CN112858558A - 一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，属于乳制品检测技术领域。包括：采用MTBE法对生牛乳和生羊乳进行分离提取，得到脂质成分；采用液相色谱分离结合高分辨质谱鉴定对所得脂质成分进行一级和二级数据轮廓采集，得到脂质成分的原始轮廓信息，然后进行格式转化后和校正处理得到脂质成分的平行分析数据信息，将所得平行分析数据信息与脂质结构数据库进行鉴定得到脂质成分的脂质分子矩阵；对所得脂质分子矩阵进行差异分析和多变量统计分析，筛选得到用于羊乳掺伪的脂质生物标志物进行定量分析结果，用于待鉴别样品检测，实现牛羊乳掺伪鉴别。本发明具有可重复、快速高效、高灵敏和低成本分析的优点，完善了牛羊乳掺伪检测技术体系。
Description
技术领域
本发明属于乳制品检测技术领域，涉及一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法。
背景技术
羊乳因其低致敏性和高可消化性，可提供婴幼儿健康生长所需的大部分各种营养物质，从而被认为是一种高品质的乳源。但目前由于羊乳制品需求增加以及供应全球化，出现在羊乳制品中掺入同源性更高的动物源性产品的现象，其中最常见的是掺入低价值牛乳来降低生产成本。这很大程度上影响了羊乳行业的健康发展，也增加了婴幼儿及成人的过敏风险。因此，建立一种牛羊乳掺伪鉴别方法对维护消费者的合法权益和支持羊乳产业健康发展具有重要意义。
因大部分的掺伪行为采取的是在羊乳制品中掺入同源性更高的牛乳，这使得牛羊乳的掺伪鉴别难以鉴定。且目前鉴别牛羊乳品质的方法无论是传统的理化检验方法还是基于现代仪器分析的检测方法，都在代谢物水平、脂肪水平和蛋白水平。基于不同差异及不同检测水平，发展了不同的检测方法。主要包括：采用荧光光谱方法对牛羊乳维生素及氨基酸差异进行检测；采用色谱及色谱-质谱联用方法对牛羊乳脂肪酸的组成差异进行检测；采用质谱、电泳、酶联免疫法对蛋白质分子的构成差异进行检测。其中，传统的脂质提取分离法(Folch法)需要使用毒性较高的生物试剂，且原料的消耗量大，检测耗时长。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，该方法可用于生牛乳和生羊乳掺伪鉴别的可重复、快速高效、高灵敏和低成本分析，有助于更好地完善羊乳和牛乳质量检测技术体系，保障乳制品市场规范性。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，包括以下步骤：1)采用MTBE法，对乳样进行分离提取，得到乳样中的脂质成分；其中，乳样包括生牛乳和生羊乳；2)采用液相色谱分离结合高分辨质谱鉴定，对步骤1)所得脂质成分进行一级数据轮廓采集和二级数据轮廓采集，得到脂质成分的原始轮廓信息；3)对步骤2)所得脂质成分的原始轮廓信息进行格式转化后和校正处理，得到脂质成分的平行分析数据信息；将所得平行分析数据信息与脂质结构数据库进行鉴定，得到脂质成分的脂质分子矩阵；4)对步骤3)所得脂质分子矩阵进行差异分析和多变量统计分析，筛选得到用于羊乳掺伪的脂质生物标志物；5)将步骤4)所得用于羊乳掺伪的脂质生物标志物进行定量分析，用于待鉴别样品检测，实现牛羊乳掺伪鉴别。
优选地，步骤1)中，采用MTBE法进行分离提取，具体包括以下操作：①将乳样均匀分散于水中，得到混合体系A，向所得混合体系中加入体积比为1:5的甲醇/甲基叔丁基醚混合液后超声混合，得到混合体系B，向所得混合体系B中加入d7-TG，得到混合体系C；②将步骤①所得混合体系C经涡旋振荡后进行超声混合处理，得到混合体系D，将所得混合体系D经冷冻离心留取上清液A；③向步骤②所得上清液A中加入体积比为1:5的甲醇/甲基叔丁基醚混合液后重复步骤②两次，收集得到上清液B；将所得上清液B经氮吹干后得到乳样中的脂质成分，将所得乳样中的脂质成分与体积比为1:3的甲醇/二氯甲烷混合溶液复溶，得到用于步骤2)进行液相色谱分离结合高分辨质谱鉴定的待测样品。
