CN110573478A - 检测和量化有机酸代谢产物的质谱测定方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了一种用于通过质谱确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的方法。运行时间少于六分钟。该方法包括在适于从所述一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下将样品置于电离源作用下，其中一种或多种分析物在电离之前被衍生化；在单次进样中通过质谱测量来自所述一种或多种分析物中的每一种分析物的一种或多种离子的量；以及使用所测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种分析物中的每一种分析物的量。

Description

检测和量化有机酸代谢产物的质谱测定方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年4月20日提交的美国临时专利申请号62/487,542的权益，该临时申请的全部内容通过引用在此并入本文。
背景技术
提供以下描述本发明背景的信息以帮助理解本发明，并且不被认为构成或描述了本发明的现有技术。
在膳食纤维发酵期间，结肠中的细菌产生短链脂肪酸(SCFA)以及乳酸。产生后，SCFA被运输到血液中，并被器官吸收，并作为底物和信号分子来调节能量稳态。SCFA及其对能量代谢的影响已与多种疾病相关，包括炎症性肠病、肠易激综合症、腹泻、代谢综合症和癌症(Han,J.等Analytica Chimica Acta.854(2015)86-94和Rio-Covian,D.等FrontMicrobiol.(2016)7:185)。了解SCFA与能量代谢之间的相互作用可能有助于更好地了解微生物组、代谢及其对疾病的影响。
由于它们的挥发性，LC-MS不容易检测到原始状态的SCFA。SCFA和其他有机酸，包括诸如乳酸、丙酮酸等非挥发性有机酸以及三羧酸(TCA)循环的中间体在传统的反相液相色谱方法中通常很难保留下来，并且在质谱检测中灵敏度降低。因此，通常通过其他方法(例如GC-MS和NMR)的组合来检测这些分析物。在基于GC的分析中，通常使用两种单独的方法：一种用于分析挥发性SCFA的方法，另一种用于分析非挥发性有机酸的方法，在分析之前需要对其进行衍生化。
需要一种可靠且可重现的方法，以一种单一的分析方法来测量挥发性SCFA和非挥发性有机酸(例如乳酸、丙酮酸、TCA循环中间体)。本文描述的方法可在单次进样中测量样品的SCFA和关键能量代谢物(乳酸、丙酮酸和TCA循环中间体)。
发明内容
在本发明的第一方面，一种用于通过质谱确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的方法包括多个步骤。一种或多种分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、异丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组。运行时间少于六分钟。该方法包括在适于从所述一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将样品置于电离源作用下，其中一种或多种分析物在电离之前被衍生化；在单次进样中通过质谱测量来自一种或多种分析物中的每一种分析物的一种或多种离子的量；以及使用所测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种分析物中的每一种分析物的量。
在本发明的第二方面，一种用于通过质谱确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的方法包括多个步骤。一种或多种分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、异丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)及其组合组成的组。运行时间少于六分钟。该方法包括在适于从所述一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将样品置于电离源作用下，其中一种或多种分析物在电离之前被衍生化；在单次进样中通过质谱测量来自一种或多种分析物中的每一种分析物的一种或多种离子的量；以及使用所测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种分析物中的每一种分析物的量。
在本发明的第三方面，一种用于通过质谱确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的方法包括多个步骤，其中消除了新戊酸的干扰。一种或多种分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、异丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)及其组合组成的组。该方法包括在适于从所述一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将样品置于电离源作用下，其中一种或多种分析物在电离之前被衍生化；在单次进样中通过质谱测量来自一种或多种分析物中的每一种分析物的一种或多种离子的量；以及使用所测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种分析物中的每一种分析物的量。
在本发明的第四方面，一种用于通过质谱确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的方法包括多个步骤。一种或多种分析物选自由乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组。运行时间少于六分钟。该方法包括在适于从所述一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将样品置于电离源作用下，其中一种或多种分析物在电离之前被衍生化；在单次进样中通过质谱测量来自一种或多种分析物中的每一种分析物的一种或多种离子的量；以及使用所测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种分析物中的每一种分析物的量。
在这些方面的特征中，确定两种或更多种分析物、三种或更多种分析物、四种或更多种分析物或五种或更多种分析物的量。关于这些特征，两种或更多种分析物之一可以选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、异丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)组成的组；并且两种或更多种分析物之一选自由乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组。关于这些特征，两种或更多种分析物之一是丙酮酸。
