JP2016006420A - 唾液試料の調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】被験者から一定量の唾液を採取し、保存安定性と取扱い性に優れた唾液試料を調製する方法、及び当該方法により得られた唾液試料から有機酸を検出する方法の提供。
【解決手段】唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させる乾燥工程と、を有し、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させる、又は前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材から、所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収することにより、所定量の唾液に由来する固形分が唾液吸収部材に乾燥状態で保持された唾液試料を調製することを特徴とする、唾液試料の調製方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、被験者から一定量の唾液を採取し、保存安定性と取扱い性に優れた唾液試料を調製する方法、及び当該方法により得られた唾液試料から有機酸を検出する方法に関する。

唾液は、非侵襲的に容易に採取可能な生体試料であり、唾液中の有機酸等の生体分子の中にはバイオマーカーとして機能し得るものがある。このため、血液と同様、唾液も臨床検査等の検体として有用である。唾液は、通常、流涎として容器に採取されたり、濾紙やスワブに吸収させることにより採取される。唾液を採取するスワブとしては、例えば、唾液を採取し、その後放出するためのアプリケーターと海島バイコンポーネント繊維を含有するスワブ（例えば、特許文献１参照。）や、採取した唾液を培地等に擦り付けることによって放出可能なスワブ（例えば、特許文献２参照。）が開示されている。また、ＤＮＡを解析するための生体試料を採取するために使用されるスワブであって、乾燥剤と共に収納されるスワブ（例えば、特許文献３参照。）も開示されている。

一方で、生体試料中の有機酸の中には、バイオマーカーとして有用なものがあり、これらの測定方法が開示されている。例えば、肝臓での脂肪酸異化を評価するバイオマーカーとして有用な３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）の定量には、ＮＡＤとＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを添加した後にＮＡＤＨを検出する酵素分光光度法が使用されている（例えば、非特許文献１又は２参照。）。その他にもＮＡＤＨの定量方法としては、３ＨＢをアセト酢酸（ＡＡ）に酵素変換した後にｐ−ニトロベンゼンジアゾニウムフルオロホウ酸で誘導体化し、この誘導体を、分光光度又は紫外線により検出する高感度ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）アッセイにより定量する方法が報告されている（例えば、非特許文献３又は４参照。）。また、３−ＨＢを直接検出する方法としては、誘導体化後にガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法により検出する方法（例えば、非特許文献５又は６参照。）や、誘導体化せずに、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）法（ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によって検出する方法（例えば、非特許文献７参照。）も報告されているが、これらの方法の検出感度は、酵素分光光度法と同様に低い。

一方で、消化器疾患患者において、代謝・消化・吸収能低下あるいは栄養過多状態により、栄養代謝異常が生じる。多くの消化器疾患では、糖・脂質代謝異常がみられるため、エネルギー供給源としてアミノ酸の重要性が高い。特に分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ：バリン、ロイシン、イソロイシン）は、飢餓や低栄養状態、長時間運動や代謝疾患時に、糖質・脂質に代わって骨格筋のミトコンドリア内で異化され、エネルギー源となる。骨格筋で異化されたＢＣＡＡは、アセチルＣｏＡやスクシニルＣｏＡに代謝される。ＢＣＡＡは、ミトコンドリア内で共通の酵素反応によって、ミトコンドリア膜を通過できないＣｏＡが結合される。具体的には、ＢＣＡＡは、ミトコンドリア内でＢＣＡＴ（ＢＣＡＡアミノ基転移酵素）とＢＣＫＤＨ ｃｏｍｐｌｅｘ（分岐鎖αケト酸脱水素酵素複合体）によって、分岐鎖αケト酸（バリンからα−ケトイソ吉草酸へ、ロイシンからα−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）へ、イソロイシンからα−ケト−β−メチル吉草酸へ）を経て、ＣｏＡ体（α−ケトイソ吉草酸からイソブチリルＣｏＡへ、ＫＩＣからイソバレリルＣｏＡへ、α−ケト−β−メチル吉草酸からα−メチルブチリルＣｏＡへ）に代謝される。ＢＣＡＡの異化過程では、ＣｏＡの結合が必須であるが、バリンのみは、異化経路の途中で、特異的酵素反応によってＣｏＡが一旦外され、中間代謝産物の３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）ができる。ＣｏＡが結合していない３−ＨＩＢは、分子量が小さいためミトコンドリア膜を通過し、一部が細胞外へ漏出する。実際に、飢餓状態や肝硬変患者では、骨格筋の萎縮と共に血清３−ＨＩＢ濃度が上昇する。

このことから、３−ＨＩＢは骨格筋におけるアミノ酸異化状態を反映する指標、すなわち骨格筋におけるＢＣＡＡ異化マーカーとしての利用が期待される。しかしながら、生体試料中の微量の３−ＨＩＢを充分な感度で検出できる方法は、現在までには報告されていない。例えば、３−ＨＩＢを直接検出する方法としては、誘導体化せずに、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法（ＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によって検出する方法（例えば、非特許文献７参照。）が報告されているが、当該方法は感度が低いため、例えば血清中の３−ＨＩＢを検出するためには多量の血清を必要とする。また、ＧＣ−ＭＳ法により、血液中の３−ＨＢを検出した場合には、３−ＨＩＢは３−ＨＢとはクロマトグラフィーによっては分離できなかったことが報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。

３−ＨＢや３−ＨＩＢ以外の有機酸の検出方法としては、マロン酸をジ−（１−メチル−３−ピペリジニル）マロン酸に誘導体化した後、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によって検出する方法（例えば、非特許文献９参照。）が報告されている。当該方法では、マロン酸にアミン残基を導入してマロン酸エステルとすることにより、イオン化が促進され、検出感度が顕著に増大した。

また、ＢＣＡＡの１つであるロイシンの代謝産物として、３−ヒドロキシイソ吉草酸（３−ＨＭＢ）が挙げられる。ロイシンは、他のＢＣＡＡと同様にミトコンドリア内でＫＩＣを経てＣｏＡ体（イソバレリルＣｏＡ）に代謝されるが、ＫＩＣの５〜１０％程度がミトコンドリア膜を通過し、細胞質内においてＫＩＣ−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅによって３−ＨＭＢに代謝される。３−ＨＭＢの作用としては、ｍＴＯＲ経路により蛋白合成促進、ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制による蛋白質分解抑制、ＨＭＢ−ＣｏＡから変換されたヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）によるコレステロール合成促進による筋鞘安定化等が知られている。これらの作用により、３−ＨＭＢは、ＢＣＡＡ由来の肝臓蛋白（アルブミン等）合成マーカーや骨格筋肥大のマーカーとしての利用が期待される。実際に、３−ＨＭＢは筋肉増強効果を目的としたサプリメントとして利用されていることから、３−ＨＭＢを摂取した場合の血中動態を検討するため、３−ＨＭＢ摂取後のラットの血中３−ＨＭＢ濃度を、誘導体化せずにＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって測定したことが報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。また、ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）−ＭＳ／ＭＳにより、３−ＨＢと３−ＨＭＢを誘導体化せずに同時測定する方法も報告されているが、当該測定方法では、３−ＨＭＢの検出限界は０．４μＭであり、生体試料中（血液や唾液など）の３−ＨＭＢは、３−ＨＢや３−ＨＭＢより微量であるため、より高感度に検出する方法が求められている（例えば、非特許文献１１参照。）。

また、３−ＨＢ等と構造類似の有機酸として、２−ヒドロキシ酪酸（２−ＨＢ）がある。２−ＨＢは、スレオニンとメチオニンの代謝産物であるαケト酪酸が、ＮＡＤＨ依存性のＬＤＨやＬＤＨのアイソザイムである２−ＨＢ脱水素酵素（α−ＨＢＤＨ）による異化反応の副産物として生成される。また、αケト酪酸は、スクシニルＣｏＡの前駆体であるプロピオニルＣｏＡに代謝されることから、２−ＨＢの上昇は、ＬＤＨやα−ＨＢＤＨによるαケト酪酸の異化亢進か、αケト酪酸からプロピオニルＣｏＡへの代謝不全によって生じる。さらに、αケト酪酸は、強力な抗酸化物質であるグルタチオンの前駆体アミノ酸であるシステインがシスタチオンより代謝される際の副産物としても産生されるため、グルタチオンの生成とも関連している。２−ＨＢは、非糖尿病者のインスリン抵抗性やグルコース不耐性を予測する早期マーカーとして利用できるとの報告がある（例えば、非特許文献１２参照。）。これは、インスリン抵抗性やグルコース不耐性発症には、肝臓での脂質過酸化や酸化ストレスが関与しており、肝臓でのグルタチオン生成亢進や脂質過酸化に伴うＮＡＤＨやＮＡＤ^＋の増加によるものと考えられる。この検討では、ＵＨＰＬＣ−ＭＳやＨＩＬＩＣ−ＭＳ／ＭＳ装置にて、血清中や全血中の２−ＨＢを測定しているが、血清中の濃度（１μｇ／ｍＬ＝約９．６μＭ以上）より微量な生体試料（唾液など）での測定は、これまで検討されていない（例えば、非特許文献１１及び非特許文献２参照。）。

特開２０１４−１６３６７号公報 特表２００７−５２３６６３号公報 特開２０１４−１０１３２号公報

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本発明は、被験者から一定量の唾液を採取し、保存安定性と取扱い性に優れた唾液試料を調製する方法、及び当該方法により得られた唾液試料から有機酸を検出する方法の提供を目的とする。

すなわち、本発明は、下記［１］〜［９］の唾液試料の調製方法、下記［１０］〜［１４］の有機酸の検出方法、下記［１５］の有機酸濃度の経時的変化の測定方法を提供するものである。
［１］ 本発明に係る第一の唾液試料の調製方法は、唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させる乾燥工程と、を有し、前記吸収工程において、（ｉ）前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させること、又は（ｉｉ）前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材から、所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収することにより、所定量の唾液に由来する固形分が唾液吸収部材に乾燥状態で保持された唾液試料を調製することを特徴とする。
［２］ 前記［１］の唾液試料の調製方法においては、前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を唾液に接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている領域から、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収することが好ましい。
［３］ 前記［１］又は［２］の唾液試料の調製方法においては、前記唾液が、液体状態で唾液容器に収容されているものであることが好ましい。
［４］ 前記［１］又は［２］の唾液試料の調製方法においては、前記吸収工程を、前記唾液吸収部材を被検者の口腔内において唾液と接触させることにより行うことが好ましい。
［５］ 前記［４］の唾液試料の調製方法においては、前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、被検者の口腔内において唾液と直接接触していなかった領域であり、かつ吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている領域から、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収することが好ましい。
［６］ 前記［１］〜［５］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記乾燥工程前に、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材に、抗菌剤を含有させることが好ましい。
［７］ 前記［１］〜［３］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記吸収工程において、唾液と抗菌剤の混合物を前記唾液吸収部材に吸収させることが好ましい。
［８］ 前記［１］〜［３］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記唾液吸収部材が、予め抗菌剤を保持していることが好ましい。
［９］ 本発明に係る第二の唾液試料の調製方法は、唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を、抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させる抗菌剤処理工程と、を有し、前記吸収工程において、（ｉ）前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させること、又は（ｉｉ）前記吸収工程後、前記唾液吸収部材から所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収したものを、前記抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させることにより、所定量の唾液に由来する固形分と唾液吸収部材を含有する溶液である唾液試料を調製することを特徴とする。
［１０］ 前記［６］〜［９］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記抗菌剤が、第四級アンモニウム塩系抗菌剤であることが好ましい。
［１１］ 前記［１］〜［１０］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記吸収工程において前記唾液吸収部材に吸収させる唾液量が、前記唾液吸収部材の最大吸収量であることも好ましい。
［１２］ 前記［１］〜［１１］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記所定量が、１〜５０μＬであることが好ましい。
［１３］ 前記［１］〜［１２］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記唾液吸収部材が、合成樹脂繊維からなることが好ましい。
［１４］ 前記［１］〜［８］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記乾燥工程における乾燥が、自然乾燥であることが好ましい。
［１５］ 本発明に係る唾液中の有機酸の検出方法は、前記［１］〜［１４］のいずれかの唾液試料の調製方法により得られた唾液試料を、極性有機溶剤に浸漬させることにより、前記唾液試料から唾液由来の有機酸を抽出する抽出工程と、前記抽出工程の後、有機酸が抽出された極性有機溶剤を、唾液由来有機酸検出用試料として、前記唾液試料から分離して回収する回収工程と、前記回収工程により回収された唾液由来有機酸検出用試料中の有機酸を下記一般式（１）−１〜（１）−３（式（１）−１〜３中、Ｒ^１及びＲ^２は、一方が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。）のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体を、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）法により検出する検出工程と、を有することを特徴とする。

［１６］ 前記［１５］の唾液中の有機酸の検出方法においては、前記極性有機溶剤が、アセトニトリルであることが好ましい。
［１７］ 前記［１５］又は［１６］の唾液中の有機酸の検出方法においては、前記抽出工程において、前記唾液試料を、予め内部標準物質を含有させた極性有機溶剤に浸漬させることが好ましい。
［１８］ 前記［１５］〜［１７］のいずれかの唾液中の有機酸の検出方法においては、前記誘導体化試薬が２−ピリジンメタノール、１−ピペリジンエタノール、及び２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［１９］ 前記［１５］〜［１８］のいずれかの唾液中の有機酸の検出方法においては、前記有機酸が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、２−ヒドロキシ酪酸、及び乳酸からなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［２０］ 本発明に係る有機酸濃度の経時的変化の測定方法は、同一の被験者から経時的に調製された複数の唾液試料に対して、前記［１５］〜［１９］のいずれかの唾液中の有機酸の検出方法を行い、前記被験者の唾液中の有機酸濃度の経時的変化を調べることを特徴とする。