进一步优选地，步骤①中，乳样、水、甲醇/甲基叔丁基醚混合液和d7-TG的体积比为50～60：250～300：700～1000：15；步骤②中，涡旋振荡3～10min，超声混合处理10～20min，在4000～4500r/min下冷冻离心15～25min；步骤②中，上清液A、甲醇/甲基叔丁基醚混合液和甲醇/二氯甲烷混合溶液的体积比为300～500：300～500：80～100。
优选地，步骤2)中，液相色谱分离的检测条件为：在0～10min，55％洗脱流动相A；10～13.8min，10％洗脱流动相A；13.8～20min，55％洗脱流动相A的条件下，以250～300μL/min的流速对步骤1)所得脂质成分进行洗脱；其中，采用AcclaimTM Trinity P2
Column色谱柱；其中，洗脱流动相A为6～10mmol/L醋酸铵+65％乙腈+35％H2O，流动相B为6～10mmol/L醋酸铵+15％乙腈+85％异丙醇。
优选地，步骤2)中，高分辨质谱的检测条件为：高分辨质谱的质谱仪器基于数据靶向扫描采集进行一级数据信息点和二级数据信息点采集；在每个数据信息点采集的循环中，对强度最高的前20个分子离子对应的二级数据信息点的质谱信息点进行数据采集；碰撞能为35eV，45eV和55eV；高分辨质谱所采用加热电喷雾离子源的参数设置如下：雾化气压：50～55Pa；辅助气压：20～25Pa；气帘气压：8～10Pa，温度：400～500℃；喷雾电压：+3000～4000V；负模式参数设置如下：雾化气压：50～55Pa；辅助气压：20～25Pa；气帘气压：8～10Pa，温度：500～600℃；喷雾电压：-2800～3000V。
优选地，步骤3)中，格式转化的操作为对步骤2)所得脂质成分的原始轮廓信息转化为mzXML格式。
优选地，步骤3)中，校正处理的操作为保留时间校正、一级和二级峰识别、峰对齐处理。
优选地，步骤3)中，脂质结构数据库包括Lipid Bank、LIPIDMAPS、LIPIDAT、CyberLipids以及脂质组学相关数据库。
优选地，步骤4)中，差异分析为基于Fold change和T-test检验；筛选在生牛乳与生羊乳中具有显著差异的脂质分子。
优选地，步骤4)中，多变量统计分析为基于主成分分析和偏最小二乘判别分析的多变量统计模型建立。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，以生牛乳和生羊乳作为乳样，根据生牛乳与生羊乳中脂质分子的性质采用MTBE法提取脂质成分，使用高分辨质谱鉴定和脂质结构数据库对鉴定脂质分子进行统计学差异分析，筛选出的生物标志物可用于牛羊乳的掺伪鉴别。相较于代谢物掺伪分析，本发明建立的基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法不需要前处理对待鉴别样品进行衍生化处理，操作更简便，快速，且脂质分子相比代谢物更稳定和可检测；相较于蛋白质掺伪分析，本发明建立的掺伪鉴别方法不需要酶解处理，试剂使用量小且前处理简单省时，快速，可以很好的用于牛羊乳掺伪鉴别。
进一步地，通过采用MTBE法进行分离提取，使得操作更简便，快速，在较大程度上完全提取待检测乳样中的脂质分子，保证了后期建模数据完整性与分析可靠性。
进一步地，通过液相色谱分离，对待检测乳样中的脂质分子进行高效率的分离，使得脂质化合物分次进入质谱，这也提高了质谱离子化的效率。
进一步地，使用数据靶向扫描采集和脂质结构数据库对鉴定脂质分子进行统计学差异分析，能够得到脂质目标物较多的二级碎片，增加了数据的丰富程度和可用性。同时统计学差异分析能够可视化所鉴定的脂质成分的峰面积差异及不同样品的脂质组成差异，通过模型最终的得分图直观分析生牛乳和生羊乳在脂质轮廓组成上的差异，减少了分析耗时，更快速简便得到显著影响组成的脂质化合物。
