CN111830183A - 一种山羊奶产地的非靶向脂质组鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种山羊奶产地的非靶向脂质组鉴别方法，包括以下步骤：S1.样品采集；S2.样品前处理；S3.分析样品的脂质组成获得脂质组成数据；S4.将获得的脂质组成数据进行多变量统计分析处理；S5.建立Fisher模型获得不同产地的山羊奶的特征性脂质组成；S6.利用差异脂质组成区分不同产地的山羊奶。采用本发明方法共计鉴定到15种脂质亚类和756个脂质分子，其中，5种脂质亚类和51种脂质分子在不同产地间存在显著差异，基于以上潜在指标建立的山羊奶产地进行逐步判别分析，筛选出6种脂质分子并建立判别模型，模型的初始及交叉验证正确判别率均为100％。
Description
技术领域
本发明涉及山羊奶产地的鉴别方法，尤其涉及一种山羊奶产地的非靶向脂质组鉴别方法，属于山羊奶产地的鉴别领域。
背景技术
山羊奶是中国的传统特色奶。中国是世界上重要的养羊大国，也是世界奶山羊饲养数量最多的国家之一。2017年，中国山羊奶产量已达23.8万吨，奶山羊数量已超129万头。中国具有悠久的奶山羊繁育历史。相比于同等条件下生产的牛奶，山羊奶含有更高含量的短链、中链脂肪酸、不饱和脂肪酸、ω-6FA,ω-3FA、DHA和EPA。截至目前，中国已有几个著名的奶山羊繁育区，如陕西富平、山东崂山等。然而，受经济利益的驱使，一些非原产地的奶制品生产商冒充地理标志山羊奶，损害了消费者利益。开展山羊奶产地鉴别工作，可为原料奶的产地真实性鉴别提供参考。
近年来，鉴别食品产地的技术不断被报道，包括稳定同位素、矿质元素、近红外等指纹分析技术。而快速发展的脂质组学，作为代谢组学的分支，可快速、全面地识别生物体内脂质组成特征，从组学层面揭示脂质受各种因素影响下的变化规律。Mi等(2018)建立了脂质组学鉴别鸡肉产地的方法。然而，基于脂质组学鉴别奶类不同产地的研究还未见报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种山羊奶产地的非靶向脂质组鉴别方法。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供一种山羊奶产地的非靶向脂质组鉴别方法，包括以下步骤：
S1.样品采集；
S2.样品前处理；
S3.分析样品的脂质组成获得脂质组成数据；
S4.将获得的脂质组成数据进行多变量统计分析处理；
S5.建立Fisher模型获得不同产地的山羊奶的特征性脂质组成；
S6.利用差异脂质组成区分不同产地的山羊奶。
作为本发明进一步的改进，步骤S2中所述样品前处理的方法包括：将山羊奶样品与纯水和混合有机溶剂混合均匀后离心；取下层的有机溶液吹干，备用。
作为本发明进一步的改进，所述山羊奶样品:超纯水:混合有机溶剂的体积比为1:5:15；所述混合有机溶剂由氯仿和甲醇按体积比2:1组成。
作为本发明进一步的改进，步骤S3中所述分析样品的脂质组成的方法为高效液相色谱和质谱联用。
作为本发明进一步的改进，所述高效液相色谱的鉴定的方法为：将前处理后的山羊奶样品溶解于HPLC级水中，然后加入HPLC级乙腈来制备流动相A，流动相B为乙腈和异丙醇按体积比1:9混合得到，洗脱梯度如下：0min，37％B；1.5min，52％；8min，58％；11min，66％；14min，70％；18min，75％；20min，98％；22min，98％；22.1min，37％；25min，37％。
作为本发明进一步的改进，所述高效液相色谱鉴别采用正、负离子两种模式进行数据采集，正离子模式色谱柱选用Waters公司的CORTECS C18 100×2.1mm 2.7μm色谱柱，负离子模式色谱柱选用XSelect CSH C18 100×2.1mm 2.5μm色谱柱。
作为本发明进一步的改进，所述质谱鉴别的主要参数为：喷雾电压：正电压为3.2kV，负电压为2.8kV；毛细管温度：320℃；辅助气体流速：10arb；质量范围：正离子为240-2000m/z，负离子为200-2000m/z。
