시험 관내에서 항암, 항염증 및 항산화 특성을 암시하는 다양한 생물학적 효과를 가지고 있음을 보여 주었다. 동물 연구에 의하면 막걸리의 경구 투여가 위암 종양 이종 이식 마우스 모델에서의 항종양 효과와 쥐의 혈장에서의 항산화 효과를 이끌어내는 것으로 나타났다. 막걸리는 유기산과 폴리 페놀과 같은 다양한 생체 활성 화합물과 여러 가지 휘발성 화합물을 발견했다.

이러한 기능성 성분을 분석하기 위해서는 기능성 성분을 추출하는 방법이 매우 중요하다. 기능성 성분을 추출하고 분석하는 방법은 다음과 같다. 새로운 기능성 성분의 효율적으로 탐색하기 위하여 1)용매를 사용하여 직접 추출하는 방법(solvent extraction, SE), 2)기능성 성분을 흡착제에 흡착농축 시키는 방법(sorptive extraction)이 있다. 이 두 가지 기술을 사용하여 주류로부터 기능성 물질을 추출하는 방법에 가장 고려해야 할 기술적 요소는 수분과 알코올이 들어있는 액체로부터 기능성물질을 효율적으로 추출하여야 한다는 점이다. 기존의 방법인 dynamic headspace방법, 수증기 증류법 등은 수분과 알코올 함량이 높은 주류로부터 기능성 성분을 추출하거나 포집하는데는 적절한 방법이 아니다.

최근에 막걸리의 다양한 기능성 성분의 정량 분석을 위해 GC-MS와 결합 된 stir-bar sorptive extraction (SBSE) 방법을 개발되었고, 상기 SBSE는 막걸리에 존재하는 기능성 성분을 분석하기 위한 민감하고 선택적 추출 방법이지만, 열 탈착 시스템을 포함하는 장비는 GC 분석을 위해 동일하다. 또한, 교반 막대 (polydimethylsiloxane 및 에틸렌 글리콜)에 사용할 수 있는 상업용 코팅재는 추출을 극성이 아닌 극성 화합물로 제한하지만 둘 다 동시에는 적용할 수 있는 것은 아니다.

따라서, 기능성 성분, 특히 4-비닐구아이아콜(4-vinylguaiacol) 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-di-tert-butylphenol)이 함유된 음료를 개발하고 이들을 효과적으로 확인할 수 있는 방법이 요구된다.

1. Lee, S.-J.; Kim, J.-H.; Jung, Y.-W.; Park, S.-Y.; Shin, W.-C.; Park, C.-S.; Hong, S.-Y.; Kim, G.-W. Composition of Organic Acids and Physiological Functionality of Commercial Makgeolli. Korean Journal of Food Science and Technology 2011, 43, 206-212. 2. Eom, J.-E.; Kwon, S.-C.; Moon, G.-S. Detection of 1, 4-Dihydroxy-2-Naphthoic Acid from Commercial Makgeolli Products. Preventive nutrition and food science 2012, 17, 83. 3. Huang, Y.; W-W, L.; Chen, B.; Wu, M.; S-G., L. Determination of 13 Phenolic Compounds in Rice Wine by High-Performance Liquid Chromatography. Food Analytical Methods 2015, 8, 825-832. 4. Wang, S.-J.; Lee, H.-J.; Cho, J.-Y.; Park, K.-H.; Moon, J.-H. Isolation and Identification of Antioxidants from Makgeolli. Korean Journal of Food Science and Technology 2012, 44, 14-20.

본 발명은 4-비닐구아이아콜(4-vinylguaiacol) 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-di-tert-butylphenol)이 함유된 주류 발효액 및 이들을 효율적으로 확인할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 4-비닐구아이아콜(4-vinylguaiacol) 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-di-tert-butylphenol)을 포함하는 주류 발효액을 제공한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 주류 발효액은 알코올성 주류일 수 있다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 알코성 주류는 맥주, 소주, 막걸리 및 와인 중에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 주류 발효액으로부터 4-비닐구아이아콜(4-vinylguaiacol) 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-di-tert-butylphenol) 중 어느 하나 이상일 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 4-비닐구아이아콜(4-vinylguaiacol) 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-di-tert-butylphenol)을 포함하는 주류 발효액을 효율적으로 확인하여 효과적으로 제공할 수 있다.

도 1의 (a)는 메탄올/메틸렌클로라이드로 용매추출한 모습, (b)는 메탄올/클로로포름으로 용매추출한 모습이다.
도 2는 메탄올/석유 에테르를 사용하여 용매추출한 모습이다.
도 3은 본 발명에 따른 용매추출법으로 추출한 총 크로마토그램 결과이다. (3a) 표준 용액, (3b) 막걸리, (3c) 맥주, (3d) 와인.
도 4는 4-VG (tr = 5.9) 및 DTBP (tr = 8.2)에 대한 300ppb 표준 용액의 크로마토그램이다. t_r‘ 유지 시간 (분).
도 5는 본원발명의 방법을 알코올성 음료 샘플 (A) 막걸리, (B) 맥주 및 (C) 와인에 적용하여 분석한 크로마토그램이다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 4-비닐구아이아콜(4-vinylguaiacol) 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-di-tert-butylphenol)을 포함하는 주류 발효액 및 그를 추출하여 확인하는 방법을 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 4-비닐구아이아콜(4-vinylguaiacol) 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-di-tert-butylphenol)을 포함하는 주류 발효액을 제공한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 주류 발효액은 알코올성 주류일 수 있고, 더 구체적으로 맥주, 소주, 막걸리 및 와인 중에서 선택된 것일 수 있다.

