KR102547430B1 - 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노니에 함유된 유효성분을 신속 정확하게 분석하여 노니 함유 조성물의 정보를 확인함으로써 이를 활용한 제품 개발 및 매출 증대를 이룰 수 있는 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법을 개시한다.

Description

노니 함유 조성물의 정성 분석 방법{Method for qualitative analysis of noni-containing composition}

본 발명은 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법에 관한 것이다.

노니(noni, beach mulberry, Indian mulberry, cheese fruit, great morinda)는 꼭두서니과, 노니속에 속하는 상록관목이다. 지역마다 인도뽕나무, 바지티안, 진통제나무, 치즈과일, 파극천 등으로도 불리기도 한다.

노니는 주로 열대 지방 특히 해안가의 화산성 토양에서 많이 서식한다. 노니의 열매는 식품 및 약용으로 많이 이용되고 있으며, 이외에도 잎, 줄기, 꽃, 씨등이 약용으로 이용되기도 한다.

노니는 당뇨병, 심혈관 질환, 두통, 관절염 등에 도움이 된다고 알려져 있다. 항산화 물질이 풍부하며 비타민 C, A, 철분 등이 많이 함유되어 있어 노화 예방에 도움이 될 수 있으며 해독작용에도 도움이 된다고 알려져 있다.

특허문헌 1에서는 에탄올을 추출 용매로 하여 8 kDa 내지 10 kDa의 평균 분자량을 갖는 다당체들을 다량 함유하도록 제조된 노니 열매 추출물 또는 이의 분획물이 숙취 해소에 효과가 있어, 이를 이용한 숙취 해소 음료에 적합하다고 개시하고 있다.

특허문헌 2에서는 노니를 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)으로 접종 후 발효한 발효 노니가 고함량의 이리도이드 성분을 포함하여 항아토피 피부염 효능이 있다고 언급하고 있다.

이외에도 특허문헌 3 내지 5와 같이 다양한 기능을 하는 노니 주스가 제안되고 있다.

이와 같이 노니 또는 노니 발효물을 이용한 다양한 제품들이 개발되고 있다.

상기 언급한 노니 또는 노니 발효물은 여러 가지 효과를 나타내는데 보다 우수한 효과를 얻기 위해선 노니 또는 노니 발효물 내에 함유된 유용 성분의 분석이 필요하다.

노니의 유용성분으로는 스코폴레틴(scopoletin), 루틴(rutin) 등과 같은 폴리페놀 화합물, 알칼로이드, 리그난, 지방산 에스테르, 유기산, 비타민 및 미네랄 등이 보고되었으며, 심혈관질환, 당뇨병, 암, 항균 등에 효능이 있다고 알려져 있다. 따라서 식품 및 제약 산업의 연구자들은 노니의 다양한 효능에 주목하고 있으며, 기능성 식품 소재로서의 가능성이 제기되었다

노니를 이용한 건강기능성 식품 개발을 위해서는 노니의 효능평가와 더불어 지표성분 및 유효성분의 효능 및 분석평가를 통한 표준화가 이루어져야한다. 상기 지표성분 이외에 다른 유효성분의 존재를 확인할 경우 노니를 이용한 응용 분야가 더욱 확대될 수 있다.

더욱이 노니 발효물의 경우에는 발효라는 과정을 통해 생리 활성 물질의 구조적 변화가 유도되어 유효성분의 함량 변화가 발생한다. 발효는 미생물에 의해 유기물을 분해하는 과정이며, 이를 통해 유효성분 함량을 높이고 흡수율을 향상시키며 새로운 기능성 성분의 생성을 유도하여 노니의 기능성을 더욱 향상시킬 수 있다. 그러나 아직까지 발효에 따른 노니의 기능성 개선과 유효성분의 분석 및 이에 따른 효능평가 연구는 부족한 실정이다

따라서 노니 또는 노니 발효물 내 함유된 유효성분을 동정할 경우 상기 유효성분이 갖는 효능 및 효과에 대한 확인이 가능하여 노니의 기능성 식품 소재로서의 가능성을 더욱 높일 수 있다.