在这些方面的另一个特征中，使用至少2,4-二氟苯肼盐酸盐或3-硝基苯肼盐酸盐来衍生所述样品。在这些方面的另一个特征中，使用至少2,4-二氟苯肼盐酸盐来衍生所述样品并且其中该样品是粪便样品。在这些方面的另一个特征中，使用至少3-硝基苯肼盐酸盐来衍生该样品并且其中该样品是血浆样品。关于该特征，选自由EDC盐酸盐、1-羟基苯并三唑、N，N'二异丙基碳二亚胺(DIC)和二环己基碳二亚胺(DCC)组成的组的一种或多种偶联催化剂也用于衍生。
进一步考虑以上特征，可以确定乙酸(C2)、丙酸(C3)和丁酸(C4)的量，可以确定乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)和乳酸的量，可以确定乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)和丁酸(C4)的量，以及可以确定乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)和己酸(己酸，C6)的量。
在以上方面的特征中，质谱仪以负模式操作。在另一个特征中，样品在经受电离源之前已经通过液相色谱纯化。关于该特征，液相色谱选自由高性能液相色谱、超高性能液相色谱和湍流液相色谱组成的组。进一步考虑该特征，样品在经受电离源之前已通过高性能液相色谱或超高性能液相色谱进行了纯化。
在这些方面的另一个特征中，内标用于确定样品中一种或多种分析物的量。关于该特征，内标包含一种或多种待测分析物中至少一种的同位素标记类似物。在另一个特征中，样品包括生物样品。关于该特征，样品选自由血液、血浆、尿液、粪便、细菌培养上清液、血清、母乳、唾液和组织组成的组。
在这些方面的另一个特征中，用于确定所述一种或多种分析物中的每一种分析物的量的一种或多种离子是选自表4和表5中的离子中的一种或多种离子。在又一个特征中，质谱是串联质谱。
在本发明的第五方面，试剂盒包含一种或多种同位素标记的类似物作为一种或多种分析物各自的内标。一种或多种分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组。该试剂盒还包括包装材料和使用试剂盒的说明。
在该方面的一个特征中，试剂盒进一步包含衍生试剂、催化剂试剂、校准标准品或质量参比样品。
附图说明
图1显示了乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸和己酸(己酸，C6)在使用衍生化程序3和本文所述的LC-MS方法分析校准标准样品后生成的单个色谱图中的色谱图示例。新戊酸未与2-甲基丁酸分离。
图2显示了乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、新戊酸、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸和己酸(己酸，C6)在使用衍生化程序2和本文所述的LC-MS方法分析校准标准样品后生成的单个色谱图中的色谱图示例。
图3显示了乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、4-甲基戊酸和己酸(己酸，C6)在使用衍生化程序2和本文所述的LC-MS方法分析粪便样品后生成的单个色谱图中的色谱图示例。
图4显示了乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)和己酸(己酸，C6)在使用衍生化程序2和本文所述的LC-MS方法分析细菌培养上清样品后生成的单个色谱图中的色谱图示例。
图5(A-B)显示了乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、4-甲基戊酸(异己酸)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸在使用衍生化程序2和本文所述的LC-MS方法分析粪便样品后生成的单个色谱运行中的色谱图示例。
图6(A-B)显示了乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、4-甲基戊酸(异己酸)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸在使用衍生化程序2和本文所述的LC-MS方法分析粪便样品后生成的单个色谱运行中的色谱图示例。
图7(A-B)显示了乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、4-甲基戊酸(异己酸)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸在使用衍生化程序3和本文所述的LC-MS方法分析血浆样品后生成的单个色谱运行中的色谱图示例。
具体实施方式
描述了用于检测样品中一种或多种选自以下的分析物的存在、不存在或量的方法，所述分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、新戊酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组。本文的使用这些方法检测的“能量代谢物”包括乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸。本文的使用这些方法检测的“TCA循环中间物”包括富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸。
用于本文描述的方法的合适样品包括感兴趣的任何材料或复杂混合物。在一个实施方案中，样品可以是生物样品，例如生物流体、生物固体或组织。生物样品的非限制性实例包括血液(全血)、血液血浆(血浆)、血液血清(血清)、尿液、脑脊髓液(CSF)、母乳、唾液、粪便、细胞(动物或植物)、细胞培养物(动物或植物)、动物或植物细胞培养上清、细菌培养物上清、细菌细胞或植物或动物组织(包括肠组织和肠内容物)。所述生物样品可以获自任何生物来源，例如动物、植物、细胞培养物等。所述动物可以是哺乳动物例如人、猴、小鼠、兔或大鼠或非哺乳动物例如鱼。该植物可以是任何植物，包括农业上有用的植物。
描述了使用单次进样来检测样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的质谱方法。这些方法可以使用诸如UPLC之类的液相色谱步骤来执行与质谱法相结合的所选分析物的分离(纯化、富集)，从而提供了一种高通量分析系统，用于对样品中的多种分析物进行定量分析。
当使用LC/MS时，对分析物进行准确定量的一个障碍是来自共洗脱分析物的干扰。一种这样的干扰分析物是新戊酸，它与C5 SCFA(2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸)共洗脱，并且可能导致这些分析物的定量不准确。新戊酸是一种存在于塑料中的异生物质，可能作为环境背景污染物存在于生物样品中。它也可以由含有新戊酰酯残基的药物(例如某些抗生素)的体内代谢形成。本文所述方法克服了这种干扰，并通过色谱(选择合适的衍生化程序(例如衍生化程序2))或通过使用非新戊酸未形成的子离子来色谱分离SCFA分析物和新戊酸，以检测这些分析物。