상기 4-비닐구아이아콜(4-vinylguaiacol, 4-VG)은 4-에틸-2-메톡시페놀(Ethenyl-2-methoxyphenol)로서 다음의 화학식을 갖는다.

[화학식 1]

상기 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-di-tert-butylphenol, 2,4-DTBP)은 다음의 화학식을 갖는다.

[화학식 2]

본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 주류 발효액의 4-비닐구아이아콜의 함량은 0.01 내지 50 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.03 내지 3 ㎍/㎖ 의 범위일 수 있다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 주류 발효액의 2,4-디-터트-부틸페놀의 함량은 0.01 내지 50 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.03 내지 1.5 ㎍/㎖ 의 범위일 수 있다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 주류 발효액으로부터 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀 중 어느 하나 이상일 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 맥주, 소주, 막걸리 및 와인은 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 약 80 내지 95%의 수분 및 약 5 내지 20%의 알코올을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 클로로포름(chloroform), 석유 에테르(petroleum ether) 및 메탄올(methanol)의 혼합물을 추출용매로 사용하여 주류 발효액으로부터 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀 중 어느 하나 이상일 추출할 수 있다.

본 발명의 상기 맥주, 소주, 막걸리 및 와인으로부터 기능성 성분을 추출할 경우 높은 수분 함량과 알코올 함량으로 인해 추출에 어려움이 있으나, 본 발명의 추출방법을 통해 우수한 효율로 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀을 추출할 수 있다.

본 발명에서 상기 클로로포름은 혼합용매 총 부피에 대하여 35 내지 45 부피%일 수 있으며, 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 37 내지 43 부피%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 40 부피%일 수 있다.

본 발명에서 상기 석유 에테르는 혼합용매 총 부피에 대하여 35 내지 45 부피%일 수 있으며, 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 37 내지 43 부피%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 40부피%일 수 있다.

본 발명에서 상기 메탄올은 혼합용매 총 부피에 대하여 15 내지 25 부피%일 수 있으며, 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 17 내지 23 부피%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 20 부피%일 수 있다.

본 발명에서 상기 클로로포름, 석유 에테르 및 메탄올은 1 내지 5 : 1 내지 5 : 1 의 부피비로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3 : 1 내지 3 : 1의 부피비로 혼합될 수 있고, 더욱 바람직하게는 2 : 2 : 1 의 부피비로 혼합될 수 있다.

본 발명에서 상기 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀은 80 내지 120%의 회수율로 추출될 수 있다. 상기 회수율은 FDA에서 제시한 회수율 기준(1 ㎍/㎖ 경우 75-120%, 0.01 ㎍/㎖ 경우 70-125%)에 적합하다. 회수율은 참값으로부터 평균치의 오차정도로서 정확성을 평가하는 추출 효율로서 기질(식품 matrix)의 영향을 고려해야한다. 120% 이상의 회수율을 보이는 경우는, 음료의 분석대상물질 이외의 음료 중에 존재하는 다른 구성성분에 의해 분석대상물질의 검출을 방해하여 회수율에 영향을 주는 것이라고 볼 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 주류 발효액으로부터 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀을 추출하는 방법을 제공한다.

S1) 시료에 클로로포름, 석유 에테르 및 메탄올의 혼합용매를 섞는 단계;

S2) 교반하는 단계;

S3) 원심분리하는 단계;

S4) 하등액을 수득하는 단계; 및

S5) 수득된 하등액을 농축하는 단계.

본 발명에서 상기 S1) 단계의 혼합용매는 클로로포름, 석유 에테르 및 메탄올은 혼합용매 총 부피에 대하여, 클로로포름 35 내지 45 부피%, 석유 에테르 35 내지 45 부피% 및 메탄올 15 내지 25 부피%일 수 있다. 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여, 클로로포름 37 내지 43 부피%, 석유 에테르 37 내지 43 부피%, 메탄올 및 17 내지 23 부피%일 수 있다. 더욱 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여, 클로로포름 40 부피%, 석유 에테르 40 부피%, 메탄올 및 20 부피%일 수 있다

본 발명에서 상기 S2) 단계의 교반은 20분 내지 40분 지속될 수 있다. 바람직하게는 25분 내지 35분 지속될 수 있다. 더욱 바람직하게는 30분 지속될 수 있다.

본 발명에서 상기 S3) 단계의 원심분리는 8000 내지 12000 rpm 에서 3 내지 15분 수행할 수 있으며, 바람직하게는 10000 rpm 에서 5분 수행할 수 있다.

