CN106841428A - 一种有机液态奶的鉴别方法 - Google Patents

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李亚男
李慧
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Abstract

本发明公开了一种基于非靶向检测的有机液态奶鉴别方法，包括以下流程：收集普通液态奶和有机液态奶样本，处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析。在进行非靶向检测分析后，对原始数据进行峰对齐，峰提取，去卷积等处理，将预处理后的数据依次进行PCA、PLS‑DA、OPLS‑DA分析，建立多维统计模型可视化地显示两组之间的代谢谱差异，获得差异性代谢物，并对这些物质进行初步鉴定。本发明可以全面、综合地区分有机液态奶中代谢产物的差异，为有机液态奶的鉴别提供了一种新途径和方法。

Description

一种有机液态奶的鉴别方法
技术领域
本发明属于食品分析技术领域，具体涉及有机液态奶的鉴别方法。
背景技术
2015年世界牛奶年产量预计可超8亿吨，是市面上消耗量最大的食物之一。作为饮食中蛋白质、脂肪等营养物质的主要来源，同时提供包括生物活性肽、抗氧化剂、维生素、矿物质等多种生理活性物质，被誉为膳食中完美的食物之一。
我国有机产业发展迅速，特别是在果蔬、奶制品等方面。2014年的有机食品销售额已达到37.01亿欧元，同比增长52.3％。然而，较低的产量和较高的认证成本导致有机产品价格往往比其传统生产的同行高，并且由于缺乏相应的鉴别分析技术，有机食品真实性难以追溯。
针对脂肪酸、抗氧化剂、激素及农兽药残留等一种或几种指标的定性、定量的分析，可以对有机牛奶和普通牛奶进行有效的区分，但是存在一定的局限性，并不能全面反映有机牛奶的品质，且因实验室和操作人员的不同会对方法的准确度和精密度造成影响。因此以有机液态奶作为研究对象，对其有机真实性进行鉴别研究是一个具有价值的研究方向。
现有的研究表明，非靶向代谢指纹图谱可用于区分有机/非有机系统生成产品，如马铃薯、包菜、胡萝卜、小麦、辣椒、番茄、番茄汁、菠菜、大蒜、辣椒、番茄酱、玉米粒、红葡萄、莴苣、苹果、花椰菜等。然而未见将非靶向代谢指纹图谱应用于有机/非有机系统液态奶的鉴别中。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于非靶向检测的有机液态奶鉴别方法，该方法为有机液态奶的鉴别提供了新途径。
本发明是这样实现的，
一种有机液态奶的鉴别方法，它包括以下步骤：
1)样品提取：将待测样品用醇溶液进行震荡提取，提取液氮气吹干后用甲酸水溶液复溶，然后经0.22um滤膜过滤；
2)UPLC-MS检测：将滤液经色谱分离并采用质谱检测分析，得到样本的原始代谢图谱，其中，色谱分离采用的是HSS T3色谱柱，流动相是甲酸水溶液与乙腈，采用梯度洗脱；
3)对原始代谢图谱进行分析，从而鉴别有机液态奶。
优选地，所述待测样品在提取前还有进行脱脂处理的步骤。
进一步优选地，所述脱脂处理的方法是先将待测样品进行超声破乳，然后离心脱脂。
优选地，所述醇溶液为甲醇。
优选地，所述甲酸水溶液的质量浓度为0.1％。
进一步优选地，所述梯度洗脱的程序、流速及流动相中各成分的体积百分比为：
优选地，所述质谱检测的条件是：电喷雾离子化，采用ESI+模式检测，毛细管电压1.0KV，锥孔电压30.0V，锥孔气流速50L/h，源温度150℃，雾化气温度550℃，雾化气流速1000L/h，以MSE为采集模式，低碰撞能量4eV，高碰撞能量10-50eV，采集质量范围50-1200m/z，应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771Da。