进一步地，通过以Lipid Bank、LIPIDMAPS、LIPIDAT、Cyber Lipids以及脂质组学相关数据库此类脂质组学相关的公共资源作为脂质结构数据库，能够提高鉴定准确度，且使所述基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法具有普适性。
进一步地，通过基于Fold change和T-test检验进行差异分析，能够有效筛选在生牛乳与生羊乳中具有显著差异的脂质分子。
附图说明
图1为原始脂质成分信息处理后轮廓分布图；其中，(A)为处理前峰值响应，(B)为处理后峰值响应；
图2为建立的主成分分析和偏最小二乘判别分析的多变量统计模型；其中，(A)为主成分分析图，(B)为偏最小二乘判别分析图；
图3为偏最小二乘判别模型的VIP图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本发明所述一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，包括以下步骤：
1)收集生牛乳样品与生羊乳样品作为待检测的乳样，采用MTBE法从生牛乳样品与生羊乳样品中分离提取脂质成分；
2)采用液相色谱分离结合高分辨质谱鉴定，在正负模式切换扫描下对步骤1)提取得到的脂质成分进行一级数据轮廓采集、二级数据轮廓采集，得到脂质成分的原始轮廓信息；
3)将步骤2)所得脂质成分的原始轮廓信息格式转化，进行保留时间校正、一级峰识别和二级峰识别、峰对齐等校正处理，得到脂质成分的原始轮廓信息。使用基于R程序包、XCMS软件及脂质结构信息的脂质结构数据库进行鉴定，得到脂质成分的脂质分子矩阵；
4)对步骤3)鉴定得到的脂质分子矩阵进行差异分析和多变量统计分析，筛选得到用于羊乳掺伪的生物标志物；
5)对筛查结果进行方法建立，将步骤4)所得用于羊乳掺伪的生物标志物的定量分析结果，用于检测未知待鉴别样品，实现牛羊乳掺伪鉴别，确证方法可行。
在步骤1)中，所述的代表性生牛乳与生羊乳样品是从不同养殖场收集的乳样，在1～5小时内运送回实验室，进行脂质提取，得到乳样中的脂质成分。
具体地，取50～60μL乳样样品，加入250～300μL超纯水，加700～1000μL的1:5的甲醇/甲基叔丁基醚超声混合后，再加入d7-TG(15:0/18:1/15:0)；涡旋振荡3～10min，超声混合处理10～20min；在4000～4500r/min下冷冻离心15～25min，取上清液300～500μL；重新加入300～500μL甲醇/甲基叔丁基醚，重复提取两次后(涡旋振荡3～10min，超声混合处理10～20min；在4000～4500r/min下冷冻离心15～25min，取上清液300～500μL；重新加入300～500μL甲醇/甲基叔丁基醚)，合并三次提取的上清液，氮吹至近干；吹干后样品用80～100μL的1:3的甲醇/二氯甲烷混合溶液复溶；吸取40～60μL于1.5mL棕色进样小瓶，进行液相色谱分离结合高分辨质谱鉴定分析。
在步骤2)中，液相分离采用AcclaimTM Trinity P2
Column(10x2.1mm，3μm)色谱柱，洗脱流动相A为6～10mmol/L醋酸铵+65％乙腈+35％H2O，流动相B为6～10mmol/L醋酸铵+15％乙腈+85％异丙醇，在0～10min，55％洗脱流动相A；10～13.8min，10％洗脱流动相A；13.8～20min，55％洗脱流动相A的条件下，以250～300μL/min的流速对2～5μL提取的脂质成分进行洗脱。