본 발명에서 상기 S5) 단계의 농축은 진공감압농축기를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 주류 발효액으로부터 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀을 추출하고 분석하는 방법을 제공한다:

S2) 교반하는 단계;

S3) 원심분리하는 단계;

S4) 하등액을 수득하는 단계;

S5) 수득된 하등액을 농축하는 단계; 및

S6) GC-MS(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer)로 농축물을 분석하는 단계.

본 발명에서 상기 농축물은 에탄올, 아세톤 또는 에틸아세테이트로 용해하여 분석할 수 있으며, 바람직하게는 에틸아세테이트로 용해하여 분석할 수 있다.

본 발명에서 상기 시료내 4-비닐구아이아콜의 함량은 0.01 내지 50 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.03 내지 3 ㎍/㎖ 의 범위일 수 있다.

본 발명에서 상기 시료내 2,4-디-터트-부틸페놀의 함량은 0.01 내지 50 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.03 내지 1.5 ㎍/㎖ 의 범위일 수 있다.

본 발명의 분석방법을 사용하면 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀이 비록 미량이 존하는 시료라고 할지라도 특별한 추출 도구 없이 짧은 시간에 효율적으로 추출하여 상기 성분들을 매우 효과적으로 분석할 수 있다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실험예 1]

각 원재료를 달리하여 제조한 막걸리 시료의 일반 성분을 분석한 결과는 다음 표와 같다.

일반성분	막걸리 재료					단위
일반성분	쌀 100%	쌀 100%	쌀 90%, 말토올리고당 10%	쌀 70%, 소맥분 30%	소맥분 100%	단위
열량	10	32	9	17	21	kcal/100g
수분	97.60	92.21	97.90	95.66	94.75	g/100g
조지질	0.14	0.29	0.27	0.08	0.10	g/100g
조단백	0.94	1.76	0.81	1.01	1.35	g/100g
회분	0.08	0.17	0.07	0.08	0.09	g/100g
탄수화물	1.24	5.57	0.95	3.17	3.71	g/100g

[실험예 2] 혼합 용매별 추출 비교 1

1. 시료의 준비

12 종의 막걸리 시료는 (서울 장수 생막걸리, 국순당 생막걸리, 톡쏘는 쌀막걸리, 미담, 서울 월매 쌀막걸리, 국산당 쌀막걸리, 장수 홍삼막걸리, 분자 막걸리 주시락, 배상면주가 유기농 막걸리, 경주 법주 쌀막걸리, 친환경쌀 참살이 생막걸리, 국순당 예담 차례주) 시중마트에서 구입하여 사용하였다.

2. 용매 추출 방법 및 조건

(1) 클로로포름/메탄올 추출법

막걸리 50 mL을 250 mL의 분액깔데기에 취하고 메탄올 40 mL과 클로로포름 50 mL을 가하였다. 분액깔데기를 흔들어 (30분) 막걸리 중의 비극성 분획을 클로로포름과 메탄올로 추출한 다음 가만히 정치하여 비극성 분획과 극성 분획이 분리되도록 하였다. 상층부를 취하여 클로로포름 50 mL 를 가한 후 상층부와 하층부로 분리하였다. 추출이 완료되면 각 분획물을 수집하여 소듐 설페이트로 탈수를 하고 GC/MS로 분석하였다.

(2) 석유 에테르/메탄올 추출법

막걸리 50 mL을 250 mL의 원심분리용 셀에 취하고 메탄올 40 mL과 석유 에테르 50 mL을 가하였다. 쉐이커를 사용하여 30분간 진탕하면서 추출한 다음 상등액을 취하였다. 다시 50 mL의 석유 에테르를 가하여 쉐이킹 30분, 원심분리 （１００００rpm, 5분)을 거친 후, 비극성 분획과 극성 분획이 분리되도록 하였다. 하층부를 취하여 석유 에테르 50 mL 를 가한 후 상층부와 하층부로 분리하였다. 추출이 완료되면 각 분획물을 수집하여 소듐 설페이트로 탈수를 하고 GC-FID와 GC/MS로 분석하였다.

(3) 석유 에테르/클로로포름/메탄올/n-부탄올 추출법

막걸리 50 mL을 250 mL의 원심분리용 셀에 취하고 혼합 용매 100 mL (석유 에테르 35 , 클로로포름 40 , 메탄올 20 , n-부탄올 5 비율) 을 가하였다. 30% 염화나트륨 용액을 각 셀에 30 mL 첨가하였다. 쉐이커를 사용하여 30분간 진탕하면서 추출한 후, 원심 분리 (10,000 rpm, 10분) 하여 하등액을 취하였다. 이 추출 과정은 세 번 반복되었고, 모아진 추출액은 무수 소듐 설페이트로 탈수되었다. 추출액은 진공감압농축기를 사용하여 농축되고, 전체 부피를 에틸아세테이트를 사용하여 1.5 mL로 맞추었다. 추출물의 기능성 성분은 GC-MS와 GC-FID로 분석하였다. 회수율 실험은 막걸리 샘플에 0.1 μg/mL과 1 μg/mL의 표준 물질을 첨가하여 측정되었다.