优选地，步骤3)中，将样本的原始代谢图谱采用Progenesis QI软件导入，进行峰对齐，峰提取，去卷积预处理，再对导出的数据依次进行PCA、PLS-DA、OPLS-DA模式识别方法分析，建立多维统计模型，可视化地显示有机液态奶与普通牛奶的代谢谱差异，并采用模型的VIP值，结合学生氏t检验的p值筛选获得差异代谢物，并对这些物质进行初步鉴定。
本发明能全面反映有机牛奶的品质，全面、综合地区分有机液态奶中代谢产物的差异，准确地将有机液态奶与普通牛奶鉴别开，该方法具有准确度、重现性好，精密度高，检测周期短等优点。
附图说明
图1是本发明实施例1样本的基峰色谱图(BPI图)。
图2是本发明实施例2样本的基峰色谱图(BPI图)。
图3是本发明实施例3样本的基峰色谱图(BPI图)。
图4是本发明实施例4样本的基峰色谱图(BPI图)。
图5是本发明实施例4所有组样本的主成分分析PCA得分图。
图6是本发明实施例4采用PLS-DA对所有样本的分析得分图。
图7是本发明实施例4采用OPLS-DA对两组样本的分析得分图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1
1.1样本基本信息
有机液态奶和普通液态奶均为某地大型超市零售，超高温瞬时灭菌利乐砖包装，产地为内蒙古呼和浩特，季节均取样于2016年夏季，每个批次取6个平行样本，共计120个样本。
表1：液态奶样本
注：普通牛奶中，品牌A样本标记为M，品牌B标记为T，品牌C标记为Y。有机牛奶中，品牌B标记为TY，品牌C标记为J。
1.2样本制备
采用物理方法结合化学方法对样本进行预处理，以获得液态奶亲水性代谢提取物。取-80℃冷冻储存的样本，置于室温下解冻至室温。取100ul牛奶置于离心管中，加入400ul预冷却的色谱级甲醇(比例为1:4)，涡旋震荡30s，静置20min；取出4℃下14000转/min离心15分钟，沉淀蛋白；取上清液，氮吹干燥，用0.1wt％的甲酸水溶液复溶，定容至1ml。经0.22um滤膜过滤，得到滤液。
1.3UPLC-QTOF-MS分析
本实验的仪器分析平台为UPLC-QTOF-MS(Waters，UPLC.Xevo G2-XS QTof)。分离色谱柱采用HSS T3色谱柱(2.1*100mm,1.8μm，Waters，USA)。色谱分离条件为：柱温保持40℃，进样量为5μL，流速为0.50mL/min，样品室温度为6℃。流动相A为0.1wt％甲酸水溶液，流动相B为纯乙腈。采用梯度方式洗脱样品。
表2梯度洗脱程序
时间 流速(ml/min) A(体积百分比) B(体积百分比)
0 0.5 99 1
10 0.5 5 95
12 0.5 5 95
13 0.5 1 99
13.1 0.5 99 1
15 0.5 99 1
质谱条件：电喷雾离子化，采用ESI+模式检测。毛细管电压1.0KV，锥孔电压30.0V，锥孔气流速50L/h，源温度150℃，雾化气温度550℃，雾化气流速1000L/h。以MSE为采集模式，低碰撞能量4eV，高碰撞能量10-50eV，采集质量范围50-1200m/z。应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771Da。
1.4数据处理
采用waters组学分析软件Progenesis QI软件进行原始数据导入，峰对齐，峰提取，去卷积等，得到具有统计学意义的主成分分析(PCA)，导入Ezinfo进行多元统计分析，进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)，并结合VIP值和p值找出差异显著的化合物。
实施例2
1.1样本基本信息
同实施例1中1.1。
1.2样本制备
同实施例1中1.2。
1.3UPLC-QTOF-MS分析