作为本发明进一步的改进，步骤S4中所述多变量统计方法如下：利用软件Xcalibur对峰面积进行识别、归一化处理，采用SPSS软件进行单因素方差分析，通过Duncan检验筛选在不同产地存在显著差异的脂质，采用在线软件MetaboAnalyst对数据进行主成分分析及偏最小判别分析。
作为本发明进一步的改进，步骤S5中基于756种脂质分子中既满足在地域间存在显著差异(P<0.05)又满足偏最小判别分析VIP值大于1的条件而得到38种脂质分子，对38种脂质分子进行逐步线性判别分析，得到6种脂质分子；
这6个脂质分子分别为：
PI(18:1_18:1)-H，
TG(6:0_10:0_17:1)+NH4，
TG(11:0_18:1_18:2)+NH，
TG(10:0_18:2_20:5)+H，
TG(16:1_18:1_18:2)+NH4，
TG(16:1_10:0_10:0)+NH4；
筛选出对地域判别有效的变量，剔除不必要的干扰变量，建立Fisher判别模型；6个脂质分子被依次引入Fisher判别模型；
所述的Fisher模型如下：
Y云南＝-8.484E-8PI20+3.61E-7TG30+6.470E-7TG179–7.629E-7TG184+1.560E-7TG334+1.684E-8TG394–28.684
Y陕西＝1.047E-6PI20+2.274E-6TG30–1.057E-6TG179+2.342E-6TG184–4.173E-8TG334+3.725E-8TG394–60.500
Y山东＝1.639E-6PI20+6.771E-6TG30–5.335E-7TG179+5.442E-7TG184–1.447E-8TG334+2.895E-8TG394–54.467
其中，PI20代表PI(18:1_18:1)-H，TG30代表TG(6:0_10:0_17:1)+NH4，TG179代表TG(11:0_18:1_18:2)+NH4，TG184代表TG(10:0_18:2_20:5)+H，TG334代表TG(16:1_18:1_18:2)+NH4，TG394代表TG(16:1_10:0_10:0)+NH4。
所述山羊奶产地包括山东、云南或陕西地区的山羊奶产地。
采用本发明方法共计鉴定到15种脂质亚类和756个脂质分子。其中，共计5种脂质亚类和51种脂质分子在不同产地间存在显著差异。利用偏最小二乘判别分析，发现VIP值大于1的脂质分子共计259种。综合满足P<0.05和VIP>1的评价标准，发现38种脂质分子可作为鉴别山羊奶产地的潜在指标。基于以上潜在指标建立的山羊奶产地进行逐步判别分析，筛选出6种脂质分子并建立判别模型，模型的初始及交叉验证正确判别率均为100％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同产地山羊奶偏最小二乘判别分析图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1山羊奶产地的非靶向脂质组鉴别方法的建立及应用
S1.样品采集；
以山羊奶主产区为主，采集了陕西省杨凌区、山东省青岛以及云南省陆良县3个养殖场的31份成熟期山羊奶样品。
S2.样品前处理；
将山羊奶样品与纯水和混合有机溶剂混合均匀后离心；取下层的有机溶液吹干，备用。所述山羊奶样品:超纯水:混合有机溶剂的体积比为1:5:15；所述混合有机溶剂由氯仿和甲醇按体积比2:1组成。
S3.分析样品的脂质组成获得脂质组成数据；
所有样品在清华代谢组平台测定。通过Thermo Fisher公司的UPLC-Q-ExtractiveOrbitrap Mass进行检测，HPLC和MS主要参数如下。
(1)HPLC方法主要参数
采用正、负离子两种模式进行数据采集，正离子模式色谱柱选用Waters公司的CORTECS C18 100×2.1mm 2.7μm色谱柱，负离子模式色谱柱选用XSelect CSH C18 100×2.1mm 2.5μm。将0.77g乙酸铵溶解于400ml HPLC级水中，然后加入HPLC级乙腈来制备流动相A。通过将100ml乙腈与900ml异丙醇混合制备流动相B。洗脱梯度如下：0min，37％B；1.5min，52％；8min，58％；11min，66％；14min，70％；18min，75％；20min，98％；22min，98％；22.1min，37％；25min，37％。
(2)MS方法主要参数