所述方法：1)在单次进样中定量测量SCFA分析物、乳酸、丙酮酸和TCA循环中间体的量；2)与标准方法相比，提高了灵敏度；3)克服了新戊酸引起的干扰；4)提高C5-SCFA代谢产物定量的准确性；5)包括色谱和质谱在内的运行时间少于6分钟，这可能会增加仪器能力；6)使用单次进样进行分析，可以节省资源并提高通量。
所述方法的一个优点是使用液相色谱-质谱在单次进样中分离并测量一种或多种SCFA分析物和一种或多种能量代谢物的存在、不存在或量的方法，所述SCFA分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)组成的组；能量代谢物选自由乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸组成的组。
这些方法的另一个优点是能够在单次进样中测量SCFA和能量代谢物同时分离所有20种代谢物的能力，包括在比公开方法(Han等)更短的运行时间内将新戊酸与2-甲基丁酸分离的能力。在色谱上新戊酸未与2-甲基丁酸分离的情况下，可以通过使用子离子检测非新戊酸形成的2-甲基丁酸来克服新戊酸的干扰。可以在少于6分钟的运行时间中通过单次进样检测到一种或多种和多达20种代谢物的组合，其选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)、新戊酸、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸组成的组。
与目前用于测量SCFA和能量代谢物(包括乳酸、丙酮酸和TCA循环中间体)的方法相比，本文提供的方法具有更多的优势。在单次进样中测量多种分析物的能力，减少了获得分析结果所需的时间，使用更少的实验室一次性用品(例如试管、移液器吸头、试剂)、实验室仪器和人员资源等资源。这些改进可通过降低测定成本并增加仪器和实验室进行样品分析的能力来节省成本。
在进一步详细描述本发明之前，定义以下术语。
定义
术语“分离”是指将复杂混合物分离为其组分分子或代谢物的过程。常见的示例性实验室分离技术包括电泳和色谱分离。
术语“色谱”是指一种物理分离方法，其中待分离的组分(即化学成分)分布在两相中，其中一相是固定的(固定相)，而另一相沿确定的方向移动(流动相)。流动相可以是气相(“气相色谱”，“GC”)或液相(“液相色谱”，“LC”)。色谱输出数据可用于本文所述方法的实施方案中。
术语“液相色谱”或“LC”是指当流体均匀地移动通过细碎物质的柱或通过毛细管通道时，选择性抑制流体溶液的一种或多种组分的方法。抑制是由于当流动相相对于固定相移动时，混合物组分在一个或多个固定相与流动相之间的分布而产生的。“液相色谱”的实例包括“反相液相色谱”或“RPLC”，“高性能液相色谱”或“HPLC”，“超高性能液相色谱”或“UPLC”或“UHPLC”。
术语“保留时间”是指自将样品引入分离装置以来在色谱过程中经过的时间。样品成分的保留时间是指色谱分析过程中经过的时间，其介于将样品注入分离装置的时间与样品成分洗脱(例如从包含固定相的分离装置的一部分中洗脱)的时间之间。
样品成分的“保留指数”是指通过内插(通常是对数)获得的数字，该值将样品成分的保留时间或保留因子与样品成分的峰前后洗脱的标准品的保留时间相关，该机制利用已知标准品的分离特性消除系统误差。
术语“质谱”(MS)是指一种用于测量和分析分子的技术，该技术包括使目标分子电离或电离并裂解，然后基于其质荷比分析离子以产生质谱作为“分子指纹”。确定物体的质荷比可以通过确定该物体吸收电磁能的波长来完成。有几种常用的方法来确定离子的质荷比，一些方法测量离子轨迹与电磁波的相互作用，另一些方法测量离子行进给定距离所花费的时间，或两者结合。可以对照数据库搜索来自这些碎片质量测量的数据，以获得目标分子的标识。
术语“以负模式操作”或“以负多反应监测(MRM)模式操作”或“以负电离模式操作”是指其中产生和检测负离子的那些质谱。术语“以正模式操作”或“以正MRM模式操作”或“以正电离模式操作”是指其中产生和检测正离子的那些质谱。
术语“质量分析器”是指质谱仪中的一种装置，该装置通过离子的质荷比(“m/z”)来分离离子混合物。
术语“m/z”是指通过将离子的质量数除以其电荷数而形成的无量纲量。长期以来，它一直被称为“质荷比”。
如本文所用，术语“源”或“电离源”是指质谱仪中的使待分析样品电离的装置。电离源的示例包括电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰电离检测器(FID)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)等。
如本文所用，术语“检测器”是指质谱仪中检测离子的装置。
术语“离子”是指包含电荷的任何物体，其可以例如通过向该物体添加电子或从该物体去除电子而形成。
术语“质谱”是指由质谱仪产生的数据图，通常在x轴上包含m/z值，在y轴上包含强度值。
术语“扫描”是指与特定的分离指数相关的质谱。例如，使用色谱分离技术的系统可能会生成多个扫描图，每个扫描图在不同的保留时间。
术语“运行时间”是指从进样到仪器数据生成的时间。样品的总运行时间包括色谱分析和质谱分析。
术语“串联MS”是指涉及MS选择的多个阶段的操作，其中在这些阶段之间发生断裂。在第一MS阶段，离子在离子源中形成，并按质荷比分开。选择具有特定质荷比的离子，每种离子代表一种(或可能超过一种)化学成分，并产生碎片离子。然后分离得到的碎片离子，并在质谱的第二阶段进行检测。第一个MS阶段中的关注离子对应于“母”离子或前体离子，而在第二个MS阶段中生成的离子对应于母离子的子成分，在本文中称为“子离子”或“产物”离子。
因此，串联MS允许创建表示复杂混合物中化学成分的母子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此之间的关系，其中子离子表示母离子的子成分。例如，可以对子离子重复进行串联MS，以确定“孙女”离子。因此，串联MS不限于两级碎片，而是通常用于指代多级MS，也称为“MSn”。术语“MS/MS”是“MS2”的同义词。为简单起见，下文中的术语“子离子”是指由次级或更高级(即不是初级)MS产生的任何离子。
术语“衍生化”是指使两个分子反应以形成新分子。衍生化的分析物是已经与试剂(例如衍生试剂)反应的分析物，其目的是例如促进纯化、电离、破碎、检测或其任何组合。在一些实例中，“偶联催化剂”可与衍生试剂一起使用以促进分析物的衍生。
一种或多种分析物的“量”是指在样品中测量的分析物的绝对量或浓度。例如，量或浓度可以表示为摩尔浓度、质量分数、摩尔分数、摩尔浓度或百分比。
I.样品制备和质量控制(QC)