本实验的仪器分析平台为UPLC-QTOF-MS(Waters，UPLC.Xevo G2-XS QTof)。分离色谱柱采用HILIC色谱柱(2.1*100mm,2.5μm，Waters，USA)。色谱分离条件为：柱温保持40℃，进样量为5μL，流速为0.40mL/min，样品室温度为6℃。流动相A为含10mmol/L乙酸铵的0.1wt％甲酸水溶液；流动相B为乙腈。采用梯度方式洗脱样品。
表3梯度洗脱程序
时间 流速(ml/min) A(％) B(％)
0 0.5 99 1
1 0.5 5 95
15 0.5 5 95
17 0.5 1 99
20 0.5 99 1
质谱条件与实施例1相同。
1.4数据处理
同实施例1中1.4。
实施例3
1.1样本基本信息
同实施例1中1.1。
1.2样本制备
同实施例1中1.2。
1.3UPLC-QTOF-MS分析
本实验的仪器分析平台为UPLC-QTOF-MS(Waters，UPLC.Xevo G2-XS QTof)。分离色谱柱采用BEH C18色谱柱(2.1*50mm,2.5μm，Waters，USA)。色谱分离条件为：柱温保持40℃，进样量为5μL，流速为0.50mL/min，样品室温度为6℃。流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为纯乙腈。采用梯度方式洗脱样品。梯度洗脱程序及质谱条件同实施例2中1.3。
1.4数据处理
同实施例1中1.4。
实施例4
1.1样本基本信息
同实施例1中1.1。
1.2样本制备
采用物理方法结合化学方法对样本进行预处理，以获得液态奶亲水性代谢提取物。取-80℃冷冻储存的样本，置于室温下解冻至室温，置于超声仪中超声15分钟进行反乳化作用，破坏牛奶样本的稳定性。于4℃下4000转/min离心20分钟，去除上层的脂肪层；再次离心剩余清液，使观察到的所有脂肪层被去除。取上述脱脂牛奶0.5ml，置于离心管中，加入1.5ml预冷却的色谱级甲醇(比例为1:3)，涡旋震荡30s，静置20min；取出4℃下14000转/min离心15分钟，沉淀蛋白；取500μL上清液，经0.22um滤膜过滤，得到滤液。
1.3UPLC-QTOF-MS分析
同实施例1中1.3。
1.4数据处理
同实施例1中1.4。
试验例1
依据实施例1～4进行液态奶亲水性代谢提取物非靶向检测，并将不同BPI图进行比较。结果见图1-4。
由图1-4可知，实施例4效果最为理想。制备所得的液态奶亲水性代谢提取物偏极性，当使用HSS T3色谱柱时，对极性化合物有较好的分离效果。使用BEH C18柱进行测定时，背景峰较多，而使用HILIC色谱柱时，20分钟的梯度洗脱，但集中在前4分钟出峰，代谢物流出太快，重叠较多。而针对样本制备方法，当对液态奶进行脱脂处理后，提取峰反而增多，化合物种类更丰富，可能是去脂之后，去除了脂肪的影响，减少了基质效应，并且脂肪结合型物质被释放出来，提高了更广的非脂类代谢物的覆盖度。
试验例2
依据实施例4进行液态奶亲水性代谢提取物非靶向检测，并对检测结果进行数据处理。结果见图5-7。
2.1主成分分析(PCA)
主成分分析作为无监督的学习方法，可以真实反映样本的聚类情况。对两组样本正离子模式下进行PCA分析，R2X＝93％，模型较可靠。PCA得分图如图5，可看出所有样本均在95％置信区间，并且有机牛奶组样本均处于右侧，大部分普通牛奶组处于左侧。
2.2偏最小二乘判别分析(PLS-DA)
进一步采用有监督的方法PLS-DA对五个品牌牛奶样本进行建模分析，模型的参数R2Y表示模型的解释程度，Q2表示模型的预测率。结果R2Y＝96％，Q2＝95％，PLS-DA得分图如图6，有明显的组间分类趋势。
2.3正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)