在步骤2)中，高分辨质谱的质谱仪器在TraceFinder软件的控制下基于数据靶向扫描的功能进行一级数据信息点、二级数据信息点采集。在每个数据信息点采集的循环中，对强度最高的前20个分子离子对应的二级数据信息点的质谱信息点进行数据采集。采用三个系列增加的碰撞能，碰撞能为35eV，45eV和55eV。高分辨质谱所采用加热电喷雾离子源的参数设置如下：雾化气压：50～55Pa；辅助气压：20～25Pa；气帘气压：8～10Pa，温度：400～500℃；喷雾电压：+3000～4000V；负模式参数设置如下：雾化气压：50～55Pa；辅助气压：20～25Pa；气帘气压：8～10Pa，温度：500～600℃；喷雾电压：-2800～3000V。
在步骤3)中，将步骤2)中采集得到的脂质成分的原始轮廓信息格式使用ProteoWizard软件转化为mzXML格式，使用XCMS软件去除来自液相分离缓冲液和提取溶剂的化学噪声，以及来自质谱检测器的电子噪音，使用迭代自调整窗口极小值法基于部分具有较小吸收强度的数据点作为保留时间的基线，通过调整拟合曲线上方的数值对所有数据点的保留时间基线进行校正。聚集同一脂质目标化合物产生信号模式所对应的高的电荷质量比和强度的同位素分子，在去除这些同位素分子后，可以减少原始脂质轮廓信息的冗余从而简化数据矩阵。目视检查所有平行分析的脂质样品的样品信息轮廓，检测峰值位移，对具有一致且可预测行为的峰值进行全局峰值偏移调整，将不同生牛乳和生羊乳的乳样样品中所有检测的二级质谱峰被对齐在一起，以便对所有平行分析的数据信息进行适当的比较。最后利用Lipid Bank、LIPIDMAPS、LIPIDAT和Cyber Lipids等脂质组学相关的公共资源进行脂质结构匹配，得到脂质成分的脂质分子矩阵。
在步骤4)中，使用基于Fold change和T-test检验对步骤3)得到的脂质分子矩阵进行差异分析，筛选在生牛乳与生羊乳样品中具有显著差异的脂质分子；再对步骤3)得到的脂质分子矩阵进行基于主成分分析和偏最小二乘判别分析的多变量统计模型建立，用以筛选可用两组乳样鉴别的脂质分析，在筛选的脂质分子中选择可用于羊乳掺伪的生物标志物，并对其进行定量。
在步骤5)中，根据步骤4的定量结果，使用用于羊乳掺伪的脂质生物标志物建立羊乳掺伪分析方法，，用于待鉴别样品检测，实现牛羊乳掺伪鉴别。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，通过检测盲样以检验本发明所述基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法的可行性。
一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，包括以下步骤：
1)采用MTBE法从生牛乳乳样与生羊乳乳样中分离提取脂质成分；
分别取50μL乳样样品，加入280μL超纯水，加800μL的1:5的甲醇/甲基叔丁基醚超声混合后，再加入含15μL 100ppm d7-TG(15:0/18:1/15:0)；涡旋振荡5min，超声混合处理15min；在4300r/min下冷冻离心20min，取上清液400μL；重新加入400μL甲基叔丁基醚，重复提取两次后(涡旋振荡5min，超声混合处理15min；在4300r/min下冷冻离心20min，取上清液400μL；重新加入400μL甲基叔丁基醚，再次涡旋振荡5min，超声混合处理15min；再次在4300r/min下冷冻离心20min，取上清液400μL)，合并三次提取的上清液，氮吹至近干；吹干后样品用80μL的1:3的甲醇/二氯甲烷混合溶液复溶；吸取50μL于1.5mL棕色进样小瓶，进行色谱质谱分析。其中，乳样分别为生牛乳乳样与生羊乳乳样。
2)采用液相色谱分离结合高分辨质谱鉴定，在正负模式切换扫描下对步骤1)提取得到的脂质成分进行一级数据轮廓采集、二级数据轮廓采集，得到脂质成分的原始轮廓信息；
具体地，液相分离采用AcclaimTM Trinity P2