本発明に係る唾液試料の調製方法により、簡便に、被験者から一定量の唾液を採取し、保存安定性と取扱い性に優れた唾液試料を調製することができる。
また、本発明に係る有機酸の検出方法や有機酸濃度の経時的変化の測定方法は、本発明に係る唾液試料の調製方法により調製された唾液試料中の有機酸を、特定の誘導体化試薬を用いて誘導体化した後にＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって検出する方法であり、これらの方法により、極少量の唾液から、３−ＨＩＢや３−ＨＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、乳酸等の有機酸を高感度に検出することができる。

２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ（２ＰＭ−３−ＨＢ）の典型的なＰ−ＥＳＩ ＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例１において、２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図２ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例１において、２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図２ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例１において、２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ １９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図２Ｅの３−ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例２において、１−ピペリジンエタノールで誘導体化された３−ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図３ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例２において、１−ピペリジンエタノールで誘導体化された３−ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図３ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例２において、１−ピペリジンエタノールで誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ ２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図３Ｅの３−ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例３において、２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンで誘導体化された３−ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図４ＡのＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例３において、２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンで誘導体化された３−ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を示した図である。 図４ＣのＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例３において、２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンで誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ ２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図４Ｅの３−ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例４において、２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ（２ＰＭ−３−ＨＢ）と［^１３Ｃ_４］同位体の典型的なＳＲＭクロマトグラムを示した図である。 参考例５において、２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢと３−ＨＢ−^１３Ｃ_４を含む試料の総イオンクロマトグラム（１段目）、ｍ／ｚ １９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（２段目）、ｍ／ｚ ２００を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（３段目）、ｍ／ｚ ２１０を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラム（４段目）を示した図である。 参考例６において、採血後室温で放置された血清中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度の測定結果を示した図である。 参考例６において、採取後室温で放置された唾液中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度の測定結果を示した図である。 参考例７において、３−ＨＢの血清中濃度と唾液（流涎）中濃度の相関性を調べた結果を示した図である。 参考例７において、３−ＨＩＢの血清中濃度と唾液（流涎）中濃度の相関性を調べた結果を示した図である。 参考例７において、２−ＨＢの血清中濃度と唾液（流涎）中濃度の相関性を調べた結果を示した図である。 参考例８において、被験者の運動と食事状況、及び血液、唾液、尿の採取時点を示した図である。 参考例８において、被験者の血清中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度の経時的変化を示した図である。 参考例８において、被験者の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの各採取時点における単位時間当たり尿排泄量（μｍｏｌ／ｈ）の経時的変化を示した図である。 参考例８において、被験者の唾液中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度の経時的変化を示した図である。 参考例９において、肝硬変患者群と健常者群の血清中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度の測定結果を示した図である。 参考例９において、肝硬変患者群と健常者群の唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度の測定結果を示した図である。 実施例１において使用したシルマー濾紙１の模式図である。 実施例１において、容器内の流涎にシルマー濾紙の先端部（唾液と接触させる領域側の端部）から１０ｍｍまでの領域を浸漬させ、毛細管現象により唾液を吸い上げた１０本のシルマー濾紙を３つの断片（採取部位（１）〜（３））に分け、各断片から測定した４種類の有機酸（３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、２−ＨＢ及び３−ＨＭＢ）の濃度のばらつき（変動係数、％ＣＶ）を算出した結果を示した図である。 実施例２において、被験者の舌下に、シルマー濾紙の先端部（唾液と接触させる領域側の端部）から１０ｍｍまでの領域のみを接触させて毛細管現象により唾液を吸い上げた１０本のシルマー濾紙を３つの断片（採取部位（１）〜（３））に分け、各断片から測定した４種類の有機酸（３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、２−ＨＢ及び３−ＨＭＢ）の濃度のばらつき（変動係数、％ＣＶ）を算出した結果を示した図である。 実施例３において、シルマー濾紙に染み込ませた唾液中のＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩の濃度を、シルマー濾紙の乾燥時間ごとに示した図である。 実施例３において、シルマー濾紙に染み込ませた唾液中の３−ＨＢの濃度を、シルマー濾紙の乾燥時間ごとに示した図である。 実施例３において、シルマー濾紙に染み込ませた唾液中の３−ＨＭＢの濃度を、シルマー濾紙の乾燥時間ごとに示した図である。 実施例４において、唾液、及び唾液を吸収させて２０分間自然乾燥させた各濾紙から測定したＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩の濃度を示した図である。 実施例４において、唾液、及び唾液を吸収させて２０分間自然乾燥させた各濾紙から測定した３−ＨＢの濃度を示した図である。 実施例４において、唾液、及び唾液を吸収させて２０分間自然乾燥させた各濾紙から測定した３−ＨＩＢの濃度を示した図である。 実施例４において、唾液、及び唾液を吸収させて２０分間自然乾燥させた各濾紙から測定した３−ＨＭＢの濃度を示した図である。 実施例４において、唾液、及び唾液を吸収させて２０分間自然乾燥させた各濾紙から測定した２−ＨＢの濃度を示した図である。 参考例１０において、２−ピペリジンエタノールで誘導体化された乳酸とその重水素同位体を含む試料のｍ／ｚ １８２．１を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを示した図である。 図２６Ａの２−ピペリジンエタノールで誘導体化された乳酸ピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを示した図である。 参考例１０において、２−ピリジンメタノールで誘導体化されたＤ−乳酸（標品）とその重水素同位体の典型的なＳＲＭクロマトグラムを示した図である。 参考例１０において、２−ピリジンメタノールで誘導体化された唾液由来の乳酸とその重水素同位体の典型的なＳＲＭクロマトグラムを示した図である。 参考例１１において、室温における唾液中の有機酸濃度の経時的変化を示した図である。 参考例１２において、各種添加剤を添加して室温で２４時間放置した唾液中の有機酸濃度の測定結果を示した図である。 参考例１３において、乳酸の血清中濃度と唾液（流涎）中濃度の相関性を調べた結果を示した図である。

＜第一の唾液試料の調製方法＞
本発明に係る唾液試料の調製方法は、所定量の唾液に由来する固形分が唾液吸収部材に乾燥状態で保持された唾液試料を調製することを特徴とする。当該調製方法により調製された唾液試料は、乾燥状態であるため、臨床検査等に供されるまでの間、室温や外気温中で保存した場合であっても、唾液中の各種生体分子が安定して維持される。また、液状の唾液をそのまま容器等に回収して保存する場合よりも、保管や移送等が容易であり、取扱い性にも優れている。さらに、当該調製方法により調製された唾液試料は、予め定められた所定量の唾液に由来する固形分を含有しているため、当該調製方法により調製された複数の唾液試料について同一の検査方法に供することにより、試料ごとの測定のばらつきを抑えることができる上に、ノーマライズ処理を行うことなく、各唾液試料に含有されている生体分子の含有量同士を直接比較することができる。

なお、唾液に由来する固形分とは、唾液から水分を除いた残りの成分を意味する。すなわち、当該固形分には、有機酸、核酸、蛋白質、糖類、多糖類、糖蛋白質、脂質等が含まれる。

所定量の唾液に由来する固形分を含有する唾液試料を調製するために、本発明に係る唾液試料の調製方法は、具体的には、唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させる乾燥工程と、を有し、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させる、又は前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材から、所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収する。

前記吸収工程において、唾液吸収部材に吸収させる唾液は、唾液吸収部材を被検者の口腔内において唾液と接触させることによって被験者の口腔内から直接採取されたものであってもよく、容器に収容された液体状態の唾液（流涎）であってもよい。流涎は、被験者が容器に直接垂れ流して採取したものであってもよく、他の手段で採取されたものを容器に収容したものであってもよい。例えば、唾液吸収部材を口腔内に含む、又は唾液吸収部材の少なくとも一部を口にくわえて毛細管現象によって唾液を吸い上げる等により、当該唾液吸収部材に唾液を吸収させることができる。特に、唾液吸収部材が短冊状や棒状の場合には、被験者が寝たままの姿勢である場合や、運動を継続している場合であっても、被験者から容易に唾液を採取することができる。また、例えば、容器に採取された流涎に、唾液吸収部材を浸漬させることにより、又は唾液吸収部材の一部を接触させて毛細管現象によって唾液を吸い上げることにより、当該唾液吸収部材に唾液を吸収させることができる。

前記吸収工程において、唾液吸収部材に吸収させる唾液の量は特に限定されるものではないが、口腔内で唾液吸収部材を湿らせることにより採取可能な程度の量であることが好ましい。具体的には、１００μＬ以下が好ましく、１〜５０μＬがより好ましく、１０〜５０μＬがさらに好ましい。本発明に係る唾液試料の調製方法においては、唾液の採取を、極少量の唾液を唾液吸収部材に吸収させることにより行うため、子供や老人、患者等のように唾液量の少ない被検者や、運動中の被験者からも、必要量の唾液を、安全かつ迅速に採取することができる。

本発明に係る唾液試料の調製方法において用いられる唾液吸収部材としては、液性成分を吸収可能な多孔質部材であればよく、唾液や涙液等の液性成分を含む生体試料の採取に使用される多孔質部材の中から適宜選択して用いることができる。中でも、濾紙やスワブを用いることが好ましい。また、当該唾液吸収部材の形状は特に限定されるものではなく、塊状であってもよく、短冊状であってもよく、棒状であってもよい。さらに、例えば、唾液を吸収しない棒状の部材の先端部に、唾液吸収部材であるスワブを結合させた部材のように、唾液吸収部材と唾液を吸収しない部材との複合部材であってもよい。なお、当該唾液吸収部材は、吸収工程に用いられる前に、予めシリカゲルなどの乾燥剤と共に保存する等により乾燥させておくことも好ましい。

前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、一方の端部を被検者が口にくわえて毛細管現象によって当該唾液吸収部材に唾液を吸い上げる場合には、当該唾液吸収部材に吸収された唾液の量は、被検者が口にくわえていた端部から吸い上げられた唾液の先端までの距離に依存する。そこで、唾液吸収部材に必要な量の唾液を吸収させたことが可視化できるように、予め、唾液吸収部材の被検者が口にくわえる端部から所定の距離の位置に、唾液と接触すると可視化する色素を保持させておくことも好ましい。

本発明に係る唾液試料の調製方法において用いられる唾液吸収部材の素材としては、例えば、綿、ウール、絹、麻、リグノセルロース、デンプン、デキストラン等の天然素材であってもよく、アクリル、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリビニルアルコール、レーヨン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ＡＢＳ（アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン）樹脂、又はこれらを適宜組み合わせた混合物等の合成樹脂繊維であってもよく、ガラス繊維、シリカゲル、活性白土、ケイソウ土、炭素粉末、活性アルミナ等の無機素材であってもよい。本発明において用いられる唾液吸収部材の素材としては、唾液を吸収させた後に乾燥させやすいことから、合成樹脂繊維や無機素材が好ましく、さらに、唾液の吸収性が高いことから、合成樹脂繊維がより好ましい。

吸収工程の後、乾燥工程として、当該吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させる。乾燥方法は、唾液吸収部材に吸収させた唾液中の有機酸等の生体成分を損なうことなく水分を除去し得る方法であれば特に限定されるものではなく、自然乾燥させてもよく、温風乾燥させてもよく、減圧乾燥させてもよく、凍結乾燥させてもよい。本発明においては、特別な乾燥装置を要することなく簡便に乾燥させられることから、自然乾燥することが好ましい。

当該乾燥工程においては、唾液を吸収させた唾液吸収部材の表面に紙等を接触させた場合に、当該紙に水分がにじまない程度に十分に乾燥させることが好ましい。乾燥時の温度や乾燥時間等の条件は、唾液吸収部材の素材や乾燥方法に応じて適宜調整できる。例えば、唾液吸収部材の素材が綿セルロースであり、２０〜２５℃の環境下で自然乾燥する場合には、乾燥時間は２４時間以上が好ましく、４８時間以上がより好ましい。唾液吸収部材の素材が合成樹脂繊維であり、２０〜２５℃の環境下で自然乾燥する場合には、乾燥時間は２０分間以上が好ましく、１時間以上がより好ましい。

本発明に係る唾液試料の調製方法において得られた唾液試料は、唾液中に含まれている生体分子の分析に用いられる。分析方法によっては、当該唾液試料から分析対象の生体分子を有機溶媒により抽出するが、唾液吸収部材の水分含有率が高い場合には、極性有機溶剤が十分に浸透せず、唾液由来の有機酸が抽出され難くなるおそれがある。このため、当該乾燥工程においては、特に、乾燥後の唾液吸収部材の水分含有率が、当該唾液吸収部材を極性有機溶剤に浸漬させた場合に、当該唾液吸収部材の中心部にまで極性有機溶剤が浸透可能な程度に低くなるまで乾燥させることが好ましい。

乾燥工程後の唾液吸収部材は、分析に供されるまでの間、室温等の特段の温度調節を行わない環境下で保管することができる。乾燥された唾液吸収部材は、乾燥剤と保管しておくことも好ましい。また、乾燥工程を自然乾燥にて行う場合、唾液を吸収させた唾液吸収部材を、シリカゲルなどの乾燥剤と共に室温環境下で放置して自然乾燥させることが好ましい。

本発明に係る唾液試料の調製方法においては、前記吸収工程において、唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させることにより、予め定められた一定の量の唾液由来の固形分が保持された唾液試料を調製することができる。例えば、唾液吸収部材の最大吸収量を、当該所定量になるように調節し、吸収工程において唾液吸収部材に対し限界まで（すなわち、それ以上唾液を吸収できなくなるまで）吸収させる。一定の大きさの唾液吸収部材を用いることにより、常に一定の量の唾液を採取することができる。