용매를 사용하여 막걸리로부터 기능성 성분을 추출할 경우 높은 수분함량과 알코올 함량으로 인하여 추출에 어려움이 있다. 막걸리의 함유된 90%의 수분과 6%정도의 알코올 함량 때문에 기능성 물질과 향미 성분을 추출하기 위하여 중간극성의 용매인 메틸렌 클로라이드 또는 클로로포름과 극성이 높은 메탄올을 혼합하여 기능성 물질을 추출하였다.

이 경우 메틸렌 클로라이드와 클로로포름은 물이나 메탄올보다 비중이 크기 때문에 도 1과 같이 분액깔데기에서 아래층으로 분리된다. 뿐만 아니라 메틸렌 클로라이드와 클로로포름은 메탄올과 잘 용해되므로 층분리를 위하여 물을 가하여도 층 분리가 쉽게 되지 않았다. 유기용매 층과 시료간 분리를 위하여 12시간 이상이 소요되어 막걸리로부터 향미성분을 추출하는데 효율성이 매우 낮았다. 따라서 극성이 메틸렌 클로라이드나 클로로포름과 유사하고 비중이 물보다 낮은 다른 용매를 사용하여 막걸리로부터 향미성분을 추출하는 것이 좋을 것으로 사료되었다. 메틸렌 클로라이드와 클로로포름을 추출용매로 사용하였을 때 위에서 언급한 단점을 극복하기 위하여 중간극성 용매로서 석유 에테르를 사용하였다. 석유 에테르는 극성은 낮고 물보다 가볍기 때문에 막걸리로부터 향미성분을 추출하는데 매우 용이하였다.

적절한 비율의 4가지 추출용매(석유 에테르 35 , 클로로포름 40 , 메탄올 20 , n-부탄올 5)를 사용하였을 때, 원심분리 후, 클로로포름과 n-부탄올은 물(막걸리)보다 비중이 크기 때문에 아래층으로 분리되었는데, 10분 동안 10,000rpm의 원심 분리 조건으로 하등액 추출액은 깨끗하게 분리되어 추출 효율을 높일 수 있었으나, n-부탄올이 농축시, 높은 끓는점으로 인해, 농축되는 시간이 앞의 추출방법들( 약 10분)에 비해 시간이 많이 소모되었다 (약 1시간).

3. 가스 크로마토그래피 - 질량 분석기 분석(GC-MS) 방법 및 조건

(1) GC-FID (Gas chromatography-flame ionization detection)를 이용한 분석

막걸리에서 추출한 기능성 성분은 GC-FID (Agilent 7890A, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)로 분석되었다. 기능성 성분 정성과 정량을 위한 GC 분석조건으로 컬럼은 HP-5MS bonded-phase fused-silica capillary column (0.25 μm i.d. × 30 m, 0.25 μm film thickness, Agilent Technologies, Middleburg, OI, USA)를 사용하였다. 인젝터 온도는 250 ℃, oven 온도는 50 ℃에서 3분간 유지한 다음, 분당 10 ℃/min로 180 ℃까지 올린 후 5분간 유지하였다. 그 후, 270 ℃까지 10 ℃/min으로 올리고 2분간 유지한 뒤 최종온도인 300 ℃까지 15 ℃/min으로 승온 후 6분간 유지하였다. 운반 기체는 헬륨을 사용하였고 (1.3 mL/min), 분리 모드 (5:1)로 2 μL 주입하였다.

(2) GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry)를 이용한 분석

막걸리에서 석유 에테르/클로로포름/메탄올/n-부탄올 추출법을 사용하여 추출된 기능성 성분은 GC-MS (Agilent 7890A GC, MD 5973 quadruple MS)로 분석되었다. 기능성 성분 정성과 정량을 위한 GC 분석조건으로 컬럼은 HP-5MS bonded-phase fused-silica capillary column (0.25 μm i.d.×30 m, 0.25 μm film thickness, Agilent Technologies, Middleburg, OI, USA)를 사용하였다. 인젝터온도는 250 ℃, 오븐 온도는 50 ℃에서 3분간 유지한 다음, 분당 10 ℃/min로 165 ℃까지 올린 후 5분간 유지하였다. 그 후, 260 ℃까지 10 ℃/min으로 올리고 2분간 유지한 뒤 최종온도인 305 ℃까지 15 ℃/min으로 승온 후 6분간 유지하였다. 운반 기체는 헬륨을 사용하였고 (1.0 mL/min), 분리 모드 (5:1)로 1 μL 주입하였다. 그리고 기능성 성분의 질량분석을 위해 SIM (Selected Ion Monitoring) mode를 사용하였으며, 디에틸 숙신산(DES)에 대해 101, 129, 147 m/z, 4-비닐구아이아콜(4-VG)에 대해 107, 135, 150 m/z, 2,4-디-터트-부틸페놀(DTBP)에 대해 74, 191, 206 m/z 의 이온 질량이 선택되었다.