Column(10×2.1mm，3μm)色谱柱，洗脱流动相A为6～10mmol/L醋酸铵+65％乙腈+35％H2O，流动相B为6～10mmol/L醋酸铵+15％乙腈+85％异丙醇，在0～10min，55％洗脱流动相A；10～13.8min，10％洗脱流动相A；13.8～20min，55％洗脱流动相A的条件下，以250μL/min的流速对3μL提取的脂质成分进行洗脱。质谱仪器在TraceFinder软件的控制下基于数据靶向扫描的功能进行一级数据轮廓采集、二级数据轮廓采集的数据信息点采集。在每个数据信息点采集的循环中，对强度最高的前20个分子离子对应的二级质谱信息点进行数据采集。碰撞能为三个系列增加的电压，为35eV，45eV和55eV。质谱所采用加热电喷雾离子源的正模式参数设置如下：雾化气压：55Pa；辅助气压：23Pa；气帘气压：10Pa，温度：450℃；喷雾电压：+3500V；负模式参数设置如下：雾化气压：55Pa；辅助气压：23Pa；气帘气压：10Pa，温度：550℃；喷雾电压：-3000V。
3)将步骤2)中采集得到的脂质成分的原始轮廓信息格式转化，进行保留时间校正、一级和二级峰识别、峰对齐等处理。使用基于R程序包、XCMS软件及脂质结构信息数据库进行鉴定；
具体地，将步骤2)中采集得到的脂质成分的原始轮廓信息格式使用ProteoWizard软件转化为mzXML格式，使用XCMS软件去除来自液相分离缓冲液和提取溶剂的化学噪声，以及来自质谱检测器的电子噪音，使用迭代自调整窗口极小值法基于部分具有较小吸收强度的数据点作为保留时间的基线，通过调整拟合曲线上方的数值对所有数据点的保留时间基线进行校正。聚集同一脂质目标化合物产生信号模式所对应的高的电荷质量比和强度的同位素分子，在去除这些同位素分子后，可以减少原始脂质轮廓信息的冗余从而简化数据矩阵。目视检查所有平行分析的脂质样品的样品信息轮廓，检测峰值位移，对具有一致且可预测行为的峰值进行全局峰值偏移调整，将不同生牛乳和生羊乳的乳样样品中所有检测的二级质谱峰被对齐在一起，以便对所有平行分析的数据信息进行适当的比较。在进行这些处理后，脂质分子峰值面积的盒形图和核密度图，可以看到在处理过后，脂质分子峰值呈高斯分布(图1)。
利用Lipid Bank、LIPIDMAPS、LIPIDAT和Cyber Lipids等脂质组学相关的公共资源进行脂质结构匹配，得到脂质成分的脂质分子矩阵。实验在生牛乳与生羊乳样品中分别检测出542和513种脂质分子，其中包括甘油三酯(TG)、神经酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)、磷脂酰胆碱(PC)、己糖苷神经酰胺(HexCer)、甘油二酯(DG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)。
4)对鉴定得到的数据矩阵进行差异分析和多变量统计分析，筛选可用于羊乳掺伪的生物标志物；
具体地，使用基于Fold change和T-test检验对步骤3)得到的脂质分子矩阵进行差异分析，以Fold change>2和Fold change<0.5，以及p值<0.05为阈值，筛选在生牛乳与生羊乳样品中具有显著差异的脂质分子，在正模式和负模式下共有49种脂质分子符合三个阈值条件，其中24种在羊乳中显著性上调，31种在羊乳中显著性下调。
再对步骤3得到的脂质分子矩阵进行基于主成分分析和偏最小二乘判别分析的多变量统计模型建立，用以筛选可用两组乳样鉴别的脂质分析。主成分分析图如图2A所示，PC1为70.4％，PC2为17.6％，前两个主成分可以解释数据的88％，可用于模型建立，该建立的模型说明生牛乳和生羊乳的因生物的物种差异导致脂质分子轮廓存在较大差异。建立偏最小二乘判别模型分析发现(如图2B)所示，component 1与component 2的总和为88％，说明component 1与component 2可用于偏最小二乘判别模型的建立，模型的R2X＝0.791，R2Y＝0.949，Q2＝0.968，这些参数表示建立的偏最小二乘判别模型归纳了PC1和PC2整体信息的79.1％，概括了因变量(X)共计94.9％的变异信息，预测能力即准确度为96.8％。其中R2Y的值在0.949-0.996之间，Q2参数大于0.706，表明建立的偏最小二乘判别模型可以很好的描述X的变异信息，并且具有很好的预测能力。