本発明に係る唾液試料の調製方法においては、前記乾燥工程後の唾液吸収部材から、所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収することによっても、予め定められた一定の量の唾液由来の固形分が保持された唾液試料を調製することができる。例えば、唾液吸収部材が短冊状又は棒状の場合には、唾液吸収部材の一方の端部を唾液に接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させることができる（吸収工程）。毛細管現象を利用するため、吸収工程において予め定めてある一定の量の唾液のみを唾液吸収部材に吸収させることは困難であるが、唾液吸収部材に吸収されている唾液量は原則として唾液吸収部材中の唾液が吸い上げられた体積に比例する。また、短冊状又は棒状のように厚みが一定の唾液吸収部材においては、吸収されている唾液量は原則として唾液吸収部材中の唾液が吸い上げられた面積に比例する。このため、乾燥工程後の唾液吸収部材の唾液が吸い上げられた領域から所定の面積分又は体積分の領域を切り出すことにより、常に所定量の唾液由来の固形分が保持された唾液吸収部材が得られる。この切断して回収された唾液吸収部材が、目的の唾液試料である。

乾燥工程後の短冊状又は棒状の唾液吸収部材から切断して回収される領域は、当該唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、吸い上げられた唾液の先端から離れた領域であることが好ましい。毛細管現象により唾液吸収部材中を吸い上げられた唾液の先端近傍では、単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液吸収部材に吸収された唾液量にばらつきが生じやすく、当該先端近傍を含む唾液試料では、乾燥前に吸収されていた唾液量にばらつきが生じやすいためである。本発明においては、乾燥工程後の短冊状又は棒状の唾液吸収部材から切断して回収される領域は、吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている領域であることが好ましく、吸い上げられた唾液の先端から１０ｍｍ以上離れている領域であることがより好ましい。

別の容器に収容されている流涎に短冊状又は棒状の唾液吸収部材の一方の端部を浸漬させて毛細管現象により唾液を吸収させた場合には、吸い上げられた唾液の先端近傍以外は、単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液吸収部材に吸収された唾液量はほぼ均一であるから、吸い上げられた唾液の先端近傍以外の領域であれば、唾液試料として切断して回収する領域は、唾液に浸漬させていた領域を含んでいてもよく、唾液に浸漬させていなかった領域のみであってもよい。一方で、唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させた場合には、前記乾燥工程後の唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、被検者の口腔内において唾液と直接接触していなかった領域であり、かつ吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上、好ましくは１０ｍｍ以上離れている領域から、所定の面積分又は体積分の領域を切断し、唾液試料として回収する。唾液吸収部材のうち、被検者の口内で唾液に直接接触していた領域では、単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液吸収部材に吸収された唾液量にばらつきが生じやすく、唾液と直接接触していなかった領域のほうが、単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液の吸収量が均一である可能性が高いためである。唾液と直接接触していた領域における単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液の吸収量にばらつきが大きくなる理由としては、口腔内において唾液吸収部材に直接触れる唾液量や、唾液吸収部材において唾液と直接接触した領域が占める割合にばらつきがあることや、被験者の口腔内表面との物理的な接触により唾液吸収部材が変形することによる影響があることが考えられる。

唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させる場合には、口腔内において唾液と直接接触する表面積が常に一定となるように、予め、唾液吸収部材の表面の一部を撥水性の部材により被覆しておく等により、唾液吸収部材に、口腔内に入れた場合でも唾液が直接接触しない領域（非接触領域）を設けておくことも好ましい。撥水性の部材としては、例えば、アルミホイル等の金属箔、パラフィン紙、合成樹脂フィルム等が挙げられる。

本発明に係る唾液試料の調製方法により得られた唾液試料は、唾液中の生体成分の検査等に用いることができる。このため、本発明において用いられる唾液吸収部材には、予め、唾液試料が供される検査において内部標準物質となり得る物質を含有させておいてもよい。当該内部標準物質としては、検査対象の物質の放射性同位体等が挙げられる。例えば、唾液吸収部材に内部標準物質が溶解した溶液を染み込ませた後、充分に乾燥させることによって、内部標準物質を唾液吸収部材中に保持させることができる。内部標準物質は、唾液吸収部材のうち、被検者の口腔内において唾液と直接接触しない非接触領域に保持させておくことが好ましい。

本発明に係る唾液試料の調製方法を用いることにより、少量ではあるが常に一定量の唾液が保持された唾液試料を、被検者から比較的簡便に調製することができる。さらに、調製された唾液試料は、乾燥された状態であり、長期保存や郵送等が容易であるため、唾液の採取時や採取場所と、唾液試料の分析時や分析場所が離れている場合の試料としても好ましい。本発明に係る唾液試料の調製方法は、多数の被験者の唾液中の生体成分を分析するための唾液試料を調製する場合や、唾液中の生体成分の経時的変化を調べる（モニタリングする）ために同一の被験者から経時的に唾液試料を調製する場合に特に適している。

本発明に係る唾液試料の調製方法により得られた唾液試料は、１００μＬ以下、好ましくは１〜５０μＬという極少量の唾液中の生体分子を分析し得るような、高感度の分析方法に供される試料として好適である。特に、１〜５０μＬの唾液に含有されている唾液中の有機酸を分析するための試料として好適であり、中でも、３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）、３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）、３−ヒドロキシイソ吉草酸（３−ＨＭＢ）、２−ヒドロキシ酪酸（２−ＨＢ）、及び乳酸からなる群より選択される１種以上を分析するための試料として好適である。

本発明に係る唾液試料の調製方法においては、唾液試料中の唾液由来の固形分は、抗菌剤と共存させておくことが好ましい。唾液中における２−ＨＢ及び乳酸は、３−ＨＢ等に比べて保存安定性が低いが、抗菌剤と共存させることにより、唾液試料中の２−ＨＢ及び乳酸をより安定して保存させることができる。抗菌剤としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌類や酵母様真菌に対して、生育や増殖を抑制する作用や死滅させる作用を有する物質であれば特に限定されるものではなく、抗菌剤や消毒薬として用いられている各種抗菌剤の中から適宜選択して用いることができる。当該抗菌剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等の第四級アンモニウム塩系抗菌剤、次亜塩素酸ナトリウム等の塩素類、過酸化水素水、ポビドンヨード等のヨウ素剤、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。本発明においては、一般的に唾液中に含まれている細菌類等の細胞膜を変質・損傷させる活性が高く、抗菌活性が高い点から、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等の第四級アンモニウム塩系抗菌剤が好ましい。また、多くの細菌類は、酸性環境下では死滅したり、生育や増殖が抑制されるため、唾液のｐＨを４．０以下にまで低下させることができる濃度の酸類を含有する溶液も、本発明において抗菌剤として使用できる。当該酸類としては、塩酸等の無機酸であってもよく、ギ酸等の有機酸であってもよい。

例えば、前記乾燥工程前に、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材に抗菌剤を含有させることにより、唾液由来の固形分を抗菌剤と共存させた状態で唾液吸収部材に保持させることができる。乾燥工程前に、唾液を吸収させた唾液吸収部材に抗菌剤を含有させる方法としては、例えば、唾液吸収部材を抗菌剤溶液（抗菌剤を適当な溶媒に溶解させた溶液）に浸漬させる方法や、唾液吸収部材表面に抗菌剤溶液を噴霧させる方法や、唾液吸収部材の表面に抗菌剤溶液をスポイト等を用いて滴下する方法等が挙げられる。抗菌剤溶液を調製するための溶媒としては、水であってもよく、エタノールやイソプロパノール等のアルコール類であってもよく、水とアルコール類との混合溶媒であってもよく、各種界面活性剤等の抗菌剤の溶解助剤を含有していてもよい。

また、唾液吸収部材に吸収させる前の唾液に抗菌剤を混合させておき、前記吸収工程において、唾液と抗菌剤の混合物を前記唾液吸収部材に吸収させることによっても、唾液由来の固形分を抗菌剤と共存させた状態で唾液吸収部材に保持させることができる。例えば、容器に収容された流涎に、唾液中の抗菌剤濃度が充分な抗菌活性を示すために必要充分な濃度となるように抗菌剤を添加して混合する。また、予め抗菌剤を入れておいた容器に、流涎を採取し、当該容器内において流涎と抗菌剤を混合してもよい。容器に採取された流涎に添加する抗菌剤及び採取用の容器内に予め入れておく抗菌剤は、水等の溶媒に溶解させた抗菌剤溶液であってもよく、粉末状等の固形の抗菌剤であってもよい。目的の抗菌剤濃度への調節が比較的容易であることから、採取用の容器内に予め入れておく抗菌剤としては、固形の抗菌剤であることが好ましく、流涎とより均一に混合しやすい点から粉末状の抗菌剤がより好ましい。採取用の容器に直接流涎を採取する場合には、採取される流涎の量を厳密に調節することは困難な場合が多いが、採取用の容器内に固形の抗菌剤を比較的多量に収容しておくことにより、採取される流涎の量を厳密に調整せずとも、保存安定性を高めるために必要充分な量の抗菌剤と混合させることができる。

唾液を吸収させる前の唾液吸収部材に、予め抗菌剤を保持させておいてもよい。予め抗菌剤を保持させた唾液吸収部材に唾液を吸収させることによって、唾液由来の固形分を抗菌剤と共存させた状態で唾液吸収部材に保持させることができる。例えば、唾液吸収部材を抗菌剤溶液に浸漬させた後に乾燥させる方法や、唾液吸収部材表面に抗菌剤溶液を均一に噴霧した後に乾燥させる方法、唾液吸収部材表面に抗菌剤溶液を均一に塗布した後に乾燥させる方法によって、唾液吸収部材中に抗菌剤を保持させることができる。また、唾液吸収部材中の唾液と直接接触しない非接触領域であって、毛細管現象によって唾液が吸い上げられる領域にのみ、抗菌剤を保持させておいてもよい。特に、予め抗菌剤を保持させた唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて毛細管現象により唾液を吸い上げる場合には、抗菌剤は、唾液吸収部材中の唾液や口腔内に直接接触しない非接触領域に保持させておくことが好ましい。

＜第二の唾液試料の調製方法＞
唾液中の有機酸のうち、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸は、いずれも、前記抗菌剤の存在下で比較的長時間、安定して保存することができる。そこで、唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させることなく、抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させることによっても、唾液由来の有機酸を安定的に含有する唾液試料を調製することができる。具体的には、唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を、抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させる抗菌剤処理工程と、により行う。使用する唾液吸収部材及び抗菌剤は、前記の第一の唾液試料の調製方法で用いられるものと同様のものを用いることができ、吸収工程は、前記の第一の唾液試料の調製方法における吸収工程と同様にして行うことができる。また、抗菌剤処理工程において唾液吸収部材を浸漬させる抗菌剤を含有する溶液としては、前記抗菌剤溶液を用いることができる。

所定量の唾液に由来する固形分を含有する唾液試料を調製するためには、唾液吸収部材のうち、所定量の唾液由来の固形分を保持している部分のみを、抗菌剤溶液に浸漬させる必要がある。このため、吸収工程において、唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させるか、又は吸収工程後の唾液吸収部材から所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収したものを、抗菌剤溶液中に浸漬させる。吸収工程において、唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させる方法や、唾液吸収部材から所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収する方法は、前記の第一の唾液試料の調製方法と同様にして行うことができる。

＜唾液中の有機酸の検出方法＞
本発明に係る唾液中の有機酸の検出方法（以下、「本発明に係る検出方法」ということがある。）は、本発明に係る唾液試料の調製方法により得られた唾液試料中の有機酸を、特定の誘導体化試薬により誘導体化した後にＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって検出することを特徴とする。本発明に係る検出方法では、有機酸を、特定の誘導体化試薬により誘導体化して検出するため、供される唾液試料が１〜５０μＬという極少量の唾液から調製されたものであっても、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、乳酸等（以下、まとめて「３−ＨＢ等」ということがある。）の有機酸を検出することができる。

具体的には、まず、本発明に係る唾液試料の調製方法により得られた唾液試料を、極性有機溶剤に浸漬させることにより、当該唾液試料から唾液由来の有機酸を抽出した後（抽出工程）、有機酸が抽出された極性有機溶剤を、当該唾液試料から分離して回収する（回収工程）。回収された極性有機溶媒は、唾液由来有機酸検出用試料として用いることができる。

当該極性有機溶剤としては、有機酸が溶解可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトン、２−ペンタノン、３−ペンタノン、エタノール、又はメタノール等が挙げられる。当該極性有機溶剤としては、３−ＨＢ等の溶解性が良好であることから、アセトニトリルが好ましい。

唾液中の有機酸を定量的に検出するために、当該唾液由来有機酸検出用試料には、内部標準物質を一定量添加しておくことが好ましい。内部標準物質としては、検出対象の有機酸の安定同位体が挙げられる。当該内部標準物質は、回収工程において回収された極性有機溶媒（唾液由来有機酸検出用試料）に添加してもよく、唾液試料に添加する前の極性有機溶媒に添加しておいてもよい。

当該唾液由来有機酸検出用試料中の有機酸は、下記一般式（１）−１〜（１）−３（式（１）−１〜３中、Ｒ^１及びＲ^２は、一方が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。）のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体を、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）法により検出することができる（検出工程）。

一般式（１）−１〜３中、Ｒ^１及びＲ^２は、一方が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。つまり、Ｒ^１が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基の場合、Ｒ^２が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ^２が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基の場合、Ｒ^１が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。窒素原子を含む６員又は５員のヘテロ環を有し、当該窒素原子付近にアルキル基で連結された水酸基が存在する化合物を誘導体化試薬として用いることにより、有機酸を効率よくイオン化することができ、さらに得られた誘導体（エステル化体）のＬＣの保持時間は比較的長いため、誘導体化に使用した試薬と明確に分離することができる。

炭素数１〜６のアルキル基としては、直鎖状のアルキル基であってもよく、分岐鎖状のアルキル基であってもよい。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−へキシル基等が挙げられる。一般式（１）−１〜３中のＲ^１又はＲ^２としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、又はｉ−プロピル基が好ましい。

炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基としては、炭素数１〜６の直鎖状のアルキル基中の１個の水素原子が水酸基に置換されている基であってもよく、炭素数１〜６の分岐鎖状のアルキル基中の１個の水素原子が水酸基に置換されている基であってもよい。具体的には、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。