KR 공개 10-2022-0067501 (2022.05.24) KR 공개 10-2022-0071718 (2022.05.31) KR 공개 10-2022-0060768 (2022.05.12) KR 공개 10-2022-0059220 (2022.05.10) KR 공개 10-2022-0059178 (2022.05.10)

본 발명에서는 고성능 액체 크로마토그래피 비행시간형 질량분석기 (high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry; HPLC-QTOF-MS) 분석 장치를 이용하여 노니 또는 노니 발효물 내에 함유된 유효성분을 신속 정확하게 분석할 수 있었다.

본 발명의 목적은 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명에 따른 노니 함유 조성물 내 함유된 화합물을 정성 분석 방법은 분석대상시료로 노니 함유 조성물을 준비하는 단계; 분석대상시료를 전처리하는 단계; 전처리된 분석대상시료를 HPLC-QTOF-MS(high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry)로 분석하는 단계를 거쳐 한다.

이하 각 단계별도 상세히 설명한다.

(A) 분석대상시료 준비 단계

먼저, 분석대상시료로 노니 함유 조성물을 준비한다.

분석대상시료인 본 발명의 노니 함유 조성물은 노니 및 노니 발효물 중 어느 하나 이상을 포함하는 분말 또는 용액이다. 일례로, 노니 분말, 노니 주스, 노니 원액, 노니 발효액 등일 수 있다.

(B) 전처리 단계

기기분석을 위한 전처리 단계는, 분석대상시료를 추출 용매로 추출하는 단계; 얻어진 추출물을 원심분리하는 단계; 및 여과 후 상등액을 얻는 단계를 포함한다.

추출 공정으로는 교반, 냉침(정치), 초음파, 환류 등의 추출방법을 이용하여, 각 방법별로 용매의 종류 및 조성, 추출시간 및 추출온도 등의 변화를 주어 실시할 수 있다.

추출 방법과 함께 추출 용매의 종류 및 추출 시간에 따라 추출물의 수율과 지표 성분을 비롯한 화합물의 함량에 차이가 있기 때문에, 추출 용매 및 시간을 조절한다.

분석대상시료는 여러 가지 성분이 혼합된 상태이므로, 각 화합물(지표성분, 유효성분, 미지의 성분)의 분석을 위해선 적절한 유기용매를 사용하여 정량적으로 분배 및 농축시켜야 한다. 이런 조건을 만족시킬 수 있도록 다양한 추출 용매가 후보군으로 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 추출 용매로 아세토니트릴(acetonitrile, ACN):이소프로판올(isopropanol):물을 3:3:2(v/v/v)의 부피비로 혼합한 혼합 용매를 사용한다.

일 구현예에 따르면, 분석대상시료 0.1g을 2.0 mL e-tube에 취한 뒤 1.5 mL의 추출 용매를 첨가하여 2분 내지 10분, 바람직하기로 5분간 교반하여 상온에서의 용매 추출을 수행한다.

추가로, 추출 효율을 높이기 위해 상온에서 용매 추출 후 초음파 추출기를 이용한 초음파 추출 공정을 더욱 수행한다. 상기 추출 효율이 높을수록 분석대상시료 내 화합물의 동정이 보다 명확해질 수 있다.

초음파 추출 공정은 분석대상시료 내 존재하는 화합물의 추출 용매에 대한 분배 속도를 더욱 높일 수 있다. 구체적으로, 상기 초음파 추출 공정은 2℃ 내지 5℃, 바람직하기로 4℃에서, 30분 내지 2시간, 바람직하기로 1시간 동안 수행한다.

다음으로, 얻어진 추출물을 원심분리하여 상등액을 얻는다.

원심분리는 분석대상시료 내 화합물의 분석능 및 신뢰도를 높이기 위해 수행한다. 추출 공정 이후에도 추출 용매 내 완전하게 용해되지 않은 부유물은 분석에 방해가 될 뿐만 아니라 신뢰도를 낮춘다. 이에 원심분리를 통해 이러한 부유물 등을 제거한다.

원심분리는 5,000rpm 내지 20,000rpm, 바람직하기로 15,000rpm으로 2℃ 내지 5℃, 바람직하기로 4℃에서, 1분 내지 30분간, 바람직하기로 10분간 수행한다.

상기한 단계는 분석대상시료의 전처리 단계에 해당하며, 이후 분석기기를 이용하여 노니 함유 조성물 내 존재하는 유효성분 화합물의 동정을 수행한다.

(C) 분석 단계

본 분석에 사용되는 기기는 HPLC-QTOF-MS 분석기기이다.