脂质的MS分析在Q-Exactive Orbitrap上进行。参数如下：喷雾电压，正电压为3.2kV，负电压为2.8kV；毛细管温度，320℃；辅助气体流速(arb)，10；质量范围(m/z)，正离子为240-2000，负离子为200-2000。
S4.将获得的脂质组成数据进行多变量统计分析处理；
利用软件Xcalibur3.2.63(Thermo Fisher，USA)对峰面积进行识别、归一化处理。采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，通过Duncan检验筛选在不同产地存在显著差异的脂质，采用在线软件MetaboAnalyst 4.0对数据进行主成分分析(PCA)及偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。
S5.建立LDA模型获得不同产地的山羊奶的特征性脂质组成；
基于756种脂质分子中既满足在地域间存在显著差异(P<0.05)又满足偏最小判别分析VIP值大于1的条件而得到38种脂质分子，对38种脂质分子进行逐步线性判别分析，得到6种脂质分子，分别为PI(18:1_18:1)-H，TG(6:0_10:0_17:1)+NH4，TG(11:0_18:1_18:2)+NH4，TG(10:0_18:2_20:5)+H，TG(16:1_18:1_18:2)+NH4和TG(16:1_10:0_10:0)+NH4；筛选出对地域判别有效的变量，剔除不必要的干扰变量，建立判别模型。6个脂质分子被依次引入Fisher判别模型，得到了判别函数的系数和常量值，进一步得到每个地域的判别模型；
采用“留一法”对建立的判别模型进行回代检验和交叉验证。结果表明，判别模型初始判别率为100％，交叉验证正确判别率也达到100％。
利用6种脂质分子建立Fisher判别模型如下：
Y云南＝-8.484E-8PI20+3.61E-7TG30+6.470E-7TG179–7.629E-7TG184+1.560E-7TG334+1.684E-8TG394–28.684
Y陕西＝1.047E-6PI20+2.274E-6TG30–1.057E-6TG179+2.342E-6TG184–4.173E-8TG334+3.725E-8TG394–60.500
Y山东＝1.639E-6PI20+6.771E-6TG30–5.335E-7TG179+5.442E-7TG184–1.447E-8TG334+2.895E-8TG394–54.467
其中，PI20代表PI(18:1_18:1)-H，TG30代表TG(6:0_10:0_17:1)+NH4，TG179代表TG(11:0_18:1_18:2)+NH4，TG184代表TG(10:0_18:2_20:5)+H，TG334代表TG(16:1_18:1_18:2)+NH4，TG394代表TG(16:1_10:0_10:0)+NH4。
表1不同山羊奶产地样品的线性判别分析
由图1可知，不同产地的山羊奶偏最小二乘判别落入不同的圆内。
S6.利用差异脂质组成区分不同产地的山羊奶。
将未知产地山羊奶进行检测后数值带入本发明建立的Fisher模型中，判断其产地信息，准确率100％。
该未知产地山羊奶产自山东、云南或陕西地区的山羊奶产地。
与现有技术相比，采用本发明方法共计鉴定到15种脂质亚类和756个脂质分子。其中，共计5种脂质亚类和51种脂质分子在不同产地间存在显著差异。利用偏最小二乘判别分析，发现VIP值大于1的脂质分子共计259种。综合满足P<0.05和VIP>1的评价标准，发现38种脂质分子可作为鉴别山羊奶产地的潜在指标。基于以上潜在指标建立的山羊奶产地进行逐步判别分析，筛选出6种脂质分子并建立判别模型，模型的初始及交叉验证正确判别率均为100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种山羊奶产地的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.样品采集；
S2.样品前处理；
S3.分析样品的脂质组成获得脂质组成数据；
S4.将获得的脂质组成数据进行多变量统计分析处理；
S5.建立Fisher模型获得不同产地的山羊奶的特征性脂质组成；