一般式（１）で表される誘導体化試薬としては、２−ピリジンメタノール、１−ピペリジンエタノール、及び２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。これらの化合物によってカルボキシル基をエステル化することにより、３−ＨＩＢと３−ＨＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢのように構造類似の有機酸同士を、ＬＣにより良好に分離することが可能となり、ひいては、両者の同時検出（一の試料に対する１回のＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる検出）が可能となる。一般式（１）で表される誘導体化試薬としては、中でも、リテンションタイムが遅く、誘導体化された検出対象の有機酸エステルのピークに対する誘導体化試薬によるピークの影響が小さいことから、２−ピリジンメタノールが特に好ましい。

本発明に係る検出方法において、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法は、誘導体化試薬として前記一般式（１）で表される化合物を用いる以外は、常法により行うことができる。具体的には、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおけるＨＰＬＣやＭＳは、カルボン酸エステルを検出するための公知の条件と同様に、又は適宜改変した条件で行うことができる。

本発明に係る検出方法では、１回のＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにおいて、１種類の有機酸のみを検出してもよく、２種類以上の有機酸を同時に検出してもよい。本発明に係る検出方法において検出対象とされる有機酸としては、カルボキシル基を有する化合物であれば特に限定されるものではなく、当該検出方法は、カルボキシル基を有する多くの有機酸の検出に適用できる。本発明に係る検出方法は、解糖系、ＴＣＡサイクル、脂肪酸合成系等の中間代謝物たる有機酸の検出や定量に用いられることが好ましい。中でも、本発明に係る検出方法は、下記一般式（２）で表される有機酸の検出に用いられることが好ましい。

一般式（２）中、Ｒ^３は、炭素数２〜６のヒドロキシアルキル基を表す。炭素数２〜６のヒドロキシアルキル基としては、分岐鎖状のヒドロキシアルキル基であってもよく、直鎖状のヒドロキシアルキル基であってもよい。当該ヒドロキシアルキル基としては、例えば、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシブチル基、２−（ ヒドロキシメチル）プロピル基、２−ヒドロキシペンチル基、３−ヒドロキシ−２、２−ジメチルプロピル基、３−ヒドロキシペンチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、２−ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。

一般式（２）で表される有機酸としては、Ｒ^３が、炭素数２〜３のヒドロキシアルキル基であることが好ましい。特に、一般式（２）で表される有機酸としては、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢからなる群より選択される１種以上であることが好ましく、３−ＨＢと３−ＨＩＢ、又は３−ＨＩＢと３−ＨＢと３−ＨＭＢを同時に検出することがより好ましい。３−ＨＢは肝臓での脂肪酸異化のマーカーであり、３−ＨＩＢ及び３−ＨＭＢは骨格筋におけるＢＣＡＡ異化マーカーとなり得る。つまり、本発明に係る検出方法により、肝臓での脂肪酸異化のマーカーと骨格筋におけるＢＣＡＡ異化マーカーを同時に検出することができる。

本発明に係る検出方法では、他のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを利用した検出方法と同様に、検出対象たる有機酸を、濃度既知の有機酸を用いて作成した検量線に基づいて定量的に検出することができる。検量線作成時には、より定量性を高めるために、濃度既知の有機酸の希釈系列の全てに、一定量の安定同位体を添加しておくことも好ましい。

また、生体試料中の有機酸の検出においては、従来の分析方法では、感度が不十分なためにより多くの生体試料を必要としたり、含有量が少なすぎてそもそも検出不可能な場合が多い。これに対して、本発明に係る検出方法は、非常に検出感度が高いため、従来よりも少量の生体試料から目的の有機酸を検出することができる。また、従来は含有量が極微量であるために検出ができなかった生体試料中の有機酸をも検出し得る。

例えば、３−ＨＩＢを本発明に係る検出方法により検出した場合の検出感度は、従来の誘導体化せずにＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで検出した場合と比べて、１００倍以上である。また、３−ＨＩＢをＨＣｌ−ブタノールを用いて誘導体化した誘導体をポジティブＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出した場合と比べても、１０倍以上高感度である。このため、本発明に係る検出方法は、５μＬ以下の唾液でも、３−ＨＩＢと３−ＨＢの同時定量や、３−ＨＩＢと３−ＨＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢの同時定量、３−ＨＩＢと３−ＨＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢと乳酸の同時定量が可能である。

筋肉中において、ロイシンが代謝されると３−ＨＭＢが産生され、バリンが代謝されると３−ＨＩＢが産生される。つまり、生体中の３−ＨＭＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、筋肉中のＢＣＡＡ異化を反映しており、３−ＨＭＢ及び３−ＨＩＢは、筋肉中のＢＣＡＡ異化を反映するアミノ酸代謝マーカーとして機能する。また、肝臓においてスレオニンとメチオニン、及び脂肪酸が代謝されると、２−ＨＢ及び３−ＨＢが産生される。つまり、２−ＨＢ及び３−ＨＢは、スレオニンとメチオニンの代謝経路マーカー又は脂肪代謝マーカーとして機能する。さらに、グルコースが代謝されると、乳酸が産生される。つまり、乳酸は、糖代謝マーカーとして機能する。

なお、骨格筋におけるＢＣＡＡの異化の程度、すなわち、生体中の３−ＨＭＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、例えば、肝硬変、肝性脳症、筋炎、ステロイド筋症、心不全、抗がん剤の使用による悪疫質、横紋筋融解症、廃用性筋萎縮、甲状腺機能亢進症、慢性疲労症候群、サルコペニア（加齢性筋肉減弱現象）、ミトコンドリア脂肪酸酸化異常症等の疾患に罹患している患者、透析患者、手術侵襲患者、高齢者等の、血中アルブミン濃度や血中ＢＣＡＡ濃度が低下している若しくは低下しているおそれのある者についての、低栄養や筋蛋白分解の指標（バイオマーカー）とすることができる。また、マラソンやトライアスロン等の筋蛋白質異化が亢進しやすいアスリートについての低栄養や筋蛋白分解の指標とすることもできる。

唾液中の３−ＨＩＢ濃度は、栄養状態の指標とすることができるため、唾液中の３−ＨＩＢ濃度は、例えば、創薬スクリーニング、特に前述の各種疾患に対する治療剤候補の薬理効果を示すマーカーとして、また有効成分の安全性試験における毒性評価のマーカーとしても使用することが期待される。

運動によるエネルギー消費増加に伴い、肝臓での脂肪酸異化が亢進し、体液（血、唾液）中の３−ＨＢ量が増加する。また、骨格筋のＢＣＡＡ異化が亢進している状態では、３−ＨＩＢ量及び３−ＨＭＢ量が増加する。このため、唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度、３−ＨＭＢ濃度は、運動中又は運動後における肝臓と骨格筋のエネルギー供給源バランス（エネルギー代謝組織と供給栄養素の依存度）を評価する指標（バイオマーカー）となり得る。運動中又は運動後に、唾液中の３−ＨＢ濃度や３−ＨＩＢ濃度が、安静時からさほど変化がない場合には、糖がエネルギー供給源として使用されていると評価できる。運動中又は運動後に、唾液中の３−ＨＢ濃度や３−ＨＩＢ濃度が安静時よりも有意に上昇した場合には、肝臓での脂肪酸異化又は骨格筋におけるＢＣＡＡ異化によりエネルギーが産生されていると評価できる。運動中又は運動後の骨格筋ＢＣＡＡのエネルギー供給源としての利用を評価するバイオマーカーとしては、３−ＨＭＢよりも、唾液中３−ＨＩＢ濃度が好ましい。運動中又は運動後の肝臓と骨格筋での異なる組織と異なる栄養源によるエネルギー産生状態を評価するバイオマーカーとしては、唾液中の３−ＨＩＢ濃度と３−ＨＢ濃度の両方を測定する必要がある。

具体的には、本発明に係る唾液試料の調製方法により、運動中の被検者から採取した唾液から調製した唾液試料から、３−ＨＩＢ及び／又は３−ＨＢを本発明に係る検出方法により検出して３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度を測定し、当該濃度を予め設定された所定の閾値と比較することにより、当該被験者における運動時のエネルギー供給源を評価することができる。当該閾値は、被験者ごとに設定することが好ましいが、多数の被験者について運動負荷量が同程度となることが期待される運動を行った後の３−ＨＩＢ濃度等を測定した結果から設定してもよい。

また、運動開始直前から運動終了後一定期間経過後までの間に経時的に被検者から唾液試料を調製し、各唾液試料中の３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定することにより、唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度をモニタリングする（経時的変化を調べる）ことができる。モニタリングの結果得られた３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度の経時的変化に基づいて、当該被験者における運動時のエネルギー供給源を評価することができる。なお、運動開始直前が安静時（平常状態）ではない場合には、予め、安静時の被験者から唾液試料を調製し、各唾液試料中の３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定しておき、得られた測定値を運動時のエネルギー供給源の評価の参考にすることが好ましい。

過度の運動に加え、休養と栄養が不十分であると、相対的運動負荷量が過大となる、いわゆるオーバーワーク状態となる。飢餓時などの低栄養状態では、肝臓での脂肪酸異化によって得られるケトン体産生亢進と、骨格筋での蛋白質分解によって得られるＢＣＡＡ異化亢進によるエネルギー産生が活性化するため、唾液中の３−ＨＢ濃度と３−ＨＩＢ濃度が上昇する。特に、持久性競技者や減量や食事制限を行っているスポーツ選手や愛好家は、糖消費後のエネルギー源となる脂質貯蔵量が少ないため、骨格筋のアミノ酸をエネルギー源としての利用依存度が高くなる。その様な骨格筋アミノ酸の利用度の増加や持続により、筋蛋白質分解が亢進し、骨格筋萎縮等の症状を伴う全身のエネルギー代謝不全状態が生じる。この様な場合の多くは、いわゆるオーバーワーク状態に陥っている。この様なオーバーワーク状態では、唾液中の３−ＨＢ濃度と３−ＨＩＢ濃度測定を行うことにより、肝臓の脂肪酸異化由来のケトン体と骨格筋蛋白由来のＢＣＡＡ異化によるエネルギー供給源バランス、依存度を評価できることから、オーバーワーク状態の指標ともなり得る。例えば、運動をしていない安静時（平常状態）における３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度と、オーバーワークとならない程度の運動を行った後の唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度とを本発明に係る検出方法によって測定しておき、これらの測定値から、オーバーワーク状態における３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度と、オーバーワークではない状態における３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度とを分ける閾値（オーバーワーク閾値）を予め設定しておく。オーバーワークが引き起こされる様な過度な繰り返しの運動後の被検者から調製した唾液試料中から３−ＨＩＢ及び３−ＨＢ濃度を本発明に係る検出方法により検出して唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度を測定し、当該濃度を予め設定されたオーバーワーク閾値と比較することにより、当該被験者におけるエネルギー供給源バランスを評価する。具体的には、当該被験者の３−ＨＩＢ濃度と３−ＨＢ濃度がオーバーワーク閾値よりも低い場合には、当該被験者の運動負荷量は適正であり、被験者はオーバーワークではない可能性が高く、当該被験者の３−ＨＩＢ濃度がオーバーワーク閾値以上である場合には、当該被験者の運動負荷量は過大であって、当該被験者はオーバーワークである可能性が高い、と評価できる。また、当該被験者の３−ＨＢ濃度のみが閾値以上である場合には、当該被験者がエネルギー不足状態であっても、当該被験者はまだオーバーワークに至っていない可能性が高い、と評価できる。当該オーバーワーク閾値は、被験者ごとに設定することが好ましいが、多数の健常者についてオーバーワークとならない程度の運動を行った後の３−ＨＩＢ濃度又は３−ＨＢ濃度を測定した結果から設定してもよい。運動中の被験者から経時的に唾液試料を調製し、３−ＨＩＢ濃度と３−ＨＢ濃度を経時的に測定してモニタリングすることにより、危険なオーバーワーク状態となる前に運動を終了させることもできる。この場合、被験者からの試料採取は必ずしも運動中である必要はなく、長期の運動プログラムやトレーニングを行っている被験者の安静時から採取した試料から得られる結果を、運動プログラム前やトレーニング前の同一被験者から採取した試料から得られた結果と比較することにより、オーバーワーク状態の評価に用いることもできる。すなわち、本発明に係る方法によって運動中あるいは長期的な３−ＨＩＢ濃度と３−ＨＢ濃度をモニタリングすることにより、適正な運動量を評価し、オーバーワーク状態を予防することができる。

また、例えば、本発明に係る検出方法によって、一の動物個体から経時的に調製された唾液試料中の３−ＨＩＢや３−ＨＢの濃度測定することにより、骨格筋のＢＣＡＡ異化や肝臓における脂肪酸異化の状態をモニタリングすることもできる。３−ＨＩＢ濃度モニタリングや３−ＨＢ濃度モニタリングは、例えば、肝硬変患者、低栄養状態や寝たきり状態の患者に対する、骨格筋萎縮予防、低栄養状態改善を目的としたＢＣＡＡ製剤投与や栄養療法の開始の必要性の有無の判断やそれらの治療の判定に利用可能である。例えば、３−ＨＢ濃度に変化がみられないのにも関わらず、３−ＨＩＢ濃度のみ上昇傾向がみられる場合には、肝機能の低下による肝臓での低エネルギー産生能を、骨格筋蛋白異化によるアミノ酸由来のエネルギー産生で代償する低栄養状態である可能性が高いと評価できる。

その他にも、本発明に係る検出方法によって３−ＨＩＢや３−ＨＢの濃度を測定することにより、スポーツ医学領域において、肝臓と骨格筋における脂質とアミノ酸のエネルギー源依存バランス（エネルギー代謝状態）を、唾液を用いてもモニターすることも可能となる。さらに、アンチエイジングやダイエットによる体重管理や美容の領域において、本発明に係る検出方法によって唾液を分析して３−ＨＩＢや３−ＨＢの濃度を測定することにより、糖、アミノ酸、脂肪酸の代謝状態を評価しながら、効果的に栄養・運動・体調管理を行うことも可能となる。さらに、本発明に係る検出方法は、ＢＣＡＡ等の栄養素が含まれるサプリメントや栄養ドリンクを摂取した際の栄養・摂取効果などの評価にも利用できる。