通过从样品中可能存在的大分子(例如蛋白质、核酸、脂质)中分离样品中的分析物来制备含有分析物的样品提取物。术语“样品提取物”、“提取的样品”或“分析物提取物”在本文中也可以称为“分析样品”，并且这些术语可以互换使用。样品中的部分或全部分析物可能与蛋白质结合。在MS分析之前，可以使用各种方法来破坏分析物与蛋白质之间的相互作用。例如，可以从样品中提取分析物以产生液体提取物，同时沉淀并去除可能存在的蛋白质。可以使用例如甲醇、乙腈或乙酸乙酯的溶液沉淀蛋白质。为了使样品中的蛋白质沉淀，将甲醇、乙腈或乙酸乙酯溶液添加到样品中，然后可以在离心机中离心混合物，以从沉淀的蛋白质中分离出液体上清(包含提取的分析物)。
在其他实施方案中，通过从蛋白质释放分析物而不沉淀蛋白质来制备分析样品。例如，可以将甲酸溶液添加到样品中以破坏蛋白质和分析物之间的相互作用。或者，可以将硫酸铵、甲酸的乙醇溶液或甲酸的甲醇溶液添加到样品中，以破坏蛋白质和分析物之间的离子相互作用而不沉淀蛋白质。
分析样品可以使用适当的衍生试剂和偶联催化剂进行衍生。在一个实例中，可以使用2，4-二氟苯肼盐酸盐和偶联催化剂将样品衍生化。在另一个实例中，可以使用3-硝基苯肼盐酸盐和偶联催化剂将样品衍生化。偶联催化剂可以是例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)、N，N'二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)，DIC与1-羟基苯并三唑(HOBt)组合或DCC与1-羟基苯并三唑(HOBt)组合使用。在一些实例中，可以将碱例如吡啶或三乙胺或类似的碱加入到衍生化混合物中。在一个实例中，衍生试剂可以是2，4-二氟苯肼盐酸盐，偶联催化剂可以是与HOBt和吡啶组合的DIC。在另一个实例中，衍生试剂可以是2，4-二氟苯肼盐酸盐，偶联催化剂可以是EDC盐酸盐。在又一个实例中，衍生试剂可以是3-硝基苯肼盐酸盐，偶联催化剂可以是与HOBt和吡啶组合的DIC。2，4-二氟苯肼盐酸盐和3-硝基苯肼盐酸盐的浓度范围可为1至200mg/mL。EDC盐酸盐和DCC的浓度范围可为1至100mg/mL。DIC的浓度范围可为1-100％。在一些实例中，可以将0.5-5μl的100％DIC(或相应量的溶液)直接添加到样品中。吡啶的浓度范围可为1-100％。在一些实例中，可以将0.5-5μl的100％吡啶(或相应量的溶液)直接添加到样品中。在一个实例中，2,4-二氟苯肼盐酸盐的浓度可以为25mg/mL，HOBt的浓度可以为25mg/mL，并且可以向样品中添加2μl的100％DIC和2μl的100％吡啶。在另一个实例中，2，4-二氟苯肼盐酸盐的浓度和EDC盐酸盐的浓度可以为25mg/mL。在又一个实例中，3-硝基苯肼盐酸盐的浓度可以为25mg/mL，HOBt的浓度可以为25mg/mL，并且可以向样品中添加2μl的100％DIC和2μl的100％吡啶。可以基于要分析的样品类型来选择本文所述方法中使用的衍生试剂。在一个实例中，可以选择衍生试剂2，4-二氟苯肼盐酸盐用于粪便样品的分析。在另一个实例中，可以选择衍生试剂3-硝基苯肼盐酸盐用于血浆样品的分析。
在一些实施方案中，可以对分析样品进行各种方法，包括如本文所述的液相色谱、电泳、过滤、离心和亲和分离，以相对于样品中的一种或多种其他成分纯化或富集所选分析物的量。
为了评估检测和定量分析物的方法的精度、准确性、校准范围或分析灵敏度，可以使用质量控制(QC)样品。可以基于样品中检测到的给定分析物的定量下限(LLOQ)或定量上限(ULOQ)，确定要在QC样品中使用的给定分析物的浓度。在一个示例中，LLOQ可以由标准品(例如，标准品A)的浓度表示，并且ULOQ可以由第二标准品(例如，标准品H)的浓度表示。可以将低QC值设置为大约3X LLOQ的浓度，中QC值可以设置为高QC的大约25-50％的浓度，高QC值可以设置为大约80％的浓度>ULOQ。可以基于分析测量范围(AMR)和在一组代表性样品中测得的样品结果的频率来选择QC目标浓度水平。
II.色谱
在质谱分析之前，可以对分析样品进行一种或多种分离方法，例如电泳、过滤、离心、亲和分离或色谱分离。在一个实施方案中，分离方法可包括液相色谱(LC)，包括例如超高性能液相色谱(UHPLC)。
在一些实施方案中，UHPLC可以使用反相柱色谱系统、亲水相互作用色谱(HILIC)或混合相柱色谱系统进行。
用于LC的柱加热器(或柱管理器)可以设置在大约25℃到大约80℃的温度下。例如，柱加热器可以设置为大约40℃、50℃、60℃、70℃等。
在一个实例中，可以使用HILIC系统进行UHPLC。在另一个实例中，可以使用反相柱色谱系统进行UHPLC。该系统可以包括两个或更多个流动相。流动相可以被称为例如流动相A、流动相B、流动相A'和流动相B'。
在使用两个流动相A和B的示例性实施方案中，流动相A可包含甲酸和水，流动相B可包含甲酸和乙腈。流动相A或流动相B中的甲酸浓度范围为0.001％至5％。乙腈的浓度范围可为0％到100％。例如，流动相A可以在水中包含0.005、0.01、0.05、0.1或0.5％的甲酸，而流动相B在乙腈中可以包含0.005、0.01、0.05、0.1或0.5％的甲酸。
在一个实例中，线性梯度洗脱可用于色谱。线性梯度洗脱的起始条件可以包括流动相的浓度(例如，流动相A)和/或流动相通过柱的流速(例如，流动相A)。可以优化起始条件以分离和/或保留一种或多种分析物。梯度条件也可以针对分析物的分离和/或保留进行优化，并且可以根据所选流速而变化。例如，初始条件可能是20％流动相B和800μL/min流速。流动相B可以在20％保持3-4分钟，增加到30-60％，保持0.5-1分钟，然后增加到70-90％，并在70-90％保持不到一分钟。流动相B在5.0分钟时可能恢复到20％，在此情况下，流动相B可以维持少于一分钟的时间以平衡下一次进样。总运行时间可少于六分钟。
可以优化色谱条件以允许更快的流速而不损失分辨率，这允许更短的运行时间并由此增加仪器能力。例如，可以优化梯度条件以允许更快的流速并保持分辨率。在另一个实例中，可以优化柱加热器的温度以允许更快的流速而不降低分辨率。在另一个示例中，可以优化温度和梯度条件以允许更快的流速，同时保持分辨率。在一个实例中，可以通过将柱加热器设置在60℃并使用梯度曲线以初始条件为20％流动相B和800μl/min的流速将色谱条件优化成少于六分钟的总运行时间。
来自色谱柱的洗脱液可以直接和自动引入质谱仪的电喷雾源中。用于确定一种或多种分析物的存在、不存在或量的总运行时间(包括色谱法和质谱法)可以少于六分钟，所述分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)、己酸(己酸，C6)、新戊酸、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸组成的组。
III.质谱和定量
可以通过例如质谱电离一种或多种分析物。使用包括离子源的质谱仪进行质谱分析，该离子源用于电离分离的样品并创建带电分子以进行进一步分析。电离可以通过例如电喷雾电离(ESI)来进行。其他离子源可包括，例如大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰电离检测器(FID)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)。可以基于多种考虑来确定电离方法的选择。示例性考虑因素包括要测量的分析物、样品类型、检测器类型以及正或负模式的选择。