HPLC(high performance liquid chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피)는 고정상 및 이동상으로 충진된 칼럼에 시료가 통과하면서, 상기 이동상과 고정상에 대한 친화도에 따라 머무르는 시간의 차이로 인해 혼합 화합물들을 분리할 수 있다. 이때 HPLC를 통해 분자량 및 체류 시간(retention time)에 대한 정보를 얻는다.

질량분석(MS)은 시료에 들어있는 화합물을 식별하기 위해 물질을 이온화시켜 질량 대 전하(m/z, mass-to-charge ratio) 비율을 사용하는 분석 기술로, 화합물의 분자량을 측정하고 동위원소 존재비 및 이온의 쪼개짐 형태(fragmentation pattern)를 분석하여 분자의 구조를 규명하는 분석 방법이다.

본 발명에 사용하는 HPLC-QTOF-MS 분석기기는 HPLC와 QTOF 질량 분석기를 함께 사용하는 장치로, 여러 가지 성분들이 혼합되어 있는 물질을 HPLC를 이용하여 각각의 성분을 분리시킨 후, 진공관에서 고온의 질소가스에 의해 물질을 기화시키고, 이온화 장치에 의해 이온화되어 질량분석기로 도입된다. 도입된 물질은 분자량, 체류시간, 질량대전하비(m/z), 동위원소(isotope) 패턴 및 조각이온(fragment ion) 패턴을 얻는다. 이러한 정보를 이용하여 분석대상시료인 노니 함유 조성물 내에 존재하는 화합물을 동정한다.

HPLC-QTOF-MS 분석기기를 이용한 화합물의 정성 분석은 알려져 있으나, 지표성분 및 미지의 성분을 포함하는 노니 함유 조성물 내 화합물을 동정하기 위해서는 새로운 조건이 필요하다. 즉, 선택성을 높이고, 다른 간섭 영향을 줄이기 위해 분석 조건의 한정이 필요하고, 이를 검증할 수 있는 새로운 방법이 제시되어야 한다.

HPLC 조건은 사용 칼럼, 온도, 유량, 런타임, 및 이동상의 조건을 확립한다. 이때 상기 이동상은 0.1% Formic acid in water 1 내지 99 중량%와 0.1% Formic acid in acetonitrile (ACN) 1 내지 99 중량%의 혼합 용매를 이동상으로 한다.

HPLC-QTOF-MS 분석은 이온 고유의 질량 대 전하비(m/z)로 혼합물에서 관심 이온을 분리하고 검출한다. 이때 검출 과정은 관심 이온을 질소와 충돌시켜 precursor 이온이 product 이온으로 조각화되는 패턴 확인을 통해 관심 화합물을 식별한다. 이에 HPLC-QTOF-MS 분석 조건은 양이온(positive ion) 및 음이온(negative ion)에서 각각 ms scan mode와 auto ms/ms mode 조건을 설정한다. 구체적으로, 각 모드에서의 이온화 조건을 설정하고, 구체적으로 가스 온도, 건조 가스 유량, 네블라이저, Sheath 가스 온도 및 유량, V 캡, Fragmentor, Octapole Vpp, 충돌 에너지(Collision energy), 분자량 범위 등을 설정한다.

화합물의 동정은 데이터베이스를 활용한 방법으로 수행한다.

HPLC-QTOF-MS 분석을 통해 얻어진 분석 결과를 이용하여 chromatogram 패턴(extracted ion chromatogram (EIC)), 각 피크의 분자량값 정보를 얻고, 데이터베이스 내 존재하는 화합물의 정보와 매칭하여 화합물을 동정한다.

다양한 라이브러리 및 데이터베이스가 있으나, 본 발명세서는 METLIN 데이터베이스를 사용하여 METLIN library 내 저장된 데이터로부터 분석된 화합물의 매칭이 이루어진다. 상기 METLIN 데이터베이스는 체류 시간, 분자량, 스펙트럼, m/z값, 동위원소 패턴 및 조각이온 패턴에 대한 정보가 있다. 이러한 데이터베이스의 활용은 화합물 식별의 정확성을 향상시킬 수 있고, 빠른 동정을 수행할 수 있다.

화합물의 동정은 화합물의 분자량을 데이터베이스에 입력하여 매칭된 화합물의 정보를 얻고, EIC(Extracted Ion Chromatogram)를 활용하여 상기 매칭된 화합물의 m/z값을 데이터베이스에 입력하고, 입력된 화합물의 동위원소 패턴 및 조각이온 패턴을 확인하여 화합물을 식별하는 단계를 거쳐 이루어진다.