また、肝硬変患者では、肝機能の低下による肝臓から骨格筋への糖の供給が低下することにより、飢餓状態に陥り、アミノ酸異化が亢進する。このため、健常者群よりも肝硬変患者群の方が、体液中の３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢの濃度が高い傾向にある。そこで、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢは、肝硬変のバイオマーカーとして利用できる。具体的には、予め肝硬変患者と健常者とを分ける閾値を設定し、被検者の唾液中の３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢの濃度を本発明に係る検出方法によって測定し、当該濃度を所定の閾値と比較することにより、肝硬変発症可能性を評価することができる。具体的には、被検者の唾液中の３−ＨＩＢ等の濃度が所定の閾値以上であった場合に、前記被検者が肝硬変を発症している可能性が高いと評価することができる。肝硬変患者と健常者とを分ける閾値は、実験的に設定することができる。例えば、肝硬変を発症していないことが分かっている集団から採取された唾液と、肝硬変を発症していることが分かっている集団から採取された唾液とに対して、本発明に係る検出方法を行ってこれらの唾液中の３−ＨＩＢ等の濃度を測定し、両集団の測定値を比較することにより、適宜設定することができる。肝硬変のバイオマーカーとしては、３−ＨＩＢ又は３−ＨＭＢが好ましく、肝硬変患者群と健常者群の差がよりはっきりしていることから、唾液中の３−ＨＩＢ又は唾液中の３−ＨＭＢがより好ましい。

肝硬変が進行し、肝機能の一つである尿素回路が低下すると、アンモニアは骨格筋で代償的にグルタミンやアラニンに代謝されて無毒化される。その際に、ＢＣＡＡが骨格筋でＢＣＡＴにより分岐鎖α−ケト酸に異化される過程で副産物として生じるグルタミン酸が、アンモニア解毒に用いられている。そのため、肝硬変時に骨格筋で代償するアンモニア解毒の際にも骨格筋ＢＣＡＡ異化の亢進が必要であり、結果として、体液中の３−ＨＩＢ濃度は上昇する。アンモニア解毒が不十分で、体液中のアンモニア濃度が高くなると、脳症が誘発されやすくなると考えられている。したがって、肝硬変患者の肝臓でのアンモニア解毒能の低下に加え、骨格筋ＢＣＡＡ異化を介したアンモニア解毒代償能の低下が生じると、肝性脳症をきたすものと考えられる。この様な理由で、３−ＨＩＢは、肝性脳症又はその発症可能性のバイオマーカーとして利用でき、その予防や早期治療のために有用な情報を提供することができる。例えば、３−ＨＩＢ濃度から肝性脳症を発症するリスクが高いと評価された肝硬変患者に対しては、脳症が顕在化していない場合であっても蛋白制限食を推奨したり、ＢＣＡＡの摂取を推奨したりすることにより、肝性脳症の発症を予防し得る可能性がある。

例えば、肝硬変患者から経時的に採取した唾液中の３−ＨＩＢ濃度をモニタリングした場合に、３−ＨＩＢ濃度が低下傾向にある場合には、当該肝硬変患者が肝性脳症を発症する可能性が高い。そこで、肝硬変を発症している被検者から採取された唾液中の３−ＨＩＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定し、得られた３−ＨＩＢ濃度を、当該唾液が採取された時点以前に前記被験者から採取された唾液中の３−ＨＩＢ濃度と比較することにより、肝性脳症発症可能性を評価できる。具体的には、得られた３−ＨＩＢ濃度が、以前に採取された唾液の３−ＨＩＢ濃度よりも有意に低い場合や、モニタリングの結果、以前に採取された唾液の３−ＨＩＢ濃度よりも低くなる傾向がある程度継続している場合には、当該被検者が肝性脳症を発症する可能性が高いと評価する。

肝硬変患者における３−ＨＩＢ濃度が低下しているか否かは、肝硬変患者と健常者とを分ける閾値を用いても評価することができる。具体的には、肝硬変を発症している被検者から採取した唾液中の３−ＨＩＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定し、得られた３−ＨＩＢ濃度を、所定の閾値（例えば、前記の肝硬変患者と健常者とを分ける閾値）と比較することにより、肝性脳症発症可能性を評価することができる。具体的には、被検者の３−ＨＩＢ濃度が所定の閾値未満であった場合や、所定の閾値未満である状態がある程度継続している場合に、前記被検者が肝性脳症を発症する可能性が高いと評価することができる。

また、前述のように、唾液や血清等の生体試料中の３−ＨＩＢ濃度は、サルコペニアの予測因子となり得るが、サルコペニアは長期的な変化によるものであるため、３−ＨＩＢ濃度の上昇は観察し難い場合がある。また、３−ＨＩＢ濃度は、測定の際の栄養状態や代謝状態にも影響されるため、長期的な変化は短期的な影響に隠れて見落とされるおそれもある。測定前に予めＢＣＡＡを負荷（経口投与）しておくことにより、健常者とサルコペニア患者又はその予備群とにおける３−ＨＩＢ濃度の差をより明確にすることができる。例えば健常者では、ＢＣＡＡ製剤を１日３回、２週間経口摂取した場合でも、血中の３−ＨＩＢ濃度は摂取前と比べてほとんど変化しないが、骨格筋におけるＢＣＡＡへのエネルギー依存度が高い被検者では、ＢＣＡＡ摂取前に比べてＢＣＡＡ摂取後に、血中又は唾液中の３−ＨＩＢ濃度が上昇する。このため、ＢＣＡＡ負荷前後の唾液又は血液中の３−ＨＩＢ濃度を測定し、ＢＣＡＡ負荷によって３−ＨＩＢ濃度が上昇している場合には、骨格筋におけるＢＣＡＡ異化が亢進しており、サルコペニアである可能性が高い、又はサルコペニアを発症する危険性が高いと予測することができる。

なお、ＢＣＡＡ負荷を行う場合には、摂取したＢＣＡＡの腸吸収や血中濃度変化などの影響を考慮して、バリン濃度を基準とし、３−ＨＩＢ濃度とバリン濃度の比をバイオマーカーとすることが好ましい。ＢＣＡＡ摂取による３−ＨＩＢ濃度の上昇度を、バリン濃度の上昇度を基準として評価することにより、より信頼性の高い結果を期待できる。

３−ＨＭＢは、ＢＣＡＡ由来の肝臓や骨格筋における蛋白合成のマーカーや骨格筋肥大のマーカーとして利用可能であり、また、２−ＨＢは、早期インスリン抵抗性のマーカーや、グルコース不耐性のマーカーであり、大腸癌マーカーとしても有用である。乳酸は、代謝性アシドーシス（乳酸アシドーシス）の判断に用いられ、低酸素症、循環不全、管理不良の糖尿病、肝不全、及び骨格筋の痙攣時に高値になり、糖原病や乳酸脱水素酵素欠損症の際に低値になる。また、乳酸は、運動負荷（運動強度）のマーカーとしても利用されている。本発明に係る検出方法を用いることにより、これらのバイオマーカーを感度よく検出することができる。

肝臓におけるアルコール分解にはＮＡＤを補酵素として使用するため、肝臓内のＮＡＤ／ＮＡＤＨ比が低くなる。このＮＡＤ／ＮＡＤＨ比の低下によって、肝臓における脂肪酸異化（β酸化）が低下するため、アルコール摂取が脂肪肝や肥満の原因となる。ＮＡＤはミトコンドリア内におけるα−ケト酪酸からプロピオニルＣｏＡへの代謝にも用いられるため、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ比が低下すると、ミトコンドリア内でα−ケト酪酸が代謝されず、細胞質内でα−ケト酪酸が２−ＨＢに代謝される割合が高くなると考えられる。このため、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＳＨ）患者に比べて、アルコール性脂肪肝（ＡＳＨ）患者において、２−ＨＢ量は高くなり、２−ＨＢは、ＮＡＳＨとＡＳＨを識別するためのバイオマーカーとして利用し得る。

本発明に係る検出方法は、微量の唾液から、アミノ酸、脂肪、又は糖のエネルギー代謝マーカーである３−ＨＩＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢと３−ＨＢと乳酸の同時定量が可能である。このため、本発明に係る検出方法を用いることにより、被験者のエネルギー代謝の状態をより詳細に解析することができる。これらの有機酸の量を解析することにより、高齢者等における糖、脂肪、及びアミノ酸の代謝バランスを調べることができる。

また、本発明に係る検出方法は、疲労の蓄積度合の評価にも有用である。例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物は、安静時は糖を主たるエネルギー供給源としているが、運動時は、脂質及びアミノ酸への依存度が増す。運動後安静にすることによって、糖を主たるエネルギー供給源とする運動前のエネルギー供給源バランスに復帰し、疲労が回復する。エネルギー供給源バランスが安静時の状態にまで復帰する前に運動負荷をかけることにより、エネルギー供給源バランスがアミノ酸及び脂肪への依存度が高い状態から運動前の安静時状態にまで復帰できない。本発明に係る検出方法により３−ＨＩＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢと３−ＨＢと乳酸を同時に検出することによって、アミノ酸、脂肪、及び糖のエネルギー代謝の程度を評価してエネルギー供給源バランスを調べることができ、疲労の蓄積度合を調べることができる。

次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜試薬類＞
以下の実施例や参考例等で用いた試薬は次の通りである。Ｄ−３−ＨＢ、Ｌ−３−ＨＢ、及び３−ＨＩＢナトリウム塩は、シグマアルドリッチケミカル社製のものを用いた。ＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩は、太陽日酸社製のものを用いた。２−ピリジンメタノール、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物、１−ピペリジンエタノール、２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジン、３−ピリジンメタノール、２−ジエチルアミノエタノール、３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジン、及び４−ピリジンメタノールは、東京化成工業社製のものを、４−ジメチルアミノピリジンは和光純薬社製のものを用いた。３−ＨＢデヒドロゲナーゼは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のものを用いた。

＜血清試料の調製＞
以下の参考例において使用した血清試料は、以下のようにして調製した。
健常人から採取した血液から血清を回収し、測定に使用する時点まで−２０℃で保存したものを用いた。血清（１０μＬ）を、１．５ｍＬの遠心分離用プラスチックチューブにいれ、さらに内部標準として７６９ｐｍｏｌ（１００ｎｇ）のＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩を含むアセトニトリル／水（１／１９、容量比）溶液（１００μＬ）を添加して１分間撹拌した後、２０００×ｇで１分間遠心分離処理した。上清を、水／アセトニトリル（１／１９、容量比）溶液に入れ、脱蛋白処理をした後、液相を回収して８０℃、窒素ガス吹き付け下でエバポレートして乾燥させた。

＜３−ＨＢ−フリー血清の調製＞
以下の参考例において使用した３−ＨＢ−フリー血清は、以下のようにして調製した。
３−ＨＢ−フリー血清は、正常な血清（１０μＬ）を１．８ｍＭのＮＡＤと０．０７５Ｕの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを添加した１５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）に添加して、３７℃で３０分間インキュベートすることにより調製した。

＜２−ピリジンメタノールを誘導体化試薬とする有機酸のエステル化反応＞
以下の参考例において、２−ピリジンメタノールを誘導体化試薬とする有機酸のエステル化反応は、以下のようにして調製した。
２−ピリジンメタノールを誘導体化試薬とする有機酸のエステル化反応は、シイナらによるカルボキシエステルの合成方法（非特許文献１３参照。）を改良して行った。具体的には、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び２−ピリジンメタノール（１００μＬ）からなる２ＰＭ誘導体化用混合試薬を用いた。まず、直前に調製した前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬（５０μＬ）を、有機酸を含む乾燥させたサンプルに加えた反応溶液を、室温で３０分間静置した。次いで、当該反応液にｎ−ヘキサン（１ｍＬ）を加えて３０秒間撹拌した後、７００×ｇで１分間遠心分離処理し、回収した上清を、８０℃、窒素ガス吹き付け下でエバポレートした。残留物を１容量％のギ酸水溶液（１５０μＬ）に再溶解させ、再度７０００×ｇで１分間遠心分離処理し、回収した上清を、測定試料としてＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。

＜ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ＞
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、ＨＥＳＩ−IIプローブとＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ Ｕｌｔｒａ Ｆａｓｔ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＦＬＣ）システム（島津製作所製）を備えたトリプル四重極型質量分析計ＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。クロマトグラフィーにおける分離は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ａＱカラム（２．１×１５０ｍｍ、３μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて４０℃で行った。はじめに、移動相を０．２容量％のギ酸を含むアセトニトリル／水（１／１９、容量比）として流速３００μＬ／分で５分間流した。５分後に、移動相を０．２容量％のギ酸を含むアセトニトリルに変更し、流速３００μＬ／分で７分間流した。一般的なＭＳ／ＭＳ条件は、以下の通りである；
スプレー電圧：３０００Ｖ、
噴霧器温度：４５０℃、
シースガス（窒素）圧：５０ｐｓｉ、
補助ガス（窒素）流量：１５任意単位、
イオントランスファーキャピラリー温度：２２０℃、
衝突ガス（アルゴン）圧：１．０ｍＴｏｒｒ、
衝突エネルギー：１５Ｖ、
イオン極性：正モード。