将品牌分为有机和普通两组，采用有监督的方法OPLS-DA进行建模分析，R2Y＝96％，Q2＝95％，得分图如图7所示。通过OPLS-DA分析，两组样本在正离子模式下能够得到很好地分离，所有的有机牛奶均处于主成分1的左侧，而普通牛奶组处于主成分1的右侧。结合OPLS-DA模型的VIP值和t检验的p值，寻找两组之间的差异显著具有重要贡献的变量(代谢物)，并利用自建的牛奶数据库进行初步鉴定。
2.4两组之间差异性代谢物的挖掘及鉴定
采用OPLS-DA模型的VIP值(VIP>1)和t检验的p值(p<0.05)来寻找差异性代谢物。定性方法为搜索自建牛奶数据库。牛奶数据库建立方法为搜集文献中牛奶相关代谢物，在chemspider中下载该代谢物的mol文件，录入Progenesis SDF Studio软件，整理成数据库，mol文件包含有代谢物的质荷比m/z值及二级质谱碎片。
差异性代谢物数据如表4所示：
表4差异性代谢物鉴定结果
本发明通过对液态奶样本进行非靶向检测分析，采用所有样本中物质的峰强度进行PCA分析，成功对所有组样本进行建模。5组牛奶之间存在显著性差异，且有机液态奶与普通液态奶之间区分明显。
在此基础上，对各组样本进行有监督模式的统计分析，包括PLS-DA和OPLS-DA，采用OPLS-DA模型的VIP值(VIP>1)和学生氏t检验的p值(p<0.05)来寻找差异性代谢物。可知有机液态奶与常规液态奶的差异代谢物主要归属于小分子有机酸、氨基酸类、磷脂以及小分子糖类等物质。

Claims (8)

1.一种有机液态奶的鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
1)样品提取：将待测样品用醇溶液进行震荡提取，提取液氮气吹干后用甲酸水溶液复溶，然后经0.22um滤膜过滤；
2)UPLC-MS检测：将滤液经色谱分离并采用质谱检测分析，得到样本的原始代谢图谱，其中，色谱分离采用的是HSS T3色谱柱，流动相是甲酸水溶液与乙腈，采用梯度洗脱；
3)对原始代谢图谱进行分析，从而鉴别有机液态奶。
2.如权利要求1所述的有机液态奶的鉴别方法，其特征在于：所述待测样品在提取前还有进行脱脂处理的步骤。
3.如权利要求2所述的有机液态奶的鉴别方法，其特征在于：所述脱脂处理的方法是先将待测样品进行超声破乳，然后离心脱脂。
4.如权利要求1所述的有机液态奶的鉴别方法，其特征在于：所述醇溶液为甲醇。
5.如权利要求1所述的有机液态奶的鉴别方法，其特征在于：所述甲酸水溶液的质量浓度为0.1％。
6.如权利要求5所述的有机液态奶的鉴别方法，其特征在于：所述梯度洗脱的程序、流速及流动相中各成分的体积百分比为：
7.如权利要求1所述的有机液态奶的鉴别方法，其特征在于：所述质谱检测的条件是：电喷雾离子化，采用ESI+模式检测，毛细管电压1.0KV，锥孔电压30.0V，锥孔气流速50L/h，源温度150℃，雾化气温度550℃，雾化气流速1000L/h，以MSE为采集模式，低碰撞能量4eV，高碰撞能量10-50eV，采集质量范围50-1200m/z，应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771Da。
8.如权利要求1所述的有机液态奶的鉴别方法，其特征在于：步骤3)中，将样本的原始代谢图谱采用Progenesis QI软件导入，进行峰对齐，峰提取，去卷积预处理，再对导出的数据依次进行PCA、PLS-DA、OPLS-DA模式识别方法分析，建立多维统计模型，可视化地显示有机液态奶与普通牛奶的代谢谱差异，并采用模型的VIP值，结合学生氏t检验的p值筛选获得差异代谢物，并对这些物质进行初步鉴定。
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