JP7285218B2 - 有機酸代謝物を検出かつ定量する質量分析法 - Google Patents
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Description
この出願は、その全体内容が参照によって本明細書中に援用される、2017年4月20日に出願された米国仮特許出願第62/487,542号の利益を主張する。
発明の背景を記載する以下の情報は、発明の理解を助けるために提供されるものであり、発明に対する先行技術を構成または記載することを認めるものではない。
発明の第1の態様では、試料において、1つ以上の分析物の存在、非存在、または量を質量分析によって判定する方法は、複数のステップを備える。1つ以上の分析物は、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、イソ酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。実行時間は、6分未満である。方法は、1つ以上の分析物の各々から質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するのに適した状況下で、試料をイオン化源にさらすことであって、1つ以上の分析物は、イオン化の前に誘導体化される、さらすことと;単独の注入において、1つ以上の分析物の各々からの1つ以上のイオンの量を質量分析によって測定することと;1つ以上のイオンの測定された量を用いて、試料における1つ以上の分析物の各々の量を判定することとを備える。
試料において、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、ピバル酸、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の分析物の存在、非存在、または量を検出する方法が記載される。本明細書中に記載された方法を用いて検出される「エネルギー代謝物」は、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸を含む。本明細書中に記載された方法を用いて検出される「TCA回路の中間物質」は、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸を含む。
「分離」という用語は、複合混合物をその構成分子または代謝物に分離するプロセスを指す。一般の、例示的な実験分離技術は、電気泳動法およびクロマトグラフィを含む。
分析物を含む試料抽出物は、試料における分析物を、試料において存在し得る高分子(例えば、たんぱく質、核酸、脂質)から単離させることによって調製される。「試料抽出物」、「抽出された試料」、または「抽出分析物」という用語は、本明細書中で、「分析試料」とも称され得、用語は言い換え可能に用いられ得る。試料におけるいくつかのまたは全ての分析物は、たんぱく質に結合され得る。MS分析の前に分析物(複数可)とたんぱく質の相互作用を妨げるのに様々な方法が用いられ得る。例えば、分析物は試料から抽出されて、液体抽出物を生成し得、存在し得るたんぱく質は、沈殿かつ除去され得る。たんぱく質は、例えばメタノール、アセトニトリル、またはエチルアセテートの溶液を用いて沈殿され得る。試料におけるたんぱく質を沈殿させるために、メタノール、アセトニトリル、またはエチルアセテート溶液が試料に加えられ、そして、混合物は、遠心分離機で回転させられて、液体上清(抽出分析物を含む)を、沈殿たんぱく質から分離し得る。
質量分析の前に、分析試料は、電気泳動、ろ過、遠心分離、アフィニティ分離、またはクロマトグラフィなどの1つ以上の分離法にさらされ得る。一実施形態では、分離法は、例えば超高速LC(UHPLC)を含む液体クロマトグラフィ(LC)を備え得る。
1つ以上の分析物は、例えば質量分析によってイオン化され得る。質量分析は、分画された試料をイオン化しかつさらなる分析のために荷電分子を生成するためのイオン化源を含む質量分析計を用いて行われる。イオン化は、例えばエレクトロスプレーイオン化(ESI)によって行われ得る。他のイオン源は、例えば大気圧化学イオン化(APCI)、加熱エレクトロスプレーイオン化(HESI)、大気圧光電離(APPI)、フレームイオン化検出器(FID)、またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)が挙げられる。イオン化法の選択は、いくつかの検討事項に基づいて判定され得る。例示的な検討事項として、測定される分析物、試料の種類、検出器の種類、およびポジティブまたはネガティブモードの選択が挙げられる。
酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、およびカプロン酸(ヘキサン酸、C6)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)、ピバル酸、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、およびイソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の分析物を評価するキットが本明細書中に記載される。例えば、キットは、包装材料、誘導体化試薬、触媒試薬、および1つ以上のアッセイに十分な量で1つ以上の校正標準または内部標準または品質管理試料の測定量を含み得る。例示的な実施形態では、内部標準は、同位体標識され得、キットは、プレメードの、校正標準溶液、内部標準溶液、触媒試薬溶液、移動相溶液、品質管理試料、品質管理試料の再構成溶液を備え得、かつ/または、キットは、校正標準試薬、内部標準試薬、触媒試薬、移動相試薬、ならびに校正標準溶液、内部標準溶液、触媒試薬溶液、移動相溶液、および品質管理試料を調製するための指示を備え得る。キットはまた、1つ以上の分析物を測定するのに試薬を用いるための有形の形式(例えば、例として指示説明書といった紙、または電子媒体上)で記録された指示も備え得る。
I.試薬および機器
酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、イソ酪酸、酪酸ナトリウム、2-メチル-酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、ヘキサン酸、酢酸ナトリウム-d3、ギ酸、N,N’ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、およびピリジンが、Sigma Aldrichから取得され;プロピオン酸ナトリウム-d5、イソ吉草酸―d3、酪酸ナトリウム-d3、2-メチル-酪酸―d3、イソ吉草酸―d9、吉草酸―d3、ヘキサン酸―d3、乳酸ナトリウム―d4、リンゴ酸―d3、およびコハク酸―d4が、CDN Isotopesから取得され;ピルビン酸ナトリウム-13C3、フマル酸―13C4、クエン酸―d4、および二ナトリウムα―ケトグルタル酸―13C4が、Cambridge Isotope Laboratoriesから取得され;1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC塩酸塩)および2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩が、TCI Americaから取得された。HPLCグレードのメタノールは、Fisher Scientificから取得され;HPLCグレードのアセトニトリルおよびHPLCグレードの水は、Acrosから取得された。VWR ScientificからのMulti-Tube Vortexerが、混合に用いられた。プレートの遠心分離が、3617バケットロータを用いてThermo ScientificのSorvall ST 40R遠心分離機で実行された。
作業内部標準(WIS)溶液が、水中において(酢酸ナトリウム-d3、プロピオン酸ナトリウム-d5、イソ酪酸―d3、および酪酸ナトリウム-d3、乳酸ナトリウム-d4、ピルビン酸ナトリウム―13C3、二ナトリウムα―ケトグルタル酸―13C4、クエン酸―d4、リンゴ酸―d3、フマル酸―13C4、コハク酸―d4に対して)またはメタノール:水(1:1)中において(2-メチル-酪酸-d3、イソ吉草酸―d9、吉草酸―d3、ヘキサン酸―d3に対して)、表1に示す濃度で調整された。標識された内部標準は、アコニット酸またはイソクエン酸に対して利用可能ではなく、構造的に類似の標準クエン酸―d4が、それら分析物の定量に用いられた。
示した試料の種類に対する各分析物の校正範囲は、既知の濃度の校正標準が混ぜられた溶液を用いて判定された。校正を混ぜた溶液は、対応する校正濃度の20倍に調製された。例えば、代表的な分析物に対して、各校正標準における分析物終濃度が、細菌培養上清および糞便試料それぞれに対して表2および3にリスト化される。当業者は、過度の実験をせずとも、追加の分析物に対するかつ追加の試料の種類における校正範囲をどのように判定するかを理解するだろう。各分析物に対して、LLOQは、校正範囲の下端を表し、校正範囲の上端は、ULOQによって表される。示した試料の種類の校正範囲を網羅するのに、10の校正標準(表2における標準A~J)が、細菌培養上清試料を分析するために用いられ、8の校正標準(表3における標準A~H)が、糞便試料を分析するために用いられた。
A.試料調製
細菌培養上清試料
試料調製は、ポリプロピレン96-ウェルプレートで実行された。実験試料、QC試料、および校正標準は、氷上で解凍され、ボルテックスされた。50.0μLの細菌培養上清続いて20.0μLの作業内部標準溶液(WIS)が、96-ウェルプレートの適切なウェルに加えられた。ブランク-IS試料として、50.0μLの水および20.0μLのWISが適切なウェルに加えられ、70.0μLの水がブランク試料として加えられた。
約100mgの凍結された糞便または組織(実験試料)が、2mLクライオバイアル内に加重され、正確な重量が記録された。ブランク試料およびブランク―IS試料として、100μLの水が、2mLクライオバイアルに加えられた。校正標準として、100μLの対応する校正溶液が、2mLクライオバイアルに加えられた。QC試料として、250μLのQC試料抽出物が2mLクライオバイアルに加えられた。20.0μL量のWIS溶液が、校正標準、ブランク―IS、QC試料、および実験試料に加えられ、20.0μLの水がブランク試料に加えられた。
50.0μlの実験試料がマイクロタイタープレートのウェルに加えられた。ブランク試料およびブランク―IS試料として、50.0μLの水が、マイクロタイタープレートのウェルに加えられた。校正標準として、50.0μLの対応する校正溶液が、マイクロタイタープレートのウェルに加えられた。QC試料として、対応する試料の種類に対する50.0μLのQC試料が、マイクロタイタープレートのウェルに加えられた。20.0μL量のWIS溶液が、校正標準、ブランク―IS、QC試料、および実験試料に加えられ、20.0μLの水がブランク試料に加えられた。
たんぱく質および抽出分析物を沈殿させるために、200μLのメタノールが試料に加えられ、試料は、少なくとも1分間振られまたはボルテックスされ、3000rpmで3分間遠心分離機にかけられた。40.0μL量の清澄化された上清は、未使用の96-ウェルプレート内に運ばれ、分析試料は誘導体化された。プレートは蓋をされ、ボルテックスされ、3000rpmで0.5分間遠心分離機にかけられた。プレートは、40℃で30分間加熱され、3000rpmで0.5分間遠心分離機にかけられた。各ウェルから50.0μLが、未使用の96-ウェルプレート内に運ばれ、450μLのメタノール/水溶液(1:1)が全てのウェルに加えられた。LC-MS/MS分析の前に、プレートは蓋をされ、ボルテックスされた。
誘導体化試薬、3-ニトロフェニルヒドラジン、3-クロロフェニルヒドラジン塩酸塩、2,4-シクロフェニルヒドラジン、および2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩が試験され、誘導体化試薬、2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩および3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩が、本明細書中に記載された方法に用いるために選択された。試薬、3-ニトロフェニルヒドラジン、3-クロロフェニルヒドラジン、および2,4-ジクロロフェニルヒドラジンは、C5同位体を分離せず、SCFA 2-メチル酪酸のピバル酸との共溶出をもたらした。図1は、Hanらに記載されるような、誘導体化試薬3-ニトロフェニルヒドラジンおよびLC-MS/MS条件を用いて、ピバル酸が2-メチル酪酸と共溶出することを示す。クロマトグラフ分離に加えて、ピバル酸の存在下での2-メチル酪酸の選択的測定は、2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン誘導体に対するm/z125の娘イオンを用いることによって達成された。なぜなら対応するピバル酸誘導体は、この娘イオンを形成していないからである(図2)。