図１Ｂに、２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ（２ＰＭ−３−ＨＢ）の典型的なＰ−ＥＳＩ ＭＳスペクトラムを示す。２ＰＭ−３−ＨＢは、［Ｍ＋Ｈ］^＋イオンがベースピークとしてｍ／ｚ １９６にみられる。このｍ／ｚ １９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンＭＳスペクトラム（図１Ａ）では、［Ｃ_５Ｈ_４ＮＣＨ_２ＯＨ＋Ｈ］^＋のフラグメントイオンが最も突出したピークとしてｍ／ｚ １１０にみられる。ＳＲＭは、２ＰＭ−３−ＨＢの検出にはｍ／ｚ １９６→ｍ／ｚ １１０を用いて行い、［^１３Ｃ_４］同位体（内部標準）の検出にはｍ／ｚ ２００→ｍ／ｚ １１０を用いて行った。

＜キャリブレーションカーブの作成＞
キャリブレーションカーブの作成には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）にＤ−３−ＨＢナトリウム塩を溶解させた標品保存溶液（２００ｎｇ／μＬ）を、さらにアセトニトリル／水（１／１９、容量比）を用いて適宜希釈することにより調製した濃度既知のＤ−３−ＨＢナトリウム標準溶液（１〜２００ｎｇ／１００μＬ）を用いた。各標準溶液には、内部標準として、ＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩（１００ｎｇ）を添加し、混合物をエバポレートして乾燥させた後に、誘導体化（誘導体によるエステル化）をしたものを、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。キャリブレーションカーブのマトリックス効果を調べるために、各標準溶液にブランクマトリックスとして、３−ＨＢ−フリー血清を添加した。

＜ＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ＞
３−ＨＢのＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳは、誘導体化を行わずに、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムと同じものを用いて実施した。クロマトグラフィーにおける分離は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ａＱカラム（２．１×１５０ｍｍ、３μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて４０℃で行った。移動相は、０．１容量％のギ酸を含むメタノール／水（１／９、容量比）を流速２００μＬ／分で流した。一般的なＭＳ／ＭＳ条件は、以下の通りである；
スプレー電圧：２５００Ｖ、
噴霧器温度：４５０℃、
シースガス（窒素）圧：５０ｐｓｉ、
補助ガス（窒素）流量：１５任意単位、
イオントランスファーキャピラリー温度：２２０℃、
衝突ガス（アルゴン）圧：１．０ｍＴｏｒｒ、
衝突エネルギー：１５Ｖ、
イオン極性：負モード、
３−ＨＢのＳＲＭ（選択反応モニタリング）：ｍ／ｚ １０３ → ｍ／ｚ ５９、
［^１３Ｃ_４］のＳＲＭ：ｍ／ｚ １０７ → ｍ／ｚ ６１。

＜統計処理＞
以下の実施例及び参考例等における数値は、平均±ＳＤ（標準偏差）である。キャリブレーションカーブの直線性は単回帰分析により分析した。再現性は、一元配置分散分析法（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）（ＪＭＰソフトウェア、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）により分析した。推定値±９５％信頼限界を、精度指標として得た（非特許文献１４参照。）。値を算出するために、ＪＭＰソフトウェアを用いた再現性試験においては、直交回帰分析を行った。異なるグループ間の差の統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｔ−ｔｅｓｔにより評価した。全ての分析では、Ｐ＜０．０５で有意差ありとした。

［参考例１］
２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）（１００μＬ）にＤ−３−ＨＢナトリウム塩（標品、１μｇ）のみを溶解させた試料溶液、Ｄ−３−ＨＩＢナトリウム塩（標品、１μｇ）のみを溶解させた試料溶液、及びＤ−３−ＨＢナトリウム塩（標品、１μｇ）とＤ−３−ＨＩＢナトリウム塩（標品、１μｇ）を溶解させた試料溶液を調製し、それぞれをエバポレートして乾燥させた後に、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした。最終的に１容量％のギ酸水溶液（１ｍＬ）に再溶解させ、１μＬ（Ｄ−３−ＨＢナトリウム塩、Ｄ−３−ＨＩＢナトリウム塩それぞれ１ｎｇ相当）を、前述の通りにＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。

２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図２に示す。図２Ａに誘導体化された３−ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図２Ｂに前記図２ＡのＭＳスペクトラムを、図２Ｃに誘導体化された３−ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図２Ｄに前記図２ＣのＭＳスペクトラムを、図２Ｅに誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ １９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図２Ｆに前記図２Ｅの３−ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。

この結果、測定に供した試料には１ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３−ＨＢと３−ＨＩＢの誘導体はいずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体の分離が良好であった。また、ＬＣの保持時間が遅いため、カラムから最初に出てくる誘導体化試薬等（例えば、４−ジメチルアミノピリジンなど）の３−ＨＢの誘導体や３−ＨＩＢの誘導体のピークに対する影響は非常に小さかった。つまり、これらの結果から、２−ピリジンメタノールで誘導体化することにより、３−ＨＢや３−ＨＩＢ等の有機酸を、精度よく高感度に検出できることがわかった。

［参考例２］
１−ピペリジンエタノールで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び１−ピペリジンエタノール（１００μＬ）からなる１ＰＥ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、参考例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。

図３に、１−ピペリジンエタノールで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を示す。図３Ａに誘導体化された３−ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図３Ｂに前記図３ＡのＭＳスペクトラムを、図３Ｃに誘導体化された３−ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図３Ｄに前記図３ＣのＭＳスペクトラムを、図３Ｅに誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ ２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図３Ｆに前記図３Ｅの３−ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。

この結果、測定に供した試料には１ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３−ＨＢと３−ＨＩＢの誘導体はいずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体の分離が良好であった。また、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体のいずれのピークも、プロダクトイオンクロマトグラムにおけるＳ／Ｎが良好であり、感度が特に良好であった。つまり、これらの結果から、１−ピリジンエタノールで誘導体化することにより、３−ＨＢや３−ＨＩＢ等の有機酸を、精度よく高感度に検出できることがわかった。

［参考例３］
２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジン（１００μＬ）からなる１ＰＥ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、参考例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。

２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図４に示す。図４Ａに誘導体化された３−ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図４Ｂに前記図４ＡのＭＳスペクトラムを、図４Ｃに誘導体化された３−ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図４Ｄに前記図４ＣのＭＳスペクトラムを、図４Ｅに誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ ２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図４Ｆに前記図４Ｅの３−ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。

この結果、測定に供した試料には１ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３−ＨＢと３−ＨＩＢの誘導体はいずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体の分離が良好であった。また、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体のいずれのピークも、プロダクトイオンクロマトグラムにおけるＳ／Ｎが良好であり、感度が特に良好であった。つまり、これらの結果から、２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンで誘導体化することにより、３−ＨＢや３−ＨＩＢ等の有機酸を、精度よく高感度に検出できることがわかった。

［参考例４］
健常者から採取された１０μＬの血清に内部標準としてＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩を添加した試料を、参考例１と同様にして２−ピリジンメタノールで誘導体化し、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。図５に、２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ（２ＰＭ−３−ＨＢ）と［^１３Ｃ_４］同位体の典型的なＳＲＭクロマトグラムを示した。当該クロマトグラムより、２ＰＭ−３−ＨＢの［^１３Ｃ_４］同位体に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて血清中の３−ＨＢ濃度を決定した。当該クロマトグラム中の２ＰＭ−３−ＨＢのピークは５．１ｐｍｏｌ（７６μＭ）に相当した。クロマトグラムＡの４．５３分に見られたピークは、２ＰＭ−３ＨＩＢ標品との比較から、３−ＨＩＢの２ＰＭエステル誘導体であると同定された。

［参考例５］
２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）（１００μＬ）に、Ｄ−３−ＨＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤ−３−ＨＩＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤ−３−ＨＭＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤ−２−ＨＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩（標品、８０ｎｇ）を溶解させた試料溶液を調製し、エバポレートして乾燥させた後に、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした。最終的に１容量％のギ酸水溶液（１ｍＬ）に再溶解させ、１μＬ（Ｄ−３−ＨＢナトリウム塩、Ｄ−３−ＨＩＢナトリウム塩、Ｄ−３−ＨＭＢナトリウム塩、Ｄ−２−ＨＢナトリウム塩がそれぞれ３ｎｇ相当、ＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩が８ｎｇ相当）を、前述の通りにＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。

２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図６に示す。図６の上段に試料の総イオンクロマトグラムを、上から２段目にｍ／ｚ １９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、上から３段目にｍ／ｚ ２００を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、最下段にｍ／ｚ ２１０を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、それぞれ示す。

この結果、測定に供した試料には３ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢの２ＰＭエステル誘導体は、いずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体と３−ＨＭＢの誘導体と２−ＨＢの誘導体の分離が良好であった。つまり、これらの結果から、２−ピリジンメタノールで誘導体化することにより、構造類似の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢを、精度よく高感度に同時検出できることがわかった。

［参考例６］
被検者から採取された血清と唾液を一定時間室温放置した場合における、血清中と唾液中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの安定性を検討した。

＜血清＞
健常者から６本の採血管に血液を採取した。６本の採血管のうちの１本については、採血後速やかに遠心分離処理を行い、回収した血清を−２０℃で凍結保存した。残りの５本については、それぞれ、室温で１、２、４、６、又は２４時間放置した後、遠心分離処理を行い、回収した血清を−２０℃で保存した。
−２０℃で保存後の各血清中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度を、内部標準としてＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩を用い、誘導体化試薬として２−ピリジンメタノールを用いて、参考例４と同様にしてＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。クロマトグラムより、２ＰＭ−３−ＨＢの［^１３Ｃ_４］同位体に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて、血清中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度を決定した。測定結果を図７に示す。この結果、血清中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、採血後室温で放置される時間が６時間に至るまで減少するが、その後２４時間まで変化はなかった。

＜唾液＞
健常者から１本のチューブに採取（流涎）した唾液を６本のチューブに分注した。６本のチューブのうちの１本については、採取後速やかに−２０℃で凍結保存した。残りの５本については、それぞれ、室温で１、２、４、６、又は２４時間放置した後、−２０℃で保存した。凍結保存した唾液試料は、分析時に室温で自然解凍した。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、粘性蛋白質（ムチン）を分解し、唾液中に含まれている食べかす等と共に沈殿させ、上清を分析に用いた。
−２０℃で保存後の各唾液中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度を、内部標準としてＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩を用い、誘導体化試薬として２−ピリジンメタノールを用いて、参考例４と同様にしてＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。クロマトグラムより、２ＰＭ−３−ＨＢの［^１３Ｃ_４］同位体に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて、唾液中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度を決定した。測定結果を図８に示す。この結果、唾液中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、採取後室温で放置される時間にかかわらず、ほぼ安定していた。

［参考例７］
被検者から採取された血清と唾液（流涎）中における、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、及び２−ＨＢの濃度の相関性を調べた。具体的には、健常人３名（被検者α、β、γ）から、各５サンプルずつ、血清及び唾液を採取し、これらの３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、及び２−ＨＢの濃度を測定し、血清中濃度と唾液中濃度の相関性を調べた。血清中及び唾液中の３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、及び２−ＨＢの濃度は、参考例６と同様にして測定した。３−ＨＢ濃度の測定結果を図９Ａに、３−ＨＩＢ濃度の測定結果を図９Ｂに、２−ＨＢ濃度の測定結果を図９Ｃに、それぞれ示す。この結果、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、及び２−ＨＢのいずれにおいても、唾液中濃度は、血清中濃度と相関することが確認された。

［参考例８］
走運動前後の血清中、唾液中、及び尿中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度を測定し、経時的変化を観察した。
具体的には、被験者（男性健常者）に、前日の午前１１時から走運動当日の午前１１時までの２４時間蓄尿した後、６０分間ジョギング（走行距離：約９ｋｍ、速度：約６．７分／ｋｍ）し、その後２４時間経過時点（走運動日の翌日の昼１２時）までを実験期間とした。被験者は、前日の午前１１時から実験期間終了時点までの間、前日の昼食及び夕食、走運動当日の昼食及び夕食、翌日の朝食を摂取した。被験者の運動と食事状況、及び血液、唾液、尿の採取時点を図１０に示す。なお、実施した６０分間ジョギングは、当該被験者にとって日常的に行っている運動よりもやや負荷の高い運動であった。

血清中、唾液中、及び尿中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度は、参考例４と同様にして測定した。採取された各サンプル中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの測定結果を図１１〜１３に示す。図１１は、血清中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度の経時的変化を示す。図１２は、３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの各採取時点における単位時間当たり尿排泄量（［尿排泄量］／［前回採取時からの経過時間］）（μｍｏｌ／ｈ）の経時的変化を、それぞれ示す。図１３は、唾液中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度の経時的変化を示す。図１３の下段の図は、上段の走運動中の測定結果を、縦軸スケールを拡大して示した図である。
この結果、２−ピリジンメタノールで誘導体化してＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを行うことにより、被験者から採取された血清、唾液、尿のいずれにおいても、３−ＨＩＢと３−ＨＢの両方を検出できることが確認された。

３−ＨＢは、走運動により、血清中と唾液中のいずれにおいても濃度は上昇したが、血清中３−ＨＢ濃度は、走運動後もそのまま上昇しており、唾液中３−ＨＢ濃度は、走運動直後は低下したものの、その後再び上昇した（図１１及び図１３上段）。これらの結果から、運動によって上昇する血清中の３−ＨＢ濃度と同様に、唾液中の３−ＨＢ濃度も運動により上昇する事が確認された。また、運動後は、血清中と唾液中ともに、３−ＨＢ濃度は、食事を摂取するまで上昇し続けることから、運動後の肝脂肪酸異化（脂肪の燃焼）を、血液と唾液の両試料にてモニターできることも確認できた。