可以将一种或多种分析物电离以产生一种或多种离子。例如，可在负离子模式下电离分析物乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)、己酸(己酸，C6)、新戊酸、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸。
可以针对给定的方法和/或所使用的特定质谱仪优化质谱仪的仪器设置。仪器可以使用各种气体，例如氮气、氦气、氩气或零空气。可以使用AB Sciex QTrap5500质谱仪进行质谱分析。在一个实例中，可以负多反应监测(MRM)模式操作质谱仪。离子喷雾电压设置可以在约-0.5kV至约-5.0kV的范围内；在一个实施方案中，电压可以设置为-4.5kV。源温度可以在约250℃至约750℃的范围内；在一个实施方案中，源温度可以设置为500℃。帘气可以在约10至约55psi的范围内；在一个实施方案中，帘气被设置为30psi。喷雾器和去溶剂化气体的流速可以在约0至约90psi的范围内。在一个实施方案中，流速可以设置为70。碰撞激活解离(CAD)气体的设置范围可以从高到低；在一实施方案中，CAD气体设定为中等。降落电位的范围可以在大约-75V至大约-40V的范围内。碰撞能量(CE)可以在约-70eV至约-10eV的范围内。入口电势(EP)设置的范围可以在大约-20V至大约-5V的范围内。碰撞室出口电势(CXP)设置的范围可以在大约-20V至大约-5V的范围内。
在电离之后，可以分析带电离子以确定质荷比。用于确定质荷比的示例性合适分析仪包括四极分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可以使用例如选择性模式或扫描模式来检测离子。示例性扫描模式包括MRM和选定的反应监测(SRM)。
分析结果可以包括由串联MS产生的数据。在示例性实施方案中，串联MS可以是精确质量串联MS。例如，精确质量串联质谱可以使用四极杆飞行时间(Q-TOF)分析仪。串联MS允许创建表示复杂混合物中化学成分的母子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此之间的关系，其中子离子表示母离子的子成分。
例如，初级质谱可以包含五个不同的离子，其可以表示为五个图形峰。初级MS中的每个离子可以是母离子。每个母离子都可以进行次级MS分析，该质谱产生的质谱图显示了该特定母离子的子离子。
可以扩展母/子关系以描述分离的成分(例如，从色谱状态洗脱的成分)和在初级MS中检测到的离子之间的关系，以及要分析的样品和分离的成分之间的关系。
质谱仪通常向用户提供离子扫描(即，在给定范围内具有特定质量/电荷的每个离子的相对丰度)。质谱数据可以通过多种方法与原始样品中分析物的量相关。在一个实例中，使用校准标准品来生成标准曲线(校准曲线)，以便可以将给定离子的相对丰度转换为该离子代表的绝对量的分析物。在另一实例中，校准标准品可以是外标，并且可以基于从那些标准产生的离子来生成标准曲线，以计算一种或多种分析物的量。在另一个实例中，外标可以是未标记的分析物。
可以将内标添加到校准标准品和/或测试样品中。内标可用于解决样品处理过程中分析物的损失，以便获得样品中测得的分析物的更准确值。校准标准品中分析物峰面积与内标峰面积之比可用于生成校准曲线和定量样品。一种或多种同位素标记的分析物类似物例如乙酸-d3、丙酸-d5、异丁酸-d3、丁酸-d3,2-甲基丁酸-d3、异戊酸-d9、戊酸-d3、己酸-d3、三甲基-d9-乙酸(新戊酸d9)、3-甲基戊-d11酸、4-甲基戊-d11酸、乳酸-d4、丙酮酸-13C3、α-酮基戊二酸-13C4、柠檬酸-d4、苹果酸-d3、富马酸-13C4和琥珀酸-d4可用作内标。在一些实例中，同位素标记的类似物可能不适用于所有分析物，并且可以使用同位素标记的类似物用于类似结构的分析物。例如，对于乌头酸和异柠檬酸的定量分析，可以使用柠檬酸-d4。可以将一个或多个内部标准组合在解决方案中，例如，工作内标(WIS)解决方案。WIS溶液可以由一种或多种内标组成，并且可以包括针对每种待测分析物的一种或多种内标。
可以将来自MS仪器的分析数据发送到计算机并且使用计算机软件进行处理。在一个实例中，使用统计回归方法进行定量，将分析物与内标的峰面积比与校准标准品的浓度进行拟合。在另一个实例中，统计回归是加权线性最小二乘回归。使用校准曲线计算出的斜率和截距可用于计算实验样品中未知浓度的分析物。
IV.试剂盒
本文描述了一种试剂盒，其用于分析一种或多种分析物，所述分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)和己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)、新戊酸、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸及其组合组成的组。例如，试剂盒可以包括包装材料、衍生化试剂、催化剂试剂和一种或多种其量足以进行一种或多种测定的测量量的校准标准品或内标或质量参比样品。在示例性实施方案中，内标可以被同位素标记，试剂盒可以包括预制的校准标准品溶液、内标溶液、催化剂试剂溶液、流动相溶液、质量参比样品、质量参比样品重构溶液和/或试剂盒可包括校准标准品试剂、内标试剂、催化剂试剂、流动相试剂，以及制备校准标准品溶液、内标溶液、催化剂试剂溶液、流动相溶液和质量参比样品的说明。试剂盒还可包含以有形形式(例如，在纸上，例如说明书或电子介质)记录的说明书，其用于使用试剂测量一种或多种分析物。
实施例
I.试剂与仪器
乙酸钠、丙酸钠、异丁酸、丁酸钠、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、乙酸钠-d3、甲酸、N，N'二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和吡啶得自Sigma-Aldrich；丙酸钠-d5、异丁酸-d3；丁酸钠-d3、2-甲基丁酸-d3、异戊酸-d9、戊酸-d3、己酸-d3、乳酸钠-d4、苹果酸-d3和琥珀酸-d4得自CDN Isotopes；丙酮酸钠-13C3；富马酸13C4、柠檬酸d4和α-酮基戊二酸二钠13C4得自Cambridge Isotope Laboratories；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和2，4-二氟苯肼盐酸盐得自TCIAmerica。HPLC级甲醇得自Fisher Scientific；HPLC级乙腈和HPLC级水得自Acros。使用VWRScientific的多管涡旋混合器进行混合。在来自Thermo Scientific的Sorvall ST 40R离心机中用3617桶式转子进行板的离心。