일 구현예에 따르면, 화합물을 동정은, 블랭크 분자량(mass)값 및 분석대상시료의 분자량값 추출 단계; 분석대상시료의 분자량값으로부터 블랭크 분자량값을 제외하여 분석대상시료의 분자량값을 추출한다.

다음으로, METLIN 데이터베이스를 이용하여 라이브러리 매칭(library matching)을 수행한 후, 매칭된 화합물을 식별한다.

구체적으로, 분석대상시료의 분자량값을 METLIN 데이터베이스에 입력하여 라이브러리 매칭을 수행하여 매칭된 화합물의 정보를 확보한다.

동위원소 패턴의 확인은 EIC(Extracted Ion Chromatogram)를 활용하여 상기 매칭된 화합물의 m/z값을 데이터베이스에 입력하고, 추출된 크로마토그램을 클릭하여, 입력된 화합물의 m/z값과 동위원소 패턴을 확인할 수 있다.

조각이온 패턴의 확인은 EIC(Extracted Ion Chromatogram)를 활용하여 상기 매칭된 화합물의 m/z값을 데이터베이스에 입력하고, Collision energy별 MASS 스펙트럼을 비교하면서 입력된 화합물의 조각이온 패턴을 확인할 수 있다.

METLIN 데이터베이스를 이용한 화합물의 동정은 Agilent Masshunter Qualitative analysis (version 10.0) 프로그램을 이용하였다. 도 1은 Agilent Masshunter Qualitative analysis 분석 프로그램으로부터 얻어지는 결과를 보여주는 이미지로, 분석을 통해 다양한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 정보를 통해 화합물의 동정이 가능하다.

(D) 검증 단계

다음으로, 동정된 화합물의 검증 단계를 수행한다.

검증 단계에 사용된 시료는 외부표준물질일 수 있다.

내부표준물질은 시료에 직접 표준물질을 가하는 방식으로 사용하므로 상기 화합물의 동정시 간섭을 야기할 수 있다. 이에 본 발명에서는 동정된 화합물과 동일한 외부표준물질(external standard)을 사용하여 동정된 화합물의 검증을 수행한다.

일례로, 노니 함유 조성물의 외부표준물질로 루틴(Rutin), 디아세틸아스페루시딕 애시드(Deacetylasperulosidic acid), 스코폴레틴(Scopoletin), 로즈마리닉 애시드(Rosmarinic acid), 이소쿠에르시트린(Isoquercitrin), p-쿠마릭애시드(p-Coumaric acid), 비타민 C(Vitamin C), 베타카로틴(beta-Carotene), (+)-카테킨 수화물((+)-Catechin hydrate), 에피카테킨(Epicatechin), 리보플라빈(Riboflavin), 니코티닉 애시드(Nicotinic acid), 및 니코틴아마이드(Nicotinamide)를 포함한다. 이러한 외부표준물질은 하나의 예시이며, 분석대상시료인 노니 함유 조성물 내 동정된 화합물의 종류에 따라 달라질 수 있다.

검증은 외부표준물질을 이용하여 상기 분석대상시료와 동일한 조건에서 HPLC-QTOF-MS 분석을 수행하고, m/z값, 동위원소 패턴 및 조각이온 패턴 등의 정보를 얻는다. 이러한 정보를 동정된 화합물과 비교하여 검증한다.

본 발명에 따른 노니 함유 조성물의 성분 분석 방법을 통해 조성물 내 함유된 화합물의 유효성분을 확인하여 이를 이용하여 다양한 식품의 제조가 가능하다. 또한, 각 유효성분의 함량을 높일 수 있는 재배조건 및 추출조건을 이용하여 최적의 노니 또는 노니 발효물을 확보하고 이를 이용하여 제품을 생산함으로써 노니 제품을 생산할 수 있다.

예를 들면, 노니는 당뇨병, 심혈관 질환, 두통, 관절염 등에 도움이 된다고 알려져 있으며, 상기 유효성분의 확인을 통해 의약품 또는 보조제 등의 연구에 사용될 수 있다. 또한, 노니는 항산화 물질이 풍부하며 비타민 C, A, 철분 등이 많이 함유되어 있어 노화 예방에 도움이 되고, 해독작용에도 도움이 된다고 알려져 있어, 화장품 또는 식음료 등의 분야에 원료로서 사용될 수 있다.