一方で、３−ＨＩＢは、血清中と唾液中のいずれにおいても、走運動により濃度が上昇し、運動終了後ある程度時間が経過すると速やかに濃度は低下し、運動前の平常状態にまで戻ることが確認された（図１１及び図１３上段）。運動中に比べて運動後は、骨格筋ＢＣＡＡ異化反応は持続せず、健常人では、一過性の運動を行ったのみでは、骨格筋蛋白質分解由来ＢＣＡＡ又は遊離ＢＣＡＡの異化は生じないことが確認された。特に唾液中３−ＨＩＢ濃度は、運動終了後３０分経過時点から実験期間終了時点までの間、ほとんど変動せず、食事等の影響を受けにくいことがわかった。これに対して、血清中３−ＨＩＢ濃度は、運動終了後１時間経過時点では平常状態にまで低下したものの、運動終了後４時間経過時点ではやや上昇していた。運動終了後２．２５時間経過時点で食事を摂取しているため、この運動終了後４時間経過時点での血清中３−ＨＩＢ濃度の上昇は、わずかながら食事の影響を受けた可能性が考えられた。

これらの結果から、血清中と唾液中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、運動により上昇することから、運動による肝脂肪酸異化（脂肪燃焼）マーカー及び骨格筋ＢＣＡＡ異化マーカーとしてこれらを同時に評価が可能であり、運動時又は運動後の組織別（肝と骨格筋）のエネルギー代謝状態（ひいては、エネルギー供給源のバランス）を評価するマーカーとして有用であること、食事等の影響を受けにくいことから、３−ＨＩＢについては、血清中濃度よりも唾液中濃度のほうがマーカーとして好ましいこと、がわかった。

図１２下段に示すように、走運動中の唾液中３−ＨＩＢ濃度は、運動開始から１５分経過時点までは、運動開始時点（平常状態）からあまり変化がないが、その後ゆるやかに上昇する傾向が観察された。走運動中の唾液中３−ＨＢ濃度は、運動開始から３５分経過時点までは運動開始時点（平常状態）からあまり変化がないが、その後は３−ＨＩＢ濃度と比較してより急激に上昇する傾向が観察された。運動時のエネルギー源として、まずは糖が優先的に利用されるが、運動時間や強度が増すにつれ、脂肪やアミノ酸がエネルギー源として利用される。これらの結果から、３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度の上昇は、糖の代わりに脂肪やアミノ酸がエネルギー源として利用された事を示しており、両者が上昇した時点は、エネルギー産生の依存度が糖代謝から脂質、アミノ酸代謝へ移行したポイントを示していると考えられる。また、近年、運動早期から、糖や脂質に加え、アミノ酸もエネルギー源として利用されていると示唆されているが、３−ＨＢよりも３−ＨＩＢの方が早期に上昇し始める結果は、アミノ酸代謝も運動早期から活性化されることを示していると考えられる。本参考例では、唾液中の３−ＨＩＢ濃度は、走運動終了後速やかに定常状態にまで低下したが、運動負荷が過大となりすぎた場合、いわゆるオーバーワーク状態には、運動終了後にも定常状態にまで戻りにくくなると推察される。

図１２に、運動前後の単位時間当たりの尿中３−ＨＢ排泄量及び３−ＨＩＢ排泄量を示す。血清や唾液とは異なり、運動によって、尿中３−ＨＢ排泄量及び３−ＨＩＢ排泄量の増加はみられず、尿中３−ＨＩＢ排泄量は、寧ろ低下傾向にあった（運動１時間後）。尿中３−ＨＢ排泄量は、その後、運動３時間まで増加傾向にあり、その後一旦減少したが、運動１２．５時間まで再度増加傾向にあった。尿中３−ＨIＢ排泄量は、多少の増減を繰り返しながら、運動９．５時間まで増加した。尿中３−ＨＢと３−ＨＩＢ排泄量ともに、血清や唾液のそれぞれの濃度変化との関連はみられず、腎臓組織における再吸収が影響した結果と推測された。尿を試料とする場合、随時尿か畜尿か、又はクレアチニン等での補正の必要を考慮すると、３−ＨＢと３−ＨＩＢともに、運動時、運動後の組織別エネルギー代謝状態を評価するマーカーとしては、尿中排泄量より、血清や唾液での評価が好ましいことがわかった。

［参考例９］
健常者１５名と肝硬変患者２０名から血液及び唾液を採取し、血清中と唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度を測定し、比較した。血清中と唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度は、参考例６と同様にして測定した。
血清中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度の測定結果を図１４Ａに、唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度の測定結果を図１４Ｂに、それぞれ示す。この結果、唾液中と血清中のいずれにおいても、肝硬変患者群の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度は、健常者群よりも高い傾向が観察され、これらが肝硬変マーカーとして有用であることが示された。特に唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度は、肝硬変患者群のほうが健常者群よりも有意に高かった。

［実施例１］
容器に採取された流涎に、短冊状の濾紙の一方の端部を浸漬させて毛細管現象により唾液を吸収させた後、乾燥させた唾液試料を用いて、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、２−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（濃度）を測定し、唾液試料間のばらつきを調べた。

具体的には、まず、一名の被験者から採取された流涎を１０本のチューブに分けた。各チューブに、それぞれシルマー濾紙（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の先端部（唾液と接触させる領域側の端部）から１０ｍｍまでの領域を浸漬させ、毛細管現象により唾液が当該先端部から２５ｍｍ付近にまで吸い上げた後、当該シルマー濾紙を室温（２０〜２５℃）で２０分間放置することにより乾燥させた。乾燥後のシルマー濾紙を、先端部から１０ｍｍの箇所と１５ｍｍの箇所と２０ｍｍの箇所の３箇所で切断し、当該先端部から１０ｍｍまでの断片（採取部位（１））、当該先端部からの距離が１０ｍｍから１５ｍｍまでの断片（採取部位（２））、当該先端部からの距離が１５ｍｍから２０ｍｍまでの断片（採取部位（３））を得た。つまり、採取部位（１）は、唾液に直接接触させて吸収させた部位であり、採取部位（２）及び（３）は、唾液には直接接触させず、採取部位（１）からの毛細管現象により唾液を吸い上げた部位である。

図１５に、使用したシルマー濾紙１の模式図を示す。図１５において、シルマー濾紙１の先端部（唾液と接触させる領域側の端部）は、左端部である。また、図中、「（１）」の領域が採取部位（１）（シルマー濾紙１の先端部から１０ｍｍまでの領域）であり、「（２）」の領域が採取部位（２）（シルマー濾紙１の先端部からの距離が１０ｍｍから１５ｍｍまでの領域）であり、「（３）」の領域が採取部位（３）（シルマー濾紙１の先端部からの距離が１５ｍｍから２０ｍｍまでの領域）である。また、シルマー濾紙１に吸い上げられた唾液の先端を、矢頭で示した。

１０本のシルマー濾紙から切断された採取部位（１）、採取部位（２）、及び採取部位（３）について、各断片をそれぞれ１００μＬの内部標準含有アセトニトリル溶液（１００μＬのアセトニトリルに、１５０ｎｇのＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩（標品）を溶解させた溶液）に約１分間、ボルテックスミキサーを用いて混和させながら浸漬させることにより、各断片に含有されていた唾液由来の有機酸を抽出した。有機酸を抽出させたアセトニトリル溶液を有機酸検出用試料として回収した。

各有機酸検出用試料を、それぞれエバポレートして乾燥させた後に、参考例４と同様にして、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした後、最終的に１容量％のギ酸水溶液（１ｍＬ）に再溶解させ、１μＬをＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定し、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、２−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（濃度）を求めた。

１０本の採取部位（１）の各有機酸の濃度を比較し、ばらつき（変動係数、％ＣＶ）を算出した。同様に、１０本の採取部位（２）の各有機酸の濃度のばらつきと、１０本の採取部位（３）の各有機酸の濃度のばらつきを、それぞれ算出した。算出結果を図１６に示す。この結果、４種類の有機酸全てにおいて、採取部位（３）が最もばらつきが大きく、採取部位（１）と採取部位（２）のばらつきは同程度であった。これらの結果から、シルマー濾紙のような短冊状又は棒状の濾紙を唾液吸収部材とし、唾液を毛細管現象により一方の端部から吸いあげる場合には、吸い上げられた唾液の先端近傍の領域を含む断片よりも、吸い上げられた唾液の先端からより離れた領域を含む断片を用いるほうが、試料間のばらつきが抑えられ、より信頼性の高い検出結果が得られることがわかった。

［実施例２］
シルマー濾紙の一方の端部を被検者が口にくわえることにより毛細管現象により唾液を吸収させた後、乾燥させた唾液試料を用いて、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、２−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（濃度）を測定し、唾液試料間のばらつきを調べた。
具体的には、まず、口腔内で唾液に直接触れる領域が先端部から１０ｍｍまでの領域（採取部位（１））のみとなるように、その他の領域（採取部位（２）及び採取部位（３））を銀紙で覆ったシルマー濾紙（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１０本用意した。この１０本のシルマー濾紙について、１本ずつ順次、銀紙で覆われていない先端部から１０ｍｍまでの領域を同一の被検者の舌下に約５秒間接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げて吸収させた後、室温（２０〜２５℃）で２０分間放置することにより乾燥させた。
乾燥後の１０本のシルマー濾紙から銀紙を外し、実施例１と同様にして、先端部から１０ｍｍの箇所と１５ｍｍの箇所と２０ｍｍの箇所の３箇所で切断し、当該先端部から１０ｍｍまでの断片（採取部位（１））、当該先端部からの距離が１０ｍｍから１５ｍｍまでの断片（採取部位（２））、当該先端部からの距離が１５ｍｍから２０ｍｍまでの断片（採取部位（３））を得、採取部位（１）、採取部位（２）、及び採取部位（３）から３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、２−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（濃度）を求めた。

１０本の採取部位（１）の各有機酸の濃度のばらつき（変動係数、％ＣＶ）と、１０本の採取部位（２）の各有機酸の濃度のばらつきと、１０本の採取部位（３）の各有機酸の濃度のばらつきを、それぞれ算出した。算出結果を図１７に示す。この結果、４種類の有機酸全てにおいて、吸い上げられた唾液の先端との距離が最も短い採取部位（３）が最もばらつきが大きく、採取部位（２）のばらつきが最も小さかった。また、実施例１に比べ、ばらつきが大きい傾向にあった。唾液と直接接触させなかった採取部位（２）が、唾液と直接接触させた採取部位（１）よりもばらつきが小さかったのは、採取部位（１）は口内で唾液に触れる量がまばらであったため、唾液が採取後部位（３）に向かって濾紙内を浸透するものの、直接唾液に触れる量の影響が残っている可能性があるためと考えられた。採取部位（２）は、採取部位（１）に比べ均一の唾液を含んでいる可能性が高かった。

［実施例３］
シルマー濾紙の先端に、容器に採取した流涎５μＬを染み込ませて乾燥させた唾液試料について有機酸濃度を測定し、乾燥時間が有機酸濃度の測定値に及ぼす影響を調べた。
具体的には、９本のシルマー濾紙（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の先端から１０ｍｍの範囲内に、それぞれ、流涎５μＬを滴下した後、室温（２０〜２５℃）で放置することにより自然乾燥させた。乾燥時間は、９本のシルマー濾紙のうち、５本を２０分間とし、２本を１日とし、２本を２日間とした。

乾燥後のシルマー濾紙から、先端から１０ｍｍの断片（唾液を染み込ませた領域）を切り出し、実施例１と同様にして、各断片を１００μＬの内部標準含有アセトニトリル溶液（１００μＬのアセトニトリルに、１５０ｎｇのＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩（標品）を溶解させた溶液）に浸漬させ、有機酸を抽出したアセトニトリル溶液を有機酸検出用試料として回収し、各有機酸検出用試料中のＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩、３−ＨＢ、及び３−ＨＭＢを検出し、それらの含有量（ｎｇ／５μＬ）を求めた。ＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩の含有量を図１８に、３−ＨＢの含有量を図１９に、３−ＨＭＢの含有量を図２０に、それぞれ示す。図１８〜２０中、点線で示す濃度は、同じ流涎５μＬを１００μＬの前記内部標準含有アセトニトリル溶液に混合した混合液を有機酸検出用試料として同様にして測定したＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩、３−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（ｎｇ／５μＬ）（実際の濃度）（ｎ＝４）を示す。

この結果、ＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩の濃度は、乾燥時間が２０分間の場合には実際の濃度よりもはるかに少なく、乾燥時間が長くなるほど実際の濃度に近づいた（図１７）。これは、放置（乾燥）時間が短いと濾紙に多くの水分が残存しているため、内部標準含有アセトニトリル溶液が当該濾紙に充分に染み込まないことが原因と推察された。また、３−ＨＢと３−ＨＭＢの濃度は、乾燥時間が２０分間の場合には実際の濃度よりもはるかに高かったが、乾燥時間が１〜２日間の試料では、実際の濃度に近似した濃度となった。乾燥時間が２０分間の場合に３−ＨＢと３−ＨＭＢの濃度が直接測定値より高く算出されたのは、内部標準値が低く測定されたためと推察される。これらの結果から、濾紙に吸収させることによって採取された唾液試料は、充分に乾燥させた後に測定に供することにより、唾液中の３−ＨＢ等の有機酸を直接測定した値とほぼ同等の測定結果が得られることが確認された。

［実施例４］
３種類の素材の異なる濾紙を唾液吸収部材とし、唾液吸収部材の素材が有機酸の測定値に与える影響を調べた。
具体的には、唾液吸収部材として、シルマー濾紙（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ガラス繊維からなるＧＦ／Ｂ濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）、及び合成樹脂繊維からなるＳＯＳ（ＳＡＬＩＭＥＴＲＩＣＳ ＯＲＡＬ ＳＷＡＢ）濾紙（ＳＡＬＩＭＥＴＲＩＣＳ社製）を用いた。各濾紙に、一の被験者から容器に採取した流涎を５μＬずつ滴下した後、室温（２０〜２５℃）で２０分間放置することにより自然乾燥させた。シルマー濾紙の場合には先端から１０ｍｍの領域を切り出した断片に（ｎ＝５）、ＧＦ／Ｂ濾紙の場合には８等分した断片に（ｎ＝５）、ＳＯＳ濾紙の場合には高さが５ｍｍとなるように切断した円柱を半分に切断した断片に（ｎ＝５）、それぞれ流涎を滴下した。