4. 실험 결과

상기 방법으로 수행한 석유 에테르/메탄올 추출법의 결과는 표 2, 석유 에테르/클로로포름/메탄올/n-부탄올 추출법의 결과는 표 3에 기재하였다.

기능성 성분	선형 상관 계수 (R²)	LOD (μg/ml)	LOQ (μg/ml)	표준 농도 (μg/ml)	반복성		추가양 (ng/ml)	회수율 (%)
					일일 (n=6)	일간(n=3)
DES	0.9995- 0.9999	0.9	2.73	2	1.10	1.31	100	43±2
				10	1.05	1.79
				20	1.37	2.10
				50	1.84	2.88
4-VG	0.9986- 0.9998	0.40	1.21	2	2.43	2.43	100	27.38±2
				10	1.26	1.4
				20	1.24	1.0
				50	1.65	1.24
DTBP	0.9931- 0.9990	1.26	3.83	2	1.06	1.29	100	76.23±2
				10	1.06	1.20
				20	0.93	1.77
				50	1.24	2.04

기능성 성분	선형 상관 계수 (R²)	LOD (μg/ml)	LOQ (μg/ml)	표준 농도 (μg/ml)	반복성		추가양 (ng/ml)	회수율 (%)
					일일 (n=6)	일간(n=3)
DES	0.9983- 0.9999	0.24	0.73	2	5.72	2.35	100	94±1
				10	2.90	1.75	1000	78±4
				20	4.33	2.90
				50	3.81	1.18
				100	6.00	1.26
4-VG	0.9986- 0.9998	0.40	1.21	2	3.81	4.17	100	115±6
				10	3.41	1.11	1000	81±4
				20	3.75	8.28
				50	1.71	0.08
				100	2.99	1.65
DTBP	0.9931- 0.9990	1.26	3.83	2	4.82	3.25	100	83±5
				10	2.16	1.79	1000	89±7
				20	3.53	6.09
				50	2.87	0.72
				100	4.18	1.38

즉, 1-500 ㎍/mL 범위에서 R²값이 각각 0.9983-0.9999 (DES), 0.9986-0.9998 (4-VG), 0.9931-0.9990 (DTBP)으로 직선성을 보였다. 0.1 ㎍/mL과 1 ㎍/mL 농도의 다섯 가지 기능성 물질들 대한 회수율은 각각 78±8%, 83±9% (DES), 114±6%, 114±8% (4-VG), 104±15%, 99±6% (DTBP), 88±8%로 정확도가 매우 높았다. 이 회수율 결과는 0.1 ㎍/mL과 1 ㎍/mL 농도에 대해 CODEX에서 지정한 범위(80-120%)에 인정된다.

또한, GC/MSD 모드로 분석한 총 이온크로마토그램을 도 3(a)에 도시하였다. GC-MS 분석방법에 대한 검출한계(Limit of detection, LOD), 정량 한계(limit of quantification, LOQ), 재현성(reproducibility), 회수율(recovery)에 대한 결과는 상기 표 2와 같다. 상기 GC/MSD를 사용하여 막걸리 추출액을 분석한 총 이온크로마토그램은 도 3(b)에, 맥주 추출액을 분석한 총 이온크로마토그램은 도 3(c)에, 와인 추출액을 분석한 결과는 총 이온크로마토그램은 도 3(d)에 도시하였다. 이를 통해 세 가지 기능성 물질 모두 분리됨음 확인하였다.

[실험예 3] 혼합 용매별 추출 비교 2

1. 시료의 준비

상기에서 준비한 것처럼 12 종의 막걸리 시료를 시중마트에서 구입하여 사용하였다.

2. 용매 추출 방법 및 조건

(1) 석유 에테르/클로로포름/메탄올 혼합 용매 추출 (실시예 1)

50㎖의 막걸리 시료를 250㎖ 원심 분리기 병에 넣고 100㎖의 혼합 용매(석유 에테르 : 클로로포름 : 메탄올 = 2 : 2 : 1, v/v)와 3 % 염화나트륨 (w/v)을 첨가하였다. 병을 자동 쉐이커 (SR-2W, Taitec, Saitama, Japan)로 교반하여 샘플로부터 30 분간 시료를 추출한 다음 10,000 rpm으로 5 분간 원심분리하였다. 유기상 (하부층)을 무수 황산나트륨을 사용하여 탈수시키고, 여과지 (Whatman No. 1)로 여과시킨 후, 둥근 플라스크에 수집하였다. 추출 단계는 3회 수행하였다. 이어서, 용매를 회전 증발기로 처리하고, GC-MS 분석을 위해 잔류물을 1.5 ㎖의 에틸 아세테이트에서 재구성하였다.