通过偏最小二乘判别模型的变量投影重要度(VIP)分析可知，共有15种脂质分子的VIP值大于1，其中四种在羊乳中含量高于牛乳，可用作潜在标志物用于区分生牛乳和生羊乳样品(图3)。也就是说在15种VIP值大于1的脂质分子标志物中，有四种脂质分子同时满足的Fold change>2，p值<0.05，VIP>1，包括7864(TG(8:0/10:0/18:1))，6545(TG(18:0/6:0/8:0))，5012(TG(6:0/10:0/10:0))，和10183(TG(18:1/18:2/18:2))，且这四种标志物都为甘油三酯。使用内标100ppm d7-TG(15:0/18:1/15:0)对样品中的TG进行定量，四种甘油三酯在生羊乳和生牛乳中的含量显示在表1。
表1四种甘油三酯在生羊乳和生牛乳中的含量
5)对筛查结果进行方法建立，检测未知样品，确证方法可行。
具体地，制备混合羊乳盲样12份，应用上述建立的方法，在经过脂质分子提取后，以TG(8:0/10:0/18:1)、TG(18:0/6:0/8:0)、TG(6:0/10:0/10:0)、和TG(18:1/18:2/18:2)为目标化合物进行靶向筛查，鉴定出在1个羊乳样品掺入牛乳，四种甘油三酯标志物的含量分别为10.73、4.58、1.84和1.76μg/mL。这个结果说明建立的羊乳掺伪鉴别方法可成功运用于羊乳产品的掺伪鉴别。
具体地，在本发明的上述实施例中，所用生牛乳和生羊乳由陕西省咸阳市的二十个山羊养殖场和陕西省咸阳市的二十个牛养殖场提供，生牛乳和生羊乳的乳样采集后放入具塞玻璃瓶内，置于生物安全运输箱中在1～5小时内带回实验室用于提取分析。
综上所述，在乳制品检测技术领域中脂质分子的检测目前仍处于空白，本发明利用了脂质分子具有更高的稳定性及可检测性。甲基叔丁基醚法(MTBE法)提取脂质相较于传统的脂质提取分离法(Folch法)，提取试剂毒性小，提取率充分，具有更高的提取效率与可操作性。同时基于色谱高分辨率质谱，建立的掺伪鉴别方法具有高灵敏度、准确性、耗时小等特点，为进一步保证牛羊乳的质量检测体系和保障牛羊乳市场的规范性提供了参考。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用MTBE法，对乳样进行分离提取，得到乳样中的脂质成分；其中，乳样包括生牛乳和生羊乳；
2)采用液相色谱分离结合高分辨质谱鉴定，对步骤1)所得脂质成分进行一级数据轮廓采集和二级数据轮廓采集，得到脂质成分的原始轮廓信息；
3)对步骤2)所得脂质成分的原始轮廓信息进行格式转化后和校正处理，得到脂质成分的平行分析数据信息；将所得平行分析数据信息与脂质结构数据库进行鉴定，得到脂质成分的脂质分子矩阵；
4)对步骤3)所得脂质分子矩阵进行差异分析和多变量统计分析，筛选得到用于羊乳掺伪的脂质生物标志物；
5)将步骤4)所得用于羊乳掺伪的脂质生物标志物进行定量分析，用于待鉴别样品检测，实现牛羊乳掺伪鉴别。
2.根据权利要求1所述的一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，步骤1)中，采用MTBE法进行分离提取，具体包括以下操作：
①将乳样均匀分散于水中，得到混合体系A，向所得混合体系中加入体积比为1:5的甲醇/甲基叔丁基醚混合液后超声混合，得到混合体系B，向所得混合体系B中加入d7-TG，得到混合体系C；
②将步骤①所得混合体系C经涡旋振荡后进行超声混合处理，得到混合体系D，将所得混合体系D经冷冻离心留取上清液A；