実施例１と同様にして、乾燥後の各濾紙断片を１００μＬの内部標準含有アセトニトリル溶液（１００μＬのアセトニトリルに、１５０ｎｇのＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩（標品）を溶解させた溶液）に浸漬させ、有機酸を抽出したアセトニトリル溶液を有機酸検出用試料として回収し、各有機酸検出用試料中のＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢを検出し、それらの含有量（ｎｇ／５μＬ）を求めた。また、同じ流涎５μＬを１００μＬの前記内部標準含有アセトニトリル溶液に混合した混合液を有機酸検出用試料として同様にして各有機酸の濃度（実際の濃度）を測定した（ｎ＝４）（唾液直接測定）。ＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩の含有量を図２１に、３−ＨＢの含有量を図２２に、３−ＨＩＢの含有量を図２３に、３−ＨＭＢの含有量を図２４に、２−ＨＢの含有量を図２５に、それぞれ示す。この結果、３種類の濾紙のうち、ＳＯＳ濾紙では、自然乾燥時間が２０分間であっても、内部標準の測定値が直接唾液測定値と同等であり、唾液中の４種の有機酸はいずれもほぼ正確に測定できた。

［参考例１０］
健常者の唾液中の乳酸及びＤ−乳酸の重水素同位体について、２−ピリジンメタノールで誘導体化した後、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。
まず、健常者から採取された流涎を、−２０℃にて一旦凍結し、その後解凍したものを、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、粘性蛋白質（ムチン）を分解し、唾液中に含まれている食べかす等と共に沈殿させ、上清を得た。得られた唾液上清を分析に用いた。
次いで、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）（１００μＬ）に、Ｄ−乳酸（標品、１００ｎｇ）又は前記唾液上清（５μＬ）と、Ｄ−乳酸の重水素同位体（標品、Ｄ−乳酸−ｄ_３、５００ｎｇ）とを溶解させた試料溶液を調製し、エバポレートして乾燥させた後に、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした。最終的に１容量％のギ酸水溶液（１００μＬ）に再溶解させ、５μＬ（唾液２５０ｎＬ中の固形分相当、Ｄ−乳酸が５ｎｇ相当、Ｄ−乳酸−ｄ_３が２５ｎｇ相当）を、前述の通りにＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。

ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図２６に示す。図２６Ａに、２−ピリジンメタノールで誘導体化された乳酸（２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ）と重水素同位体（２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ−ｄ_３）を含む試料のｍ／ｚ １８２．１を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図２６Ｂに図２６Ａの２ＰＭ−ＬａｃｔａｔｅピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。また、図２６Ｃに、標品のＤ−乳酸を用いた場合の２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅと２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ−ｄ_３のＳＲＭクロマトグラムを、図２６Ｄに、唾液上清を用いた場合の２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅと２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ−ｄ_３のＳＲＭクロマトグラムを示した。当該クロマトグラムより、２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ−ｄ_３に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめることにより、唾液中の乳酸濃度を決定できる。この結果、測定に供した試料には、唾液５μＬに由来する乳酸しか含まれていなかったにもかかわらず、２−ピリジンメタノールで誘導体化することにより、低感度高情報量のスキャンモードで、乳酸をスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、乳酸の２ＰＭエステル誘導体は、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢの２ＰＭエステル誘導体とはいずれも明らかに分離して解析できた。これらの結果から、２−ピリジンメタノールで誘導体化してＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを行うことにより、唾液中の微量の乳酸を、構造類似の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢと区別して、精度よく高感度に同時検出できることがわかった。

［参考例１１］
被検者から採取された唾液（流涎）中の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の室温における保存安定性を調べた。
具体的には、健常者から１本のチューブに採取（流涎）した唾液を７本のチューブに分注した。７本のチューブのうちの１本については、採取後速やかに−２０℃で凍結保存した。残りの６本については、それぞれ、室温で１、２、４、６、１０、又は２４時間放置した後、−２０℃で保存した。凍結保存した唾液試料は、分析時に室温で自然解凍した。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、粘性蛋白質（ムチン）を分解し、唾液中に含まれている食べかす等と共に沈殿させ、上清を分析に用いた。

−２０℃で保存後の各唾液中の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度を、内部標準としてＤＬ−３−ＨＢ−^１３Ｃ_４ナトリウム塩及びＤ−乳酸−ｄ_３を用い、誘導体化試薬として２−ピリジンメタノールを用いて、参考例４と同様にしてＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。クロマトグラムより、２ＰＭ−３−ＨＢの［^１３Ｃ_４］同位体及びＤ−乳酸−ｄ_３に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて、唾液中の３−ＨＢ濃度、３−ＨＩＢ濃度、３−ＨＭＢ濃度、２−ＨＢ濃度、及び乳酸濃度を決定した。測定結果を図２７に示す。この結果、唾液試料から、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸を分離して定量的に検出することができた。また、唾液中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、採取後室温で放置される時間にかかわらず、ほぼ安定しており、３−ＨＭＢ濃度は室温保存６時間までは安定しており、室温保存１０時間以降で緩やかな減少傾向が観察された。これに対して、唾液中の２−ＨＢ濃度及び乳酸濃度は、室温保存１時間後から急激に濃度が減少しており、室温における保存安定性が低いことが確認された。

［参考例１２］
流涎法にて採取した唾液に対し、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）阻害剤であるオキサミン酸ナトリウムを最終濃度２００μＭとなるように添加した状態で、参考例１１と同様にして室温で１〜２４時間放置し、室温保存時における唾液中の２−ＨＢ濃度及び乳酸濃度の低下に対するＬＤＨ阻害剤の効果を調べた。この結果、唾液中の乳酸濃度の減少傾向は、オキサミン酸ナトリウム無添加の場合に比べてやや緩やかではあるものの、依然として乳酸濃度は経時的に低下していた。また、唾液中の２−ＨＢ濃度は、オキサミン酸ナトリウムを添加した場合と無添加の場合で差はなかった（データ図示せず。）。
また、添加するオキサミン酸ナトリウムの最終濃度を、５００μＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭまで増加させ、２４時間放置してした後の試料を検討した場合であっても、唾液中の２−ＨＢ濃度及び乳酸濃度の低下は、抑制できなかった（データ図示せず。）。

被検者から採取された唾液（流涎）に、ギ酸、水酸化ナトリウム、塩酸、又は塩化ベンザルコニウムを有効成分とする抗菌剤「Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈ（登録商標）」（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、組成：５０質量％ 塩化ベンザルコニウム、１０質量％ エタノール、４０質量％ 水）を添加し、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の室温における保存安定性を調べた。
具体的には、健常者から１本のチューブに採取（流涎）した唾液を、８本のチューブにチューブ１本当たり５００μＬずつ分注した。８本のチューブのうちの１本については、採取後速やかに−２０℃で凍結保存した。残りの７本のうちの１本は何も添加せず、残る６本には、それぞれ、０．００１容量％ ギ酸水溶液、０．０１容量％ ギ酸水溶液、１容量％ ギ酸水溶液、０．００１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液、０．００１Ｎ 塩酸、又は０．１容量％ Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈ水溶液をそれぞれ１／１００倍量（５μＬ）を直ちに混和し、室温で２４時間放置した後、−２０℃で保存した。なお、ｐＨ試験紙を用いて各唾液のｐＨを測定したところ、１容量％ ギ酸水溶液を添加した唾液のｐＨは３〜４程度の酸性であり、その他の唾液のｐＨは６〜８程度の中性であった。凍結保存した唾液試料は、分析時に室温で自然解凍した。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、粘性蛋白質（ムチン）を分解し、唾液中に含まれている食べかす等と共に沈殿させ、得られた唾液上清を分析に用いた。

−２０℃で保存後の各唾液中の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度を、参考例１１と同様にして測定した。測定結果を図２８に示す。この結果、２４時間室温放置後の唾液では、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度が顕著に低下しており、３−ＨＢの濃度が上昇していたが、０．１容量％ Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈを添加した唾液では、室温２４時間放置後でも、２−ＨＢ、乳酸、及び３−ＨＭＢの濃度がほとんど低下しておらず、３−ＨＢの濃度も上昇しておらず、室温放置していない唾液とほぼ同程度の濃度であった。また、ｐＨが酸性であった１容量％ ギ酸水溶液を添加した唾液も、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度低下並びに３−ＨＭＢの濃度上昇が抑制されることがわかった。その他の添加剤を添加した唾液では、添加剤無添加の場合と同様に、室温放置によって３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度低下並びに３−ＨＭＢの濃度上昇が観察された。これらの結果から、唾液に抗菌剤を添加したり、唾液のｐＨを酸性に調整することによって、唾液中の３−ＨＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の保存安定性が改善できることがわかった。また、２−ＨＢ及び乳酸の濃度低下が抗菌剤添加により抑制されたことから、唾液の室温放置による２−ＨＢ量及び乳酸量の低下は、口内バクテリアによる分解のためと推察された。

また、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬による誘導体化を行う試料として、唾液上清にアセトニトリル／水（１／１９、容量比）を混合したところ、添加剤を添加していない唾液上清では濁りがあったが、０．１容量％ Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈ水溶液を添加した唾液上清では凝集沈殿が生じており、液性部分は透明であった。唾液の濁りは、主にバクテリアであり、抗菌剤の添加により死滅して凝集して沈殿した結果、唾液が透明になったと推測された。

［参考例１３］
被検者から採取された血清と唾液（流涎）中における、乳酸の濃度の相関性を調べた。具体的には、健常人１名から異なる日に同時に採取した血液及び唾液について、これらの乳酸の濃度を測定し、血清中濃度と唾液中濃度の相関性を調べた。
血液は、血清分離剤入りの採血管に採取し、凝固後、遠心分離処理により血清を採取し、分析まで−２０℃にて保存した。唾液は、流涎法にて採取後、５００μＬに対し５μＬの０．１％ Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈ水溶液を直ちに混和し、分析まで−２０℃にて保存した。血清中及び唾液中の乳酸の濃度は、参考例１１と同様にして測定した。測定結果を図２９に示す。この結果、乳酸の唾液中濃度は、血清中濃度と相関することが確認された。

１…シルマー濾紙

Claims (20)

1. 唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、
   前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させる乾燥工程と、
   を有し、
   前記吸収工程において、
   （ｉ）前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させること、又は
   （ｉｉ）前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材から、所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収すること
   により、所定量の唾液に由来する固形分が唾液吸収部材に乾燥状態で保持された唾液試料を調製することを特徴とする、唾液試料の調製方法。
2. 前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、
   前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を唾液に接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、
   前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている領域から、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収する、請求項１に記載の唾液試料の調製方法。
3. 前記唾液が、液体状態で唾液容器に収容されているものである、請求項１又は２に記載の唾液試料の調製方法。
4. 前記吸収工程を、前記唾液吸収部材を被検者の口腔内において唾液と接触させることにより行う、請求項１又は２に記載の唾液試料の調製方法。
5. 前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、
   前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、
   前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、被検者の口腔内において唾液と直接接触していなかった領域であり、かつ吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている領域から、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収する、請求項４に記載の唾液試料の調製方法。
6. 前記乾燥工程前に、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材に、抗菌剤を含有させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の唾液試料の調製方法。
7. 前記吸収工程において、唾液と抗菌剤の混合物を前記唾液吸収部材に吸収させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の唾液試料の調製方法。
8. 前記唾液吸収部材が、予め抗菌剤を保持している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の唾液試料の調製方法。
9. 唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、
   前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を、抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させる抗菌剤処理工程と、
   を有し、
   前記吸収工程において、
   （ｉ）前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させること、又は
   （ｉｉ）前記吸収工程後、前記唾液吸収部材から所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収したものを、前記抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させること
   により、所定量の唾液に由来する固形分と唾液吸収部材を含有する溶液である唾液試料を調製することを特徴とする、唾液試料の調製方法。
10. 前記抗菌剤が、第四級アンモニウム塩系抗菌剤である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の唾液試料の調製方法。
11. 前記吸収工程において前記唾液吸収部材に吸収させる唾液量が、前記唾液吸収部材の最大吸収量である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の唾液試料の調製方法。
12. 前記所定量が、１〜５０μＬである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の唾液試料の調製方法。
13. 前記唾液吸収部材が、合成樹脂繊維からなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の唾液試料の調製方法。
14. 前記乾燥工程における乾燥が、自然乾燥である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の唾液試料の調製方法。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の唾液試料の調製方法により得られた唾液試料を、極性有機溶剤に浸漬させることにより、前記唾液試料から唾液由来の有機酸を抽出する抽出工程と、
    前記抽出工程の後、有機酸が抽出された極性有機溶剤を、唾液由来有機酸検出用試料として、前記唾液試料から分離して回収する回収工程と、
    前記回収工程により回収された唾液由来有機酸検出用試料中の有機酸を下記一般式（１）−１〜（１）−３
    

    

    （式（１）−１〜３中、Ｒ^１及びＲ^２は、一方が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
    のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体を、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）法により検出する検出工程と、
    を有することを特徴とする、唾液中の有機酸の検出方法。
16. 前記極性有機溶剤が、アセトニトリルである、請求項１５に記載の唾液中の有機酸の検出方法。
17. 前記抽出工程において、前記唾液試料を、予め内部標準物質を含有させた極性有機溶剤に浸漬させる、請求項１５又は１６に記載の唾液中の有機酸の検出方法。
18. 前記誘導体化試薬が２−ピリジンメタノール、１−ピペリジンエタノール、及び２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンからなる群より選択される１種以上である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の唾液中の有機酸の検出方法。
19. 前記有機酸が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、２−ヒドロキシ酪酸、及び乳酸からなる群より選択される１種以上である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の唾液中の有機酸の検出方法。
20. 同一の被験者から経時的に調製された複数の唾液試料に対して、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の唾液中の有機酸の検出方法を行い、前記被験者の唾液中の有機酸濃度の経時的変化を調べることを特徴とする、有機酸濃度の経時的変化の測定方法。

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