(2) 메탄올/석유 에테르 혼합 용매 추출 (비교예 1)

50㎖의 막걸리 시료를 250㎖ 원심 분리기 병에 넣고 100㎖의 혼합 용매 (메탄올 : 석유 에테르 = 1 : 1, v/v)를 병에 넣었다. 병을 자동 쉐이커 (SR-2W, Taitec, Saitama, Japan)로 30 분 동안 교반하고 10,000 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하였다. 유기상 (상부층)을 무수 황산나트륨을 사용하여 탈수시키고, 여과지 (Whatman No. 1)로 여과시킨 후, 둥근 플라스크에 수집하였다. 추출 단계는 3회 수행하였다. 이어서, 용매를 회전 증발기에서 처리하고, GC-MS 분석을 위해 잔류물을 1.5 ㎖의 에틸 아세테이트에서 재구성하였다.

(3) 메탄올/클로로포름 혼합 용매 추출 (비교예 2)

50㎖의 막걸리 시료를 250㎖ 분액 깔때기에 넣고 100㎖의 혼합 용매 (메탄올 : 클로로포름 = 1 : 1, v/v)를 깔때기에 넣었다. 분액 깔대기를 30 분 동안 자동 쉐이커 (SR-2W, Taitec, Saitama, Japan)로 교반하고 24 시간 동안 유기층과 수성층이 분리될 때까지 방치하였다.

(4) 메탄올/디클로로메탄 추출 (비교예 3)

50㎖의 막걸리 시료를 250㎖ 분액 깔때기에 넣고 100㎖의 혼합 용매 (메탄올 : 디클로로메탄 = 1 : 1, v/v)를 깔때기에 넣었다. 분액 깔대기를 30 분 동안 자동 쉐이커 (SR-2W, Taitec, Saitama, Japan)로 교반하고 24 시간 동안 유기층과 수성층이 분리될 때까지 방치하였다.

막걸리에 존재하는 생리 활성 화합물을 Agilent 7890A 가스 크로마토그래피 장비와 5975c 사중 극자 질량 분석기 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)로 분석하였다. 분리는 5% 디페닐-95% 디메틸실록산-융화 실리카 모세관 컬럼 (HP-5ms, 30m, 250㎛ i.d., 0.25mm 필름 두께, Agilent Technologies, Middleburg, OI, USA)을 사용하여 수행하였다. 운반 기체는 1.5 ㎖ min^-1 유속의 헬륨이었다. GC 인젝터의 온도는 250℃에서 유지되었으며 스플릿 비율은 5 : 1로 설정되었다. GC 오븐은 다음과 같이 프로그램되었다 : 100 ℃에서 1분간 유지; 12분 동안 분당 10℃ 속도로 100℃에서 220℃로 증가; 3.5분 동안 분당 20℃ 속도로 220℃에서 290℃로 상승; 분당 10℃ 속도로 290℃에서 305℃로 증가, 305 ℃에서 5 분간 유지. MS 전달 라인, 이온 소스 및 사중 극자 분석기의 온도는 각각 280℃, 230℃ 및 150℃로 유지되었다.

막걸리에 존재하는 휘발성 물질을 확인하기 위해 m/z 35 ~ 350 사이의 질량 범위에서 전체 스캔 모드를 사용하여 질량 스펙트럼을 기록하고 질량 스펙트럼을 Wiley 및 NIST08 라이브러리 데이터베이스의 데이터와 비교하였다. 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀의 확인은 체류 시간과 질량 스펙트럼을 실제 표준과 비교하여 확인되었다. 이들 2 가지 화합물의 정량화를 위해, 선택된 이온 모니터링 (SIM) 모드가 사용되었다. SIM 모드에 대한 2 가지 화합물에 대해 선택된 이온은 다음과 같다 : 4-VG (107, 135, 150m/z); DTBP (74, 191, 206 m/z) (굵은 글씨는 모니터링 이온을 나타낸다).

4. 실험 결과

막걸리에 존재하는 휘발성 화합물을 추출하기 위한 최적의 용매를 선택하기 위해 먼저 메탄올/디클로로메탄 (1:1, v/v)과 메탄올/클로로포름 (1:1, v/v) 혼합물을 추출 용매로 평가한 결과, 이들 두 가지 혼합 용매는 광범위한 유화액 형성으로 인해 24 시간 후에 수성 및 유기층을 분리할 수 없었다. 단백질, 지방산 및 인지질을 포함한 일부 유화 인자가 유화액 형성에 기여하는 것으로 보인다.

클로로포름, 디클로로메탄, 메틸렌 클로라이드 등을 추출용매로 사용하였을 때 상기에서 언급한 단점을 극복하기 위하여 중간극성 용매로서 석유 에테르를 사용하였다. 석유 에테르는 극성은 낮고 물보다 가볍기 때문에 막걸리로부터 향미성분을 추출하는데 매우 용이하였다. 석유 에테르는 휘발성이 매우 강하고 시료용기를 녹이는 성질이 강하므로 이를 고려하여 밀폐가 잘되는 시료 추출용기를 선정하여 막걸리로부터 기능성물질과 향미성분을 추출하였다. 층 분리가 매우 쉽게 되었고 추출도 효율적으로 이루어졌다. (도 2 참조) 석유 에테르는 극성이 낮은 용매이나 메탄올과 같이 혼합하여 추출하였으므로 극성이 낮은 물질과 극성이 중간 물질이 동시에 추출된다. 이에 석유 에테르/메탄올 (1:1, v/v)의 혼합 용매(비교예 1)를 사용한 경우는 수성층 및 유기층을 명확하게 분리시켰다. 유기층을 농축하고 GC-MS 분석을 실시하여 다양한 성분의 검출을 확인하였고, 분석한 결과 DTBP이 분리확인 되었다. DTBP는 항산화 작용을 하는 물질로 알려져 있으며 석유제품 중에 소량이 함유되어있다. 본 연구에서 막걸리에 DTBP가 들어있는 것을 처음으로 확인하였다.