一例では、抽出分析物は、誘導体化試薬として2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩を、かつカップリング触媒としてEDC塩酸塩を用いて誘導体化された。2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩の溶液(10.0μL)およびECD塩酸塩の溶液(20.0μL)が、各々終濃度が25μg/μlになるように、LC-MS/MS分析の前に分析試料に加えられた。
別の例では、抽出分析物は、誘導体化試薬として2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩を、かつカップリング触媒として1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびDICを、かつ塩基としてピリジンを用いて誘導体化された。DIC、ピリジン、ならびに2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩および1-ヒドロキシベンゾトリアゾールの溶液が、LC-MS/MS分析の前に分析試料に加えられた。終濃度は、2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩および1-ヒドロキシベンゾトリアゾールに対して各々25μg/μlであり、各々2μlの100%DICおよびピリジンが抽出物に加えられた。
別の例では、抽出分析物は、誘導体化試薬として3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩を、かつカップリング触媒として1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびDICを、かつ塩基としてピリジンを用いて誘導体化された。DIC、ピリジン、ならびに3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩および1-ヒドロキシベンゾトリアゾールの溶液が、LC-MS/MS分析の前に分析試料に加えられた。終濃度は、3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩および1-ヒドロキシベンゾトリアゾールに対して各々25μg/μlであり、各々2μlの100%DICおよびピリジンが抽出物に加えられた。
クロマトグラフィ法
液体クロマトグラフィ法は、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、ピバル酸、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上、2つ以上、かつ全20までの分析物を同一の注入で精製および分離するために開発された。二成分溶媒ポンプユニット、冷却されたオートサンプラー(18℃に設定される)、およびカラムヒータ(60℃に設定される)を備えるAgilent 1290 Infinity UHPLCシステムを、逆相カラム(Waters ACQUITY C18 BEH Shield、1.7μm、2.1x100mm)とともに液体クロマトグラフィに用いた。移動相Aは、水中0.01%ギ酸であり、移動相Bは、アセトニトリル中0.01%ギ酸であった。直線勾配溶出は、20%移動相B(80%移動相A)および800μL/分の流速という初期条件で実行された。クロマトグラフィおよび質量分析を含む合計実行時間は、5.40分であった。
上記のクロマトグラフィ法で記載されたクロマトグラフィカラムからの溶出液は、質量分析計のエレクトロスプレー源内に直接かつ自動的に導入された。針の洗浄のために、メタノール:水(50:50)が用いられた。質量分析は、Turbo V source(ESI)とともにAB Sciex QTrap 5500質量分析計を用いて分析試料に対して行われた。機器は、ネガティブ多重反応モニタリング(MRM)モードで動作した。イオンスプレー電圧は、-4.5kVに、源の温度は500℃に、カーテンガス(例えば窒素)は30psiに、噴霧器および脱溶媒ガス(例えば窒素)の流速は70psiに、衝突活性化解離(CAD)ガス(例えば窒素)は中間に設定された。
SCFAは、誘導体化法2を用いて実施例1に記載された方法を用いて試料において測定された。方法を用いて、血漿、血清、尿、糞便、母乳、唾液、および細胞培養上清を含む多様な試料の種類における酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)といったSCFA分析物の絶対量を判定した。
本発明に関連して、以下の内容を更に開示する。
[1]
試料において、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、イソ酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ―ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の分析物の存在、非存在、または量を質量分析によって判定する方法であって、実行時間は、6分未満であり、
a)前記1つ以上の分析物の各々から質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するのに適した条件下で、前記試料をイオン化源にさらすことであって、前記1つ以上の分析物は、イオン化の前に誘導体化される、さらすことと、
b)単独の注入において、前記1つ以上の分析物の各々からの前記1つ以上のイオンの量を質量分析によって測定することと、
c)前記1つ以上のイオンの前記測定された量を用いて、前記試料における前記1つ以上の分析物の各々の前記量を判定することとを含む、方法。
[2]
試料において、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、イソ酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の分析物の存在、非存在、または量を質量分析によって判定する方法であって、実行時間は、6分未満であり、
a)前記1つ以上の分析物の各々から質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するのに適した条件下で、前記試料をイオン化源にさらすことであって、前記1つ以上の分析物は、イオン化の前に誘導体化される、さらすことと、
b)単独の注入において、前記1つ以上の分析物の各々からの前記1つ以上のイオンの量を質量分析によって測定することと、
c)前記1つ以上のイオンの前記測定された量を用いて、前記試料における前記1つ以上の分析物の各々の前記量を判定することとを含む、方法。