S6.利用差异脂质组成区分不同产地的山羊奶。
2.根据权利要求1所述的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，步骤S2中所述样品前处理的具体方法如下：将山羊奶样品与纯水和混合有机溶剂混合均匀后离心；取下层的有机溶液吹干，备用。
3.根据权利要求2所述的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，所述山羊奶样品:超纯水:混合有机溶剂的体积比为1:5:15；所述混合有机溶剂由氯仿和甲醇按体积比2:1组成。
4.根据权利要求1所述的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，步骤S3中所述分析样品的脂质组成的方法为高效液相色谱和质谱联用。
5.根据权利要求4所述的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，所述高效液相色谱的鉴定的方法为：将前处理后的山羊奶样品溶解于HPLC级水中，然后加入HPLC级乙腈来制备流动相A，流动相B为乙腈和异丙醇按体积比1:9混合得到，洗脱梯度如下：0min，37％B；1.5min，52％；8min，58％；11min，66％；14min，70％；18min，75％；20min，98％；22min，98％；22.1min，37％；25min，37％。
6.根据权利要求4所述的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，所述高效液相色谱鉴别采用正、负离子两种模式进行数据采集，正离子模式色谱柱是CORTECS C18 100×2.1mm2.7μm色谱柱，负离子模式色谱柱是XSelect CSH C18 100×2.1mm 2.5μm色谱柱。
7.根据权利要求4所述的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，所述质谱鉴别的主要参数为：喷雾电压：正电压为3.2kV，负电压为2.8kV；毛细管温度：320℃；辅助气体流速：10arb；质量范围：正离子为240-2000m/z，负离子为200-2000m/z。
8.根据权利要求4所述的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，步骤S4中所述多变量统计方法如下：利用软件Xcalibur对峰面积进行识别、归一化处理，采用SPSS软件进行单因素方差分析，通过Duncan检验筛选在不同产地存在显著差异的脂质，采用在线软件MetaboAnalyst对数据进行主成分分析及偏最小二乘判别分析。
9.根据权利要求4所述的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，步骤S5中所述的Fisher模型如下：
Y云南＝-8.484E-8PI20+3.61E-7TG30+6.470E-7TG179–7.629E-7TG184+1.560E-7TG334+1.684E-8TG394–28.684
Y陕西＝1.047E-6PI20+2.274E-6TG30–1.057E-6TG179+2.342E-6TG184–4.173E-8TG334+3.725E-8TG394–60.500
Y山东＝1.639E-6PI20+6.771E-6TG30–5.335E-7TG179+5.442E-7TG184–1.447E-8TG334+2.895E-8TG394–54.467
其中，PI20代表PI(18:1_18:1)-H，TG30代表TG(6:0_10:0_17:1)+NH4，TG179代表TG(11:0_18:1_18:2)+NH4，TG184代表TG(10:0_18:2_20:5)+H，TG334代表TG(16:1_18:1_18:2)+NH4，TG394代表TG(16:1_10:0_10:0)+NH4。
10.根据权利要求1-9任一项所述的非靶向脂质组鉴别方法，其特征在于，所述山羊奶产地包括山东、云南或陕西地区的山羊奶产地。
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