4-VG 및 DTBP를 동시에 추출하기 위해 클로로포름/석유 에테르/메탄올(2:2:1, v/v) 혼합용매를 사용한 실시예의 경우 모든 것을 성공적으로 분히 검출함을 확인하였다. 나아가 본 추출방법은 부탄올과 같은 용매를 이용하지 않아 최종 공정 시간이 단축되면서도 기능성 성분의 검출 정도도 정확, 정밀하여, 매우 효율적으로 검출할 수 있다. 직접 분사(DI-GC/MS), 고상 미세 추출 (SPME-GC/MS), 용매추출-GC/MS 로 추출한 위 기능성 성분의 비교 분석결과, DI-GC/MS로 분석한 결과 새로운 기능성 물질은 검출되지 않았고 SPME-GC/MS로 분석한 결과 DES와 4-VG가 확인되었고 SE-GC/MS로 분석한 결과 DES, 4-VG, DTBP 성분 모두 확인되었다. 또한, 본 연구는 발효 주류액에서 4-VG 및 DTBP 성분이 존재한다는 것을 처음 발견하였다.

[실험예 4] 본원 발명의 검증

1. 검증 방법

SE/GC-MS 방법의 검증을 위해 선형성, 정확도, 감도 및 정밀도를 평가하였다. 4-VG 및 DTBP의 선형성은 결정계수 (r ²) 값으로 계산하고, 각 화합물에 대한 표준 농도의 변화에 따라 5 내지 6 점의 값을 갖는다.

방법의 정확도는 회수 시험을 통해 평가되었다. 각 분석물의 5 또는 50 마이크로그램을 막걸리 시료에 첨가한 후 강화된 시료를 추출하고 GC-MS 분석을 수행하였다. 각 분석물의 회수율(%)은 다음 식을 사용하여 계산되었다.

[식 1]

여기서 C_f는 강화된 시료의 농도이고, C_u는 첨가되지 않은 시료의 농도이며, C_a는 첨가된 분석 물의 농도이다.

방법의 감도는 검출 한계 (limit of detection, LOD)와 정량 한계 (limit of quantification, LOQ) 값에 의해 결정되었다. LOD 및 LOQ 값은 다음과 같은 방정식으로 계산되었다.

1) LOD = 3.3σ/s

2) LOQ = 10σ/s

(σ = 응답의 표준 편차 (n = 6), s = 검량선의 기울기).

정밀도는 일일 및 일간 반복성을 측정하여 평가되었다. 각 분석물에 대해 3 가지 상이한 농도의 표준 용액을 GC-MS 분석에 하루 동안 6 회 연속적으로 주입하고, 3 일 동안 매일 1 회 분석을 위해 하루에 1 회 주사하였다.

2. 검증 결과

방법의 선형성을 평가하기 위해 각 화합물에 대한 표준 용액의 다른 농도가 사용되었다. 표준 용액에 대한 크로마토그래피 결과를 도 4에 나타냈다. 표준 용액을 6회 연속 GC-MS에 주입하고 회귀 분석을 통해 각 화합물의 선형성을 상관계수 (r ²)로 계산하였다. 모든 화합물은 0.99보다 높은 r ² 값으로 높은 선형성을 보였다.

각 화합물을 포함하는 방법에 대한 LOD 값과 LOQ 값은 상기에서 기재된 대로 계산되었고 각각 6.2 또는 22.5, 18.7 내지 68.1 ng mL^-1 이었다 (표 4).

화합물	선형 영역 (ng mL^-1)	상관 계수 (r ²)	LOD	LOQ
4-VG	30-3000	0.9999	22.5	68.1
DTBP	30-1500	0.9999	6.2	18.7

SE/GC-MS 방법의 반복성을 평가하기 위해 일일 및 일간(Inter- and intra-day) 정밀 검사를 수행했다. 이 시험에서는 3 가지 농도의 두 화합물의 표준 용액을 GC-MS 분석에 같은 날에 6 번 또는 3 일 연속으로 3 일 연속 주입하였다. 화합물의 일일 정밀도는 2.16 %에서 4.82 % 범위였고, 일간 정밀도는 0.72 %에서 4.17 % 범위였다 (표 5).