[3]
試料において、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、イソ酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の分析物の存在、非存在、または量を質量分析によって判定する方法であって、ピバル酸の干渉が排除され、
a)前記1つ以上の分析物の各々から質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するのに適した条件下で、前記試料をイオン化源にさらすことであって、前記1つ以上の分析物は、イオン化の前に誘導体化される、さらすことと、
b)単独の注入において、前記1つ以上の分析物の各々からの前記1つ以上のイオンの前記量を質量分析によって測定することと、
c)前記1つ以上のイオンの前記測定された量を用いて、前記試料における前記1つ以上の分析物の各々の前記量を判定することとを含む、方法。
[4]
試料において、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の分析物の存在、非存在、または量を質量分析によって判定する方法であって、実行時間は、6分未満であり、
a)前記1つ以上の分析物の各々から質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するのに適した条件下で、前記試料をイオン化源にさらすことであって、前記1つ以上の分析物は、イオン化の前に誘導体化される、さらすことと、
b)単独の注入において、前記1つ以上の分析物の各々からの前記1つ以上のイオンの前記量を質量分析によって測定することと、
c)前記1つ以上のイオンの前記測定された量を用いて、前記試料における前記1つ以上の分析物の各々の前記量を判定することとを含む、方法。
[5]
2つ以上の分析物の前記量が判定される、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
3つ以上の分析物の前記量が判定される、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[7]
4つ以上の分析物の前記量が判定される、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[8]
5つ以上の分析物の前記量が判定される、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[9]
前記2つ以上の分析物の1つが、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、イソ酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)からなる群から選択され、
前記2つ以上の分析物の1つが、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、[5]に記載の方法。
[10]
前記2つ以上の分析物の1つが、ピルビン酸である、[5]に記載の方法。
[11]
前記試料が、少なくとも2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩または3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩を用いて誘導体化される、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[12]
前記試料が、少なくとも2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩を用いて誘導体化され、前記試料が、糞便試料である、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[13]
前記試料が、少なくとも3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩を用いて誘導体化され、前記試料が、血漿試料である、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[14]
ECD塩酸塩、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、N,N’ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、およびジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)からなる群から選択される1つ以上のカップリング触媒も誘導体化に用いられる、[11]に記載の方法。
[15]
酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、および酪酸(C4)の前記量が判定される、[6]に記載の方法。
[16]
酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、および乳酸の前記量が判定される、[7]に記載の方法。
[17]
酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、および酪酸(C4)の前記量が判定される、[7]に記載の方法。
[18]
酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、およびカプロン酸(ヘキサン酸、C6)の前記量が判定される、[7]に記載の方法。
[19]
前記質量分析計がネガティブモードで動作する、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[20]
前記試料が、イオン化源にさらされる前に、液体クロマトグラフィによって精製されている、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[21]
前記液体クロマトグラフィが、高速液体クロマトグラフィ、超高速液体クロマトグラフィ、および乱流液体クロマトグラフィからなる群から選択される、[20]に記載の方法。
[22]
前記試料が、イオン化源にさらされる前に、高速液体クロマトグラフィまたは超高速液体クロマトグラフィのいずれかによって精製されている、[20]に記載の方法。
[23]
内部標準が、前記試料における前記1つ以上の分析物の前記量を判定するのに用いられる、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[24]