본 발명에서는 HPLC-QTOF-MS 분석 장치를 이용하여 노니 또는 노니 발효물 내에 함유된 유효성분을 신속 정확하게 분석할 수 있다.

아직까지 발효에 따른 노니의 기능성 개선과 유효성분의 분석 및 이에 따른 효능평가 연구는 부족한 실정이나, 본 발명에 따른 방법을 통해 노니 또는 노니 발효물 내 함유된 유효성분을 동정함으로써 노니의 기능성 식품 소재로서의 가능성을 더욱 높일 수 있다.

도 1은 Agilent Masshunter Qualitative analysis 분석 프로그램으로부터 얻어지는 결과를 보여주는 이미지이다.
도 2는 분석 프로그램에서 blank mass값을 추출함을 보여주는 이미지이다.
도 3은 분석 프로그램에서 sample mass값을 추출함을 보여주는 이미지이다.
도 4는 METLIN library matching 과정을 보여주는 이미지이다.
도 5는 METLIN library 매칭된 화합물을 보여주는 이미지이다.
도 6은 동위원소 비율 계산 과정을 보여주는 이미지이다.
도 7은 EIC를 이용한 동위원소 패턴확인 과정을 보여주는 이미지이다.
도 8은 스코폴레틴의 동위원소와 조각이온패턴의 확인 과정을 보여주는 이미지이다.
도 9는 외부표준물질에 대한 정보를 보여주는 표이다.
도 10은 sample 1의 분석결과이다.
도 11은 sample 2의 분석결과이다.
도 12는 sample 3의 분석결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 분석대상시료 준비

하기 3가지의 분석대상시료를 준비하였다. 시료는 노니주스에 사용되는 원료를 포함하여 총 3가지를 50 mL 씩 분주하여 실험에 사용하였다.

sample 1	sample 2	sample 3
유기농 노니 쥬스	유기농 발효 노니 주스 -1	유기농 발효 노니 주스 -2
- organic noni 100%	* Fermented Noni Pressed Juice - Organic noni 99.99% - 7 types of complex lactic acid bacteria AON 1805	* Fermented Noni Pressed Juice - Organic noni 99.99% - 7 types of complex lactic acid bacteria AON 1805 * Organic coconut sugar * Calamansi juice * Organic AON CD syrup

7종 복합 유산균은 다음과 같다.

(1) 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum)

(2) 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)

(3) 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei)

(4) 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum)

(5) 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei)

(6) 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)

(7) 락토코커스 락티스 서브스피셔스 락티스 (Lactococcus lactis subsp. lactis)

2. 전처리 단계

1) sample 약 0.1 g을 2.0 mL e-tube에 취한 뒤 1.5 mL의 추출 용매(acetonitrile(ACN):isopropanol:water = 3:3:2, v/v/v)를 첨가하였다.

2) 추출물을 상온에서 5분간 교반하였다.

3) 초음파 추출기를 이용하여 4℃에서 60분간 추출하였다.

4) 원심분리기를 이용하여 4℃에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다.

5) 상등액을 취하여 20배 희석한 후, 0.2 μm 나일론 필터를 이용하여 여과한 후 기기분석에 사용하였다.

3. 동정 단계

1) 분석 장비 및 분석 조건

<HPLC : Agilent 1260 Infinity Ⅱ>

- Column : YMC-Pack Pro C18 (150×4.6 mm I.D., S-3 μm, 12 nm)

- Column oven temperature : 30℃

- Flow rate : 0.3 mL/min

- Run time : 45 min

- Mobile phase : (A) 0.1% Formic acid in water,

(B) 0.1% Formic acid in acetonitrile (ACN)

- Injection volume : 10 μL

- Gradient condition

Time(min)	A(%)	B(%)
0.0	99	1
30.0	60	40
31.0	0	100
35.0	0	100
36.0	99	1
45.0	99	1

<QTOF-MS: Agilent 6530 LC-Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry (QTOF-MS)>