II.内标制备
以表1所示浓度在水中(乙酸钠-d3、丙酸钠-d5、异丁酸-d3和丁酸钠-d3、乳酸钠-d4；丙酮酸钠-13C3、α-酮基戊二酸二钠-13C4、柠檬酸-d4、苹果酸-d3、富马酸-13C4、琥珀酸-d4)或在甲醇：水(1：1)中(2-甲基丁酸-d3、异戊酸-d9、戊酸-d3、己酸-d3)制备工作内标(WIS)溶液。没有标记的内标用于乌头酸或异柠檬酸，并且使用结构相似的标准柠檬酸-d4定量分析这些分析物。
表1.工作内标(WIS)溶液
III.确定校准范围
使用加标了已知浓度的校准标准品的溶液确定指示样品类型的每种分析物的校准范围。校准加标溶液的制备是相应校准浓度的20倍。例如，对于代表性分析物，每种校准标准品中的最终分析物浓度分别在表2和3中列出，分别用于细菌培养上清和粪便样品。本领域普通技术人员将理解如何确定其他分析物和其他样品类型的校准范围，而无需进行过多的实验。对于每种分析物，LLOQ代表校准范围的下限，而校准范围的上限则由ULOQ代表。为了覆盖指示样品类型的校准范围，十种校准标准品(表2中的标准A-J)用于分析细菌培养上清样品，八种校准标准品(表3中的标准A-H)用于分析粪便样品。
表2.细菌培养上清样品中分析物的校准范围
表3.粪便样品中分析物的校准范围
QC样品是从细菌培养上清或粪便样品池中制备的。QC样品的分析物浓度处于内源水平，或者根据需要用分析物稀释或强化，以使分析物浓度在给定样品类型的校准范围内。将QC样品存储在-80℃。
IV.一般方法
A.样品制备
细菌培养上清样品
在聚丙烯96孔板中进行样品制备。实验样品、质控样品和校准标准品在冰上融化并涡旋；将50.0μl细菌培养上清液接着20.0μl工作内标溶液(WIS)添加到96孔板的适当孔中。对于Blank-IS样品，将50.0μl的水和20.0μl的WIS添加到适当的孔中；添加70.0μl的水用于空白样品。
固体样品(粪便和组织)
将约100mg冷冻的粪便或组织(实验样品)称重到2mL冷冻管中，并记录准确的重量。对于空白和Blank-IS样品，将100μl水添加到2mL冷冻管中。对于校准标准品，将100μl相应的校准溶液加入2mL冷冻管中。对于QC样品，将250μL的QC样品提取物添加到2mL冷冻管中。将20.0μL体积的WIS溶液添加到校准标样、Blank-IS、QC样品和实验样品中，并将20.0μL的水添加到空白样品中。
液体样品(血浆、血清、尿液、唾液和母乳)
将50.0μl实验样品添加到微量滴定板的孔中。对于空白和Blank-IS样品，将50.0μL水添加到微量滴定板的孔中。对于校准标准品，将50.0μL相应的校准溶液加入微量滴定板的孔中。对于QC样品，将50.0μl相应的样品类型的QC样品加入微量滴定板的孔中。将20.0μl体积的WIS溶液添加到校准标样、Blank-IS、QC样品和实验样品中，并将20.0μl的水添加到空白样品中。
B.提取
为了沉淀蛋白质和提取分析物，向样品中加入200μL甲醇，并将样品摇动或涡旋至少1分钟，然后以3000rpm离心3分钟。将40.0μl体积的澄清上清转移至新鲜的96孔板中，并将分析样品衍生化。将板加盖，涡旋并以3000rpm离心0.5分钟。将板在40℃下加热30分钟，并以3000rpm离心0.5分钟。将来自每个孔的50.0μL转移至新鲜的96孔板中，并将450μl甲醇/水溶液(1：1)添加至所有孔。在LC-MS/MS分析之前，将板加盖并涡旋。
C.衍生化
测试了衍生化试剂3-硝基苯肼、3-氯苯肼盐酸盐、2,4-二氯苯肼盐酸盐和2,4-二氟苯肼盐酸盐，并且选择衍生化试剂2,4-二氟苯肼盐酸盐和3-硝基苯肼盐酸盐用于本文所述的方法。试剂3-硝基苯肼、3-氯苯肼和2,4-二氯苯肼没有分离C5异构体，导致SCFA 2-甲基丁酸和新戊酸的共洗脱。图1显示了新戊酸与2-甲基丁酸使用衍生试剂3-硝基苯肼和LC-MS/MS的条件如Han等人的文献所述共洗脱。除色谱分离外，还通过使用m/z 125的2,4-二氟苯肼衍生物的子离子，在新戊酸存在下对2-甲基丁酸进行选择性测量，因为相应的新戊酸衍生物未形成这个子离子(图2)。
衍生化程序1
在一个实例中，使用2,4-二氟苯肼盐酸盐作为衍生化试剂和EDC盐酸盐作为偶联催化剂将分析物提取物衍生化。在LC-MS/MS分析之前，将2,4-二氟苯肼盐酸盐溶液(10.0μL)和EDC盐酸盐溶液(20.0μL)添加到分析样品中，最终浓度分别为25μg/μl。
衍生化程序2
在另一个实例中，使用2,4-二氟苯肼盐酸盐作为衍生化试剂、1-羟基苯并三唑和DIC作为偶联催化剂和吡啶作为碱将分析物提取物衍生化。在LC-MS/MS分析之前，将DIC、吡啶以及2,4-二氟苯肼盐酸盐和1-羟基苯并三唑的溶液添加到分析样品中。2,4-二氟苯肼盐酸盐和1-羟基苯并三唑的终浓度均为25μg/μl；将2％的100％DIC和吡啶分别添加到提取物中。
衍生化程序3
在另一个实例中，使用3-硝基苯肼盐酸盐作为衍生化试剂、1-羟基苯并三唑和DIC作为偶联催化剂和吡啶作为碱将分析物提取物衍生化。在LC-MS/MS分析之前，将DIC、吡啶以及3-硝基苯肼盐酸盐和1-羟基苯并三唑的溶液添加到分析样品中。3-硝基苯肼盐酸盐和1-羟基苯并三唑的终浓度均为25μg/μl；将2％的100％DIC和吡啶分别添加到提取物中。
实施例1：测量SCFA和能量代谢物
色谱方法
开发了用于一种或多种、两种或更多种和多达总共十二种分析物的同一次进样的纯化和分离的液相色谱方法，所述分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)、己酸(己酸，C6)、新戊酸、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组。配备二元溶剂泵装置，冷藏自动进样器(设置在18℃)和柱加热器(设置在60℃)的Agilent 1290 Infinity UHPLC系统用于具有反相色谱柱(Waters ACQUIT Y C18 BEH Shield,1.7μm,2.1x100 mm)的液相色谱。流动相A为在水中的0.01％甲酸，流动相B为在乙腈中的0.01％甲酸。在初始条件为20％流动相B(80％流动相A)和800μL/min流速的初始条件下进行线性梯度洗脱。包括色谱和质谱分析在内的总运行时间为5.40分钟。
在一个实例中，根据衍生化程序2制备并衍生化了十八种人粪便样品和十八种细菌培养物上清样品。将0.5μl最终衍生化分析样品的单个固定等分试样注入色谱柱中，用于分析的每个样品。色谱分离出十种SCFA分析物和新戊酸，它们具有良好的峰形，并且不受新戊酸的干扰。针对校准标准品，分离出的分析物(乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、异丁酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)、己酸(己酸，C6)和新戊酸的示例性色谱图列于图2中。乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、新戊酸、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)和己酸(己酸，C6)的近似保留时间(分钟)为0.9、1.3、2.0、2.2、3.4、3.5、3.9、4.2、4.65、4.75和4.8。图3和4分别显示了粪便和细菌培养上清样品的示例性色谱图。