화합물	농도 (ng mL^-1)	반복성 (%, RSD)
화합물	농도 (ng mL^-1)	일일 (n=6)	일간 (n=3)
4-VG	60	3.81	4.17
	300	3.41	1.11
	3000	2.99	1.65
DTBP	60	4.82	3.25
	300	2.16	1.79
	1500	2.87	0.72

^{* RSD: 상대표준편차(relative standard deviation)}

SE-GC/MS 방법의 정확성을 평가하기 위해 화합물에 대한 회수 검사를 수행하였다. 각 화합물에 대한 두 가지 다른 농도 (100 및 1000 ng mL^-1)의 표준 용액을 첨가하고 상기에서 설명한대로 회수율을 계산하였다. 각 화합물의 회수율은 각각 100 및 1000 ng mL^-1의 피크 농도(spiked concentration)에서 4-VG는 114%, DTBP는 104%, 99% 였다 (표 6).

피크 농도(ng mL^-1)	회수율(%)¹⁾
피크 농도(ng mL^-1)	4-VG	DTBP
100	114±6	104±15
1000	114±8	99±6

^{1) 수는 평균값 ± 표준 편차 (n = 3)를 나타낸다.}

[실험예 4] 다양한 주류발효액에 대한 실험

다른 알코올 음료 샘플에서 SE-GC/MS 방법의 적용 가능성을 테스트하기 위해 막걸리, 맥주 및 와인 샘플에서 각 화합물의 농도를 결정하였다. SIM에 의해 얻어진 크로마토그램은 도 4에 나타냈다.

4-VG의 농도는 막걸리, 맥주 및 와인에서 각각, 72 내지 1977 ng mL^-1 (측정되지 않은 샘플 3 제외), 120 내지 871 ng mL^-1, 101 내지 283 ng mL^-1의 범위였다. DTBP의 농도는 막걸리, 맥주 및 와인에서 각각, 33 내지 102 ng mL^-1, 38에서내지 50 ng mL^-1, 26 내지 49 ng mL^-1의 범위였다.

4-VG는 시리얼 알갱이에 존재하는 풍부한 하이드록시신남산인 페룰산(ferulic acid)으로부터 형성되며 효모 발효 중에 나타난다. HPLC 분석을 통해 맥주에서 0.15 내지 4.10 μg mL^-1의 농도로 측정할 수 있다. 포도주에 비해 막걸리와 맥주의 4-VG 농도가 상대적으로 높다는 것은 출발 물질의 차이 (시리얼 알갱이 대 포도) 때문인 것으로 보인다. 또한 휘발성 항산화 물질인 DTBP는 고구마와 석류를 포함한 일부 식물에서 확인되었으며 막걸리, 맥주 및 와인을 생산하는 데 사용되는 원재료인 식물에서 나타난다.

요약하면, 본 발명은 막걸리에서 기능성 성분, 특히 4-VG 및 DTBP를 효과적으로 분석하기 위한 새로운 SE-GC/MS 접근법이다. 이 분석 방법은 유효성 검사에서 우수한 선형성, 민감도, 정확성 및 반복성을 나타낸다. 모든 주류 시료에서 DTBP를 정량하였고, 포도주보다 막걸리 및 맥주에서 4-VG를 고농도로 정량화하였다. 이러한 결과는 SE-GC/MS 방법이 막걸리에 존재하는 생체 활성 화합물을 특수 분석 장비없이 분석할 수 있는 간단하고 민감한 기술로 사용될 수 있음을 시사한다.

이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시 예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

클로로포름(chloroform), 석유 에테르(petroleum ether) 및 메탄올(methanol)의 혼합 용매를 추출 용매로 사용하고, 혼합 용매는 혼합 용매 총 부피에 대하여, 클로로포름 35 내지 45 부피%, 석유 에테르 35 내지 45 부피% 및 메탄올 15 내지 25 부피%인, 주류 발효액으로부터 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀을 추출하는 방법.
하기 단계를 포함하는 주류 발효액으로부터 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀을 추출하는 방법:
S1) 시료에 클로로포름, 석유 에테르 및 메탄올의 혼합 용매이며, 혼합 용매 총 부피에 대하여, 클로로포름 35 내지 45 부피%, 석유 에테르 35 내지 45 부피% 및 메탄올 15 내지 25 부피%인 혼합 용매를 섞는 단계;
S2) 교반하는 단계;
S3) 원심분리하는 단계;
S4) 하등액을 수득하는 단계; 및
S5) 수득된 하등액을 농축하는 단계.
삭제
하기 단계를 포함하는 주류 발효액으로부터 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀을 분석하는 방법:
S1) 시료에 클로로포름, 석유 에테르 및 메탄올의 혼합 용매이며, 혼합 용매 총 부피에 대하여, 클로로포름 35 내지 45 부피%, 석유 에테르 35 내지 45 부피% 및 메탄올 15 내지 25 부피%인 혼합 용매를 섞는 단계;
S2) 교반하는 단계;
S3) 원심분리하는 단계;
S4) 하등액을 수득하는 단계;
S5) 수득된 하등액을 농축하는 단계; 및
S6) GC-MS(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer)로 농축물을 분석하는 단계.
제4항에 있어서, 상기 농축물은 에탄올, 아세톤 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 용해하여 분석되는 것인, 주류 발효액으로부터 4-비닐구아이아콜 및 2,4-디-터트-부틸페놀을 분석하는 방법.