CN109374790A - 一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法 - Google Patents

一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于HPLC的α‑酮戊二酸含量测定试剂盒及方法，该试剂盒包括由盐酸、EDTA和水组成的试剂一，由NaOH和水组成的试剂二，由盐酸苯肼和水组成的试剂三，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水组成的试剂四以及α‑酮戊二酸标准品；该方法原理为利用α‑酮戊二酸与衍生剂反应产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离后，用紫外检测器可测定α‑酮戊二酸的含量。本发明可检测到微克级别的含量，灵敏度高，本发明的样本前处理的过程简单易操作，节约人力，本发明的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本低廉，且本发明相对于生物免疫检测方法，所需试剂的价格具有明显优势，且基本无毒，安全环保。

Description

一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生命科学领域领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法（HPLC）的的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法。
背景技术
α-酮戊二酸是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点，在循环中的位置位于异柠檬酸之后以及琥珀酰辅酶A之前。在这一部位，回补反应可以通过自谷氨酸的转氨基作用产生α-酮戊二酸，从而达到补充此中间代谢产物的目的。
目前市面上已有的检测α-酮戊二酸的方法可分为三大类，分光法，生物免疫检测技术以及高效液相检测技术。分光法的原理是利用α-酮戊二酸的衍生物在特定波长下有吸收值进行大概的含量检测，一般极容易受到体系复杂杂质，色素等影响，含很容易出现测试含量偏高。生物免疫检测的方法一来容易受到交叉反应的干扰，二来抗体的不通用性以及制备时间较长，整个时间周期很长，价格昂贵。色谱技术近些年飞速发展，检测生物体内小分子的应用也越来越广泛，但是现在市面上缺少基于高效液相色谱法（HPLC）检测α-酮戊二酸的检测技术却鲜有报道，因此需要一种样品前处理便捷且损失率较高的高效液相色谱法α-酮戊二酸含量检测方法。
发明内容
为了满足上述需求，本发明旨在提供一种基于高效液相色谱法（HPLC）的α-酮戊二酸含量测定试剂盒及方法，具有检测灵敏度高，无毒性，操作简便，成本低廉，重复性较好等特点。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：
试剂一，液体80mL×1瓶，由盐酸、EDTA、水混合而成；
试剂二，液体10mL×1瓶，由NaOH和水混合而成；
试剂三，液体10mL×1瓶，由盐酸苯肼和水混合而成；
试剂四，液体10mL×1瓶，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水混合而成；
试剂五，α-酮戊二酸标准品0.5mg×1支，置于1.5 mL EP管中，2-8℃保存。
进一步的，所述试剂一中含有4mL盐酸、5mg EDTA以及76mL水。
进一步的，所述试剂二中含有80mg NaOH以及10mL水。
进一步的，所述试剂三中含有80mg 盐酸苯肼以及10mL水。
进一步的，所述试剂四中含有141.4mg 磷酸氢二钾、51.8mg磷酸二氢钾以及10mL水。
一种利用上述试剂盒的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定方法，其测定原理为利用α-酮戊二酸与衍生剂反应，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离，用紫外检测器可测定α-酮戊二酸的含量，其具体步骤如下：
步骤1 仪器和用品的准备；
准备高效液相色谱仪、耐水C18柱、紫外检测器、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、色谱级甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；
步骤2 检测前的准备工作；
溶剂的除杂：
将800 mL超纯水和500 mL甲醇分别用0.45μm的水系滤膜和有机系滤膜抽滤，以除去超纯水和甲醇中的杂质，防止堵塞色谱柱；
流动相的配制：
称取1.415g磷酸二氢钾和182.6mg磷酸氢二钾溶于800mL水中，作为流动相A；将纯甲醇作为流动相B；将体积比为95%流动相A+体积比为5%的流动相B相混合配制成流动相；
流动相的消泡：
将配好的流动相超声30分钟，以脱去流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；
步骤3 α-酮戊二酸的提取；
称取约0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入EP管内，4℃浸提60min，采用10000g离心率，4℃离心10min，提取上清液；
步骤4 α-酮戊二酸的衍生反应；
取250μL步骤3中提取到的上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体系pH在6.8~7.4之间，25℃下反应30min后，制得样品衍生物溶液，取样待测；
步骤5 α-酮戊二酸标准品溶液的配制；