在另一个实例中，对于根据衍生化程序2制备和衍生化的人粪便样品，色谱分离了分析物乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、4-甲基戊酸(异己酸)、己酸(己酸，C6)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸，峰形好。所得分离的分析物的示例性色谱图如图5A-B所示。将0.5μl最终衍生化分析样品的单个固定等分试样注入色谱柱中，用于分析的每个样品。表4中显示了大约的保留时间(以分钟为单位)。
在又一个实例中，对于根据衍生化程序3制备和衍生化的人粪便样品，色谱分离了分析物乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、4-甲基戊酸(异己酸)、己酸(己酸，C6)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸，峰形好。所得分离的分析物的示例性色谱图如图6A-B所示。将0.5μl最终衍生化分析样品的单个固定等分试样注入色谱柱中，用于分析的每个样品。表5中显示了大约的保留时间(以分钟为单位)。
在又一个实例中，对于根据衍生化程序3制备和衍生化的人血浆样品，色谱分离了分析物乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、4-甲基戊酸(异己酸)、己酸(己酸，C6)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸，峰形好。所得分离的分析物的示例性色谱图如图7A-B所示。将0.5μl最终衍生化分析样品的单个固定等分试样注入色谱柱中，用于分析的每个样品。表5中显示了大约的保留时间(以分钟为单位)。
质谱
来自以上色谱法中描述的色谱柱的洗脱液被直接且自动地引入质谱仪的电喷雾源中。甲醇：水(50:50)用于针头清洗。使用带有Turbo V离子源(ESI)的AB Sciex QTrap5500质谱仪对分析样品进行质谱分析。仪器以负多反应监测(MRM)模式运行。离子喷雾电压设置为-4.5kV，源温度设置为500℃，帘气(例如氮气)设置为30psi，雾化器和去溶剂气(例如氮气)的流量设置为70psi，碰撞激活解离(CAD)气体(例如氮气)中等。
从仪器获取原始数据，并使用Analyst 1.6.2软件(AB Sciex)处理。为了定量，通过加权(1/x2)线性最小二乘回归将分析物与内标物的峰面积比与校准标样的浓度进行拟合。校正曲线的斜率和截距用于计算实验样品中的未知浓度。当使用衍生化步骤2或衍生化步骤3衍生所述样品时，产生用于定量以下的示例离子分别列于表4和表5中：乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸和异柠檬酸。母离子列在“母离子(m/z)”列下，本实施例中用于定量的子离子列在“定量子离子(m/z)”列中。本实施例中用于定量的子离子的选择针对整个分析测量范围内的灵敏度进行了优化；然而，在实施例中，可以选择其他子离子来代替或增加用于定量的子离子。
表4.使用衍生化程序2衍生化的分析物的母离子和子离子的质荷比(m/z)
表5.使用衍生化程序3衍生化的分析物的母离子和子离子的质荷比(m/z)
实施例2：实验样品中SCFA分析物的测量
使用实施例1中描述的方法，使用衍生化方法2测量样品中的SCFA。该方法用于测定各种样品类型的包括血浆、血清、尿液、粪便、母乳、唾液和细菌培养上清的SCFA分析物乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)的绝对量。
在另一个实例中，在59个血浆样品中测量了8种SCFA分析物。在表6中呈现了代表性样品的结果。
在另一个实例中，在120个血清样品中测量了8种SCFA分析物。在表6中呈现了代表性样品的结果。
在另一个实例中，在50个尿液样品中测量了8种SCFA分析物。在表6中呈现了代表性样品的结果。
在另一个实例中，在197个粪便样品中测量了8种SCFA分析物。在表6中呈现了代表性样品的结果。
在另一个实例中，在140个母乳样品中测量了8种SCFA分析物。在表6中呈现了代表性样品的结果。
在另一个实例中，在52个唾液样品中测量了8种SCFA分析物。在表6中呈现了代表性样品的结果。
在另一个实例中，在102个细菌培养物上清液样品中测量了8种SCFA分析物。在表6中呈现了代表性样品的结果。
表6.代表性样品的结果。

Claims (30)

1.一种通过质谱确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的方法，所述一种或多种分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、异丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组，其中运行时间少于六分钟，所述方法包括：
a)在适于从所述一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将所述样品置于电离源作用下，其中在电离之前将所述一种或多种分析物衍生化；
b)在单次进样中通过质谱测量来自所述一种或多种分析物中的每一种分析物的一种或多种离子的量；和
c)使用所述一种或多种离子的测量量来确定所述样品中所述一种或多种分析物中的每一种分析物的量。
2.一种通过质谱确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的方法，所述一种或多种分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、异丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)及其组合组成的组，其中运行时间少于六分钟，所述方法包括：
a)在适于从所述一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将所述样品置于电离源作用下，其中在电离之前将所述一种或多种分析物衍生化；
b)在单次进样中通过质谱测量来自所述一种或多种分析物中的每一种分析物的一种或多种离子的量；和
c)使用所述一种或多种离子的测量量来确定样品中所述一种或多种分析物中的每一种分析物的量。
3.一种通过质谱确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的方法，所述一种或多种分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、异丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)及其组合组成的组，其中消除了新戊酸的干扰，所述方法包括：