③向步骤②所得上清液A中加入体积比为1:5的甲醇/甲基叔丁基醚混合液后重复步骤②两次，收集得到上清液B；将所得上清液B经氮吹干后得到乳样中的脂质成分，将所得乳样中的脂质成分与体积比为1:3的甲醇/二氯甲烷混合溶液复溶，得到用于步骤2)进行液相色谱分离结合高分辨质谱鉴定的待测样品。
3.根据权利要求2所述的一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，步骤①中，乳样、水、甲醇/甲基叔丁基醚混合液和d7-TG的体积比为50～60：250～300：700～1000：15；
步骤②中，涡旋振荡3～10min，超声混合处理10～20min，在4000～4500r/min下冷冻离心15～25min；
步骤②中，上清液A、甲醇/甲基叔丁基醚混合液和甲醇/二氯甲烷混合溶液的体积比为300～500：300～500：80～100。
4.根据权利要求1所述的一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，步骤2)中，液相色谱分离的检测条件为：在0～10min，55％洗脱流动相A；10～13.8min，10％洗脱流动相A；13.8～20min，55％洗脱流动相A的条件下，以250～300μL/min的流速对步骤1)所得脂质成分进行洗脱；
其中，采用AcclaimTMTrinity P2
Column色谱柱；
其中，洗脱流动相A为6～10mmol/L醋酸铵+65％乙腈+35％H2O，流动相B为6～10mmol/L醋酸铵+15％乙腈+85％异丙醇。
5.根据权利要求1所述的一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，步骤2)中，高分辨质谱的检测条件为：
高分辨质谱的质谱仪器基于数据靶向扫描采集进行一级数据信息点和二级数据信息点采集；在每个数据信息点采集的循环中，对强度最高的前20个分子离子对应的二级数据信息点的质谱信息点进行数据采集；
碰撞能为35eV，45eV和55eV；
高分辨质谱所采用加热电喷雾离子源的参数设置如下：雾化气压：50～55Pa；辅助气压：20～25Pa；气帘气压：8～10Pa，温度：400～500℃；喷雾电压：+3000～4000V；
负模式参数设置如下：雾化气压：50～55Pa；辅助气压：20～25Pa；气帘气压：8～10Pa，温度：500～600℃；喷雾电压：-2800～3000V。
6.根据权利要求1所述的一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，步骤3)中，格式转化的操作为对步骤2)所得脂质成分的原始轮廓信息转化为mzXML格式。
7.根据权利要求1所述的一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，步骤3)中，校正处理的操作为保留时间校正、一级和二级峰识别、峰对齐处理。
8.根据权利要求1所述的一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，步骤3)中，脂质结构数据库包括Lipid Bank、LIPIDMAPS、LIPIDAT、Cyber Lipids以及脂质组学相关数据库。
9.根据权利要求1所述的一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，步骤4)中，差异分析为基于Fold change和T-test检验；筛选在生牛乳与生羊乳中具有显著差异的脂质分子。
10.根据权利要求1所述的一种基于甘油三酯的牛羊乳掺伪鉴别方法，其特征在于，步骤4)中，多变量统计分析为基于主成分分析和偏最小二乘判别分析的多变量统计模型建立。
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