在试剂五中加入1mL纯水，配成500μg /mL母液，将母液用纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg /mL、10μg /mL和5 μg /mL的α-酮戊二酸标准品溶液；将不同浓度的α-酮戊二酸标准品溶液均按照步骤4中的方法进行衍生反应，制得不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液后，分别取样并置于样品瓶内待测；
步骤6 α-酮戊二酸含量测定的操作步骤；
开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速1.0 mL/min，柱温25℃，波长325nm，走样时间为50min，设置完毕保存方法组；
用制备好的流动相冲洗色谱柱以及整套高效液相色谱仪的所有管路，待基线稳定后开始加样；
在高效液相色谱仪中，分别加入不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液10μL，在走样时间内分离α-酮戊二酸衍生物，α-酮戊二酸衍生物的保留时间为30min，记录不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品的峰面积，用于计算标准曲线；
在高效液相色谱仪中，加入样品衍生物溶液10μL，在相应保留时间处检测α-酮戊二酸衍生物的峰面积；
步骤6 α-酮戊二酸含量的计算：
以标准品溶液浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算α-酮戊二酸标准曲线；将α-酮戊二酸衍生物的峰面积代入标准曲线，计算样品中α-酮戊二酸含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明的检测方法需用到的高效液相色谱仪精密度高，可以检测到微克级别的含量，因此检测灵敏度高。
2、本发明的检测方法对于样本的前处理，过程简单易操作，，可以节省人力。
3、本发明的检测方法的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本较为低廉。
4、本发明的检测方法的测定步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据，且每一个样品测试时间短，连续性较好。
5.本发明的检测方法相对于生物免疫检测方法，所用到的试剂的价格具有明显优势，且所需试剂基本无毒，安全环保。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：
试剂一，液体80mL×1瓶，由4mL盐酸、5mgEDTA、76mL水混合而成；
试剂二，液体10mL×1瓶，由80mgNaOH和10mL水混合而成；
试剂三，液体10mL×1瓶，由80mg盐酸苯肼和10mL水混合而成；
试剂四，液体10mL×1瓶，由141.4mg磷酸氢二钾、51.8mg磷酸二氢钾和10mL水混合而成；
试剂五，α-酮戊二酸标准品0.5mg×1支，置于1.5 mL EP管中，2-8℃保存。
一种利用上述试剂盒的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定方法，其测定原理为利用α-酮戊二酸与衍生剂反应，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离，用紫外检测器可测定α-酮戊二酸的含量，其具体步骤如下：
步骤1 仪器和用品的准备；
准备高效液相色谱仪、耐水C18柱、紫外检测器、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、色谱级甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；
步骤2 检测前的准备工作；
溶剂的除杂：
将800 mL超纯水和500 mL甲醇分别用0.45μm的水系滤膜和有机系滤膜抽滤，以除去超纯水和甲醇中的杂质，防止堵塞色谱柱；
流动相的配制：
称取1.415g磷酸二氢钾和182.6mg磷酸氢二钾溶于800mL水中，作为流动相A；将纯甲醇作为流动相B；将体积比为95%流动相A+体积比为5%的流动相B相混合配制成流动相；
流动相的消泡：
将配好的流动相超声30分钟，以脱去流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；
步骤3 α-酮戊二酸的提取；
称取约0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入EP管内，4℃浸提60min，采用10000g离心率，4℃离心10min，提取上清液；
步骤4 α-酮戊二酸的衍生反应；
取250μL步骤3中提取到的上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体系pH在6.8~7.4之间，25℃下反应30min后，制得样品衍生物溶液，取样待测；
步骤5 α-酮戊二酸标准品溶液的配制；
在试剂五中加入1mL纯水，配成500μg /mL母液，将母液用纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg /mL、10μg /mL和5 μg /mL的α-酮戊二酸标准品溶液；将不同浓度的α-酮戊二酸标准品溶液均按照步骤4中的方法进行衍生反应，制得不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液后，分别取样并置于样品瓶内待测；
步骤6 α-酮戊二酸含量测定的操作步骤；
开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速1.0 mL/min，柱温25℃，波长325nm，走样时间为50min，设置完毕保存方法组；