a.在适于从所述一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将所述样品置于电离源作用下，其中在电离之前将所述一种或多种分析物衍生化；
b.在单次进样中通过质谱测量来自所述一种或多种分析物中的每一种分析物的一种或多种离子的量；和
c.使用所述一种或多种离子的测量量来确定所述样品中所述一种或多种分析物中的每一种分析物的量。
4.一种通过质谱确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在或量的方法，所述一种或多种分析物选自由乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组，其中运行时间少于六分钟，所述方法包括：
a.在适于从所述一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将所述样品置于电离源作用下，其中在电离之前将所述一种或多种分析物衍生化；
b.在单次进样中通过质谱测量来自所述一种或多种分析物中的每一种分析物的一种或多种离子的量；和
c.使用所述一种或多种离子的测量量来确定所述样品中所述一种或多种分析物中的每一种分析物的量。
5.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中确定两种或更多种分析物的量。
6.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中确定三种或更多种分析物的量。
7.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中确定四种或更多种分析物的量。
8.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中确定五种或更多种分析物的量。
9.根据权利要求5所述的方法，其中
所述两种或更多种分析物之一选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)、异丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸(异己酸)组成的组；并且
所述两种或更多种分析物之一选自由乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述两种或更多种分析物之一是丙酮酸。
11.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中使用至少2,4-二氟苯基肼盐酸盐或3-硝基苯基肼盐酸盐来衍生所述样品。
12.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中使用至少2,4-二氟苯基肼盐酸盐来衍生所述样品并且其中手术样品是粪便样品。
13.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中使用至少3-硝基苯基肼盐酸盐来衍生所述样品并且其中所述样品是血浆样品。
14.根据权利要求11所述的方法，其中选自由EDC盐酸盐、1-羟基苯并三唑、N，N'二异丙基碳二亚胺(DIC)和二环己基碳二亚胺(DCC)组成的组的一种或多种偶联催化剂也用于衍生。
15.根据权利要求6所述的方法，其中确定乙酸(C2)、丙酸(C3)和丁酸(C4)的量。
16.根据权利要求7所述的方法，其中确定乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸(C4)和乳酸的量。
17.根据权利要求7所述的方法，其中确定乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)和丁酸(C4)的量。
18.根据权利要求7所述的方法，其中确定乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)和己酸(己酸，C6)的量。
19.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中质谱仪以负模式运行。
20.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中所述样品在经受电离源之前已通过液相色谱纯化。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述液相色谱选自由高性能液相色谱、超高性能液相色谱和湍流液相色谱组成的组。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述样品在经受电离源之前已通过高性能液相色谱或超高性能液相色谱进行了纯化。
23.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中内标用于确定所述样品中所述一种或多种分析物的量。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述内标包含一种或多种待测分析物中至少一种分析物的同位素标记类似物。
25.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中所述样品包括生物样品。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述样品选自由血液、血浆、尿液、粪便、细菌培养上清液、血清、母乳、唾液和组织组成的组。
27.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中用于确定所述一种或多种分析物中每一种分析物的量的所述一种或多种离子是选自表4和表5中的离子中的一种或多种离子。
28.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中质谱是串联质谱。
29.一种试剂盒，其包含一种或多种同位素标记的类似物作为一种或多种分析物中的每一种分析物的内标以及包装材料和使用该试剂盒的说明，所述一种或多种分析物选自由乙酸(C2)、丙酸(C3)、异丁酸(C4)、丁酸(C4)、2-甲基丁酸(C5)、异戊酸(C5)、戊酸(C5)、己酸(己酸，C6)、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮基戊二酸、乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸及其组合组成的组。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其进一步包含衍生试剂、催化剂试剂、校准标准品或质量参比样品。
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