- 조건

Positive MS SCAN mode	Negative MS SCAN mode
Gas temp. : 300℃ Drying gas : 10 L/min Nebulizer : 45 psi Sheath gas temp. : 300℃ Sheath gas flow 11 L/min V cap : 4000 V Fragmentor : 175 V Octapole Vpp : 750 V Collision energy : 0 Mass range : 25 ~ 1700	Gas temp. : 300℃ Drying gas : 10 L/min Nebulizer : 45 psi Sheath gas temp. : 300℃ Sheath gas flow 11 L/min V cap : 4000 V Fragmentor : 175 V Octapole Vpp : 750 V Collision energy : 0 Mass range : 25 ~ 1700
Positive Auto MS/MS mode	Negative Auto MS/MS mode
Gas temp. : 300℃ Drying gas : 10 L/min Nebulizer : 45 psi Sheath gas temp. : 300℃ Sheath gas flow 11 L/min V cap : 4000 V Fragmentor : 175 V Octapole Vpp : 750 V Collision energy : 0, 10, 20 Mass range : 25 ~ 1700	Gas temp. : 300℃ Drying gas : 10 L/min Nebulizer : 45 psi Sheath gas temp. : 300℃ Sheath gas flow 11 L/min V cap : 4000 V Fragmentor : 175 V Octapole Vpp : 750 V Collision energy : 0, 10, 20 Mass range : 25 ~ 1700

2) MassHunter 프로그램 활용

Q-TOF/MS 결과 확인은 Agilent Masshunter Qualitative analysis (version 10.0) 프로그램을 이용하였으며, 하기 단계로 수행하였다.

1. Blank mass값 추출 (도 2 참조)

1) MS SCAN, Auto MS mode에서 분석한 blank 파일을 열어 blank 시료의 mass값을 추출한다.

- Blank mass 추출 조건-

Extraction	Peak filters: use peaks with height ≥ 200
Ion species	H+, H-
Compound filters	Compound quality: quality score ≥ 70
Mass filter	Filter mass list 체크 해제
Results	MS/MS spectrums: precursor tolerance +/- 20.00 ppm

2) mass 값 추출은 프로그램 상단 compounds view 탭을 클릭한 후, 왼쪽 하단 molecular feature 탭에서 mass값 추출 조건을 설정한다.

3) Blank mass 추출 조건을 설정한 후, Find by molecular feature를 클릭한 뒤 blank mass값을 추출하여 csv 파일로 저장한다.

2. sample mass값 추출 (도 3 참조)

1) MS SCAN, Auto MS/MS mode에서 분석한 시료 파일을 열어 sample의 mass값을 추출한다.

- sample mass 추출 조건-

Extraction	Peak filters: use peaks with height ≥ 200
Ion species	H+, H-
Compound filters	Compound quality: quality score ≥ 70
Mass filter	blank mass 입력 후 exclude these mass 체크
Results	MS/MS spectrums: precursor tolerance +/- 20.00 ppm

2) mass 값 추출은 프로그램 상단 compounds view 탭을 클릭한 후, 왼쪽 하단 molecular feature 탭에서 mass값 추출 조건을 설정한다.

3) sample mass 추출조건의 경우 blank와 동일하게 설정하되, mass filter에 앞서 추출한 blank mass 값을 입력한 후, exclude these mass를 체크하여 blank mass값을 제외시킨다.

4) sample mass 조건 설정 후 도 3에서 보이는 바와 같이 Find by molecular feature를 클릭한 뒤 blank mass값을 추출하여 csv 파일로 저장한다.

3. METLIN library matching (도 4 및 도 5 참조)

1) blank mass를 필터링한 sample 파일(MS SCAN, Auto MS/MS mode)을 연 다음, 프로그램 왼쪽 하단의 [Identification]-[Identification workflow]탭을 클릭한다.

2) PCDL 폴더에서 METLIN database를 선택하여 library 목록에 추가한 뒤, Identify all compounds를 클릭하여 library 매칭을 실시한다.

3) 매칭이 완료되면 도 5에서 보이는 바와 같이 METLIN database에서 확인된 sample의 화합물 정보가 나타난다.

4. METLIN library 매칭된 화합물 동정(도 6, 도 7 및 도 8 참조)

1) 상기 3.에서 library 매칭이 완료된 sample의 MS SCAN, Auto MS/MS 파일을 열어 프로그램 상단 navigator view에서 매칭된 화합물들의 m/z값(mass-to-charge ratio, 질량 대 전하비)으로 동위원소 패턴(isotope pattern)을 확인한다.