用制备好的流动相冲洗色谱柱以及整套高效液相色谱仪的所有管路，待基线稳定后开始加样；
在高效液相色谱仪中，分别加入不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液10μL，在走样时间内分离α-酮戊二酸衍生物，α-酮戊二酸衍生物的保留时间为30min，记录不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品的峰面积，用于计算标准曲线；
在高效液相色谱仪中，加入样品衍生物溶液10μL，在相应保留时间处检测α-酮戊二酸衍生物的峰面积；
步骤6 α-酮戊二酸含量的计算：
以标准品溶液浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算α-酮戊二酸标准曲线；将α-酮戊二酸衍生物的峰面积代入标准曲线，计算样品中α-酮戊二酸含量。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
试剂一，液体80mL×1瓶，由盐酸、EDTA、水混合而成；
试剂二，液体10mL×1瓶，由NaOH和水混合而成；
试剂三，液体10mL×1瓶，由盐酸苯肼和水混合而成；
试剂四，液体10mL×1瓶，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水混合而成；
试剂五，α-酮戊二酸标准品0.5mg×1支，置于1.5 mL EP管中，2-8℃保存。
2.根据权利要求1所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中含有4mL盐酸、5mg EDTA以及76mL水。
3.根据权利要求1所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂二中含有80mg NaOH以及10mL水。
4.根据权利要求3所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂三中含有80mg 盐酸苯肼以及10mL水。
5.根据权利要求1所述的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂四中含有141.4mg 磷酸氢二钾、51.8mg磷酸二氢钾以及10mL水。
6.一种利用如权利要求1所述的试剂盒的基于HPLC的α-酮戊二酸含量测定方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1 仪器和用品的准备；
准备高效液相色谱仪、耐水C18柱、紫外检测器、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、色谱级甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；
步骤2 检测前的准备工作；
溶剂的除杂：
将800 mL超纯水和500 mL甲醇分别用0.45μm的水系滤膜和有机系滤膜抽滤，以除去超纯水和甲醇中的杂质，防止堵塞色谱柱；
流动相的配制：
称取1.415g磷酸二氢钾和182.6mg磷酸氢二钾溶于800mL水中，作为流动相A；将纯甲醇作为流动相B；将体积比为95%流动相A+体积比为5%的流动相B相混合配制成流动相；
流动相的消泡：
将配好的流动相超声30分钟，以脱去流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；
步骤3 α-酮戊二酸的提取；
称取约0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入EP管内，4℃浸提60min，采用10000g离心率，4℃离心10min，提取上清液；
步骤4 α-酮戊二酸的衍生反应；
取250μL步骤3中提取到的上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体系pH在6.8~7.4之间，25℃下反应30min后，制得样品衍生物溶液，取样待测；
步骤5 α-酮戊二酸标准品溶液的配制；
在试剂五中加入1mL纯水，配成500μg /mL母液，将母液用纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg /mL、10μg /mL和5 μg /mL的α-酮戊二酸标准品溶液；将不同浓度的α-酮戊二酸标准品溶液均按照步骤4中的方法进行衍生反应，制得不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液后，分别取样并置于样品瓶内待测；
步骤6 α-酮戊二酸含量测定的操作步骤；
开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速1.0 mL/min，柱温25℃，波长325nm，走样时间为50min，设置完毕保存方法组；
用制备好的流动相冲洗色谱柱以及整套高效液相色谱仪的所有管路，待基线稳定后开始加样；
在高效液相色谱仪中，分别加入不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品溶液10μL，在走样时间内分离α-酮戊二酸衍生物，α-酮戊二酸衍生物的保留时间为30min，记录不同浓度的α-酮戊二酸衍生物标准品的峰面积，用于计算标准曲线；
在高效液相色谱仪中，加入样品衍生物溶液10μL，在相应保留时间处检测α-酮戊二酸衍生物的峰面积；
步骤6 α-酮戊二酸含量的计算：
以标准品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算α-酮戊二酸标准曲线；将α-酮戊二酸衍生物的峰面积代入标准曲线，计算样品中α-酮戊二酸含量。
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