前記内部標準が、測定される前記1つ以上の分析物のうちの少なくとも1つの同位体標識された類似物質を備える、[23]に記載の方法。
[25]
前記試料が、生体試料を備える、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[26]
前記試料が、血液、血漿、尿、糞便、細菌培養上清、血清、母乳、唾液、および組織からなる群から選択される、[25]に記載の方法。
[27]
前記1つ以上の分析物の各々の前記量を判定するのに用いられる前記1つ以上のイオンが、表4および5のイオンから選択される1つ以上のイオンである、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[28]
前記質量分析がタンデム質量分析である、[1]、[2]、[3]、または[4]のいずれかに記載の方法。
[29]
キットであって、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の分析物の各々に対する内部標準として1つ以上の同位体標識された類似物質、および包装材料および前記キットの使用説明を備える、キット。
[30]
誘導体化試薬、触媒試薬、校正標準、または品質管理試料をさらに備える、[29]に記載のキット。
Claims (11)
- 試料において、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、イソ酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ―ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の分析物の存在、非存在、または量を質量分析によって判定する方法であって、しかも、
前記2つ以上の分析物の少なくとも1つが、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、イソ酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)からなる群から選択され、および、
前記2つ以上の分析物の少なくとも1つが、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸からなる群から選択され、
実行時間は、6分未満であり、
a)前記2つ以上の分析物の各々から質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するのに適した条件下で、前記試料をイオン化源にさらすことであって、前記2つ以上の分析物は、イオン化の前に誘導体化されることと、
b)単独の注入において、前記2つ以上の分析物の各々からの前記1つ以上のイオンの量を質量分析によって測定することと、
c)前記1つ以上のイオンの前記測定された量を用いて、前記試料における前記2つ以上の分析物の各々の前記量を判定することとを含む、方法。 - ピバル酸の干渉が排除される、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、少なくとも2,4-ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩または3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩を用いて誘導体化される、請求項1又は2に記載の方法。
- 2つ以上の分析物の存在、非存在、または量は、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、および酪酸(C4)の前記量を判定することを含み、前記2つ以上の分析物の少なくとも1つが、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 2つ以上の分析物の存在、非存在、または量は、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、および乳酸の前記量を判定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 2つ以上の分析物の存在、非存在、または量は、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、および酪酸(C4)の前記量を判定することを含み、前記2つ以上の分析物の少なくとも1つが、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 2つ以上の分析物の存在、非存在、または量は、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、およびカプロン酸(ヘキサン酸、C6)の前記量を判定することを含み、前記2つ以上の分析物の少なくとも1つが、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 質量分析計がネガティブモードで動作する、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- キットであって、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、イソ酪酸(C4)、酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される2つ以上の分析物の各々に対する内部標準として分析物の1つ以上の同位体標識された類似物質の各々、および包装材料および前記キットの使用説明を備える、キットであり、しかも、
前記2つ以上の分析物の1つが、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)、イソ酪酸(C4)、2-メチル-酪酸(C5)、イソ吉草酸(C5)、吉草酸(C5)、カプロン酸(ヘキサン酸、C6)、3-メチル吉草酸、4-メチル吉草酸(イソカプロン酸)からなる群から選択され、そして、
前記2つ以上の分析物の1つが、乳酸、ピルビン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、アルファ-ケトグルタル酸、アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記のキット。 - 誘導体化試薬、触媒試薬、校正標準、または品質管理試料をさらに備える、請求項10に記載のキット。
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