2) MS SCAN MODE 파일에서 모분자의 isotope pattern을 확인하고, 조각이온 패턴을 확인하여 화합물을 동정한다.

- Isotope pattern 확인방법 (MS SCAN mode 파일 이용) -

(1) Extract ion chromatogram(EIC)을 선택한 후 확인하고자 하는 화합물의 m/z값을 입력한다.

(2) 추출된 크로마토그램을 클릭하여, 화합물의 m/z값과 isotope pattern을 확인한다.

- 조각이온 패턴 확인(Auto MS/MS mode 파일 이용)-

(1) Extract ion chromatogram(EIC)을 선택한 후 확인하고자 하는 화합물의 m/z값을 입력한다.

(2) Collision energy별 mass spectrum을 비교하면서 도 8과 같이 화합물의 조각이온 패턴을 확인한다.

5. 외부표준물질을 이용한 sample의 화합물 검증

1) 외부표준물질 선정

하기 도 9에 기재한 바와 같이, 13종의 물질을 1 ppm과 10 ppb로 제조하여 분석에 사용하였다.

2) 상기 2. 에서 blank mass값을 제외시킨 sample의 MS SCAN 및 Auto MS/MS mode 파일을 오픈하여, 프로그램 상단의 navigator view에서 isotope pattern을 확인한다.

이때 Isotope pattern 확인 및 조각이온 패턴은 상기 4.의 화합물의 동정과 동일한 방식으로 수행한다.

6. 결과

도 10 내지 도 12는 sample 1 내지 sample 3에 대한 동정 결과를 보여준다. 이러한 결과를 보면, 각 주스에 존재하는 화합물의 종류를 정확히 확인이 가능하다.

Claims (10)

1. 노니 함유 조성물 내 함유된 화합물을 정성 분석하기 위해,
   분석대상시료로 노니 함유 조성물을 준비하는 단계;
   분석대상시료를 전처리하는 단계;
   전처리된 분석대상시료를 HPLC-QTOF-MS(high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry)로 분석하여 화합물에 대한 정보를 얻는 단계; 및
   얻어진 정보와 분석에 활용되는 데이터가 저장된 데이터베이스를 이용하여 화합물을 동정하는 단계;를 포함하고,
   상기 화합물의 동정은 화합물의 분자량을 데이터베이스에 입력하여 매칭된 화합물의 정보를 얻고, EIC(Extracted Ion Chromatogram)를 활용하여 상기 매칭된 화합물의 m/z값을 데이터베이스에 입력하고, 입력된 화합물의 동위원소 패턴 및 조각이온 패턴을 확인하여 화합물을 식별하는, 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 정보는 화합물의 분자량, 체류시간, m/z(mass-to-charge ratio, 질량 대 전하비)값, 동위원소(isotope) 패턴 및 조각이온 패턴에 대한 정보를 포함하는, 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법.
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4. 제1항에 있어서,
   동정된 화합물은 검증을 위해,
   동정된 화합물과 동일한 외부표준물질(external standard)을 선정하고,
   상기 외부표준물질을 HPLC-QTOF-MS 분석을 통해 정보를 얻고,
   상기 얻어진 외부표준물질의 정보와 동정된 화합물의 정보와 비교하여 검증하는 단계를 수행하는,
   노니 함유 조성물의 정성 분석 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 분석대상시료는 노니 및 노니 발효물 중 어느 하나 이상을 포함하는 분말 또는 용액인, 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 전처리 단계는,
   분석대상시료를 추출 용매로 추출하는 단계;
   얻어진 추출물을 원심분리하는 단계; 및
   여과 후 상등액을 얻는 단계를 포함하는,
   노니 함유 조성물의 정성 분석 방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 추출 용매는 아세토니트릴(ACN): 이소프로판올: 물이 3:3:2 (v/v/v)로 혼합된 혼합 용매인, 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법.
8. 제6항에 있어서,
   상기 용매 추출 후 원심분리 단계 사이에 초음파 추출기를 이용한 추출 공정을 더욱 수행하는, 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 HPLC 조건은 0.1% Formic acid in water 1 내지 99 중량%와 0.1% Formic acid in acetonitrile(ACN) 1 내지 99 중량%의 혼합 용매를 이동상으로 하는, 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 데이터베이스는 METLIN 데이터베이스인, 노니 함유 조성물의 정성 분석 방법.

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