CN114778749A - 一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，所述有机酸分别为ɑ‑酮戊二酸、琥珀酸、4‑甲基‑2‑氧戊酸和2‑氧代‑3‑甲基丁酸；包括以下步骤：(1)分别用空白基质稀释相同浓度的混标储备液R0得到不同浓度的标准品储备液和高中低三种浓度的质控品溶液；(2)对样本溶液的处理；(3)有机酸的测定。本发明采用非衍生化的方法进行检测，极大的简化了前处理方式；采用简单的外标法定量检测有机酸浓度：避免使用昂贵的内标物，采用简单的外标法定量，极大程度地降低了检测成本；另外，标准曲线可被重复被使用，提高检测的效率。

Description

一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法。

背景技术

有机酸是指一些具有酸性的有机化合物，是身体代谢产生的一大类化合物。它们来自膳食蛋白质，脂肪和碳水化合物，大部分有机酸直接参与生物化学反应，有机酸被身体用于产生细胞能量并提供细胞功能所需的营养。同时，有机酸具有抑菌、消炎、抗病毒、抗突变、抗癌等作用，有的能够增加灌装动脉血流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、软化血管、促进钙和铁的吸收，有的具有帮助胃消化脂肪和蛋白质；有的则具有预防疾病和促进新城代谢的作用，从而有益于人体的健康。同时细胞中有机酸的含量或比率可以作为评估身体健康状况的一个重要指标。

肺癌是癌症相关死亡的主要原因之一，肺癌细胞从肺部原发性肿瘤转移到远端器官是其高死亡率的主要驱动因素。肺癌往往在疾病的晚期被诊断出来，使得手术治疗的方法变得不可行。晚期诊断和转移在患者生存中起了关键作用，并创造了对可以预防肺癌转移的治疗的巨大需求。了解转移性肿瘤的分子谱是研究此关键途径的第一步。其中氨基酸代谢在肿瘤发生和转移中起关键作用。有机酸代谢也与肿瘤细胞分化有关。有研究表明细胞中ɑ-酮戊二酸与琥珀酸的比率与染色质修饰和肿瘤细胞分化有关，与正常细胞相比，转移性癌细胞中ɑ-酮戊二酸与琥珀酸的比率降低，表明细胞中有机酸的含量或比率与人体健康息息相关。因此，建立用于定性和定量分析人体体液，组织和细胞中的三羧酸循环(TCA)中间体α-酮戊二酸、琥铂酸、4-甲基-2-氧戊酸和2-氧代-3-甲基丁酸的方法至关重要。

目前针对细胞裂解液中有机酸浓度检测的方法主要为超高效液相-串联质谱法或气相色谱-串联质谱法，文献报道较多的是通过加入衍生试剂对有机酸进行衍生化来进行检测，比如中国专利申请CN103698449A公开了“气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法”，该方法利用气相色谱通过衍生化方法对细胞发酵液中有机酸进行检测，检测过程繁琐且成本高。专利申请CN110573478A公开了“检测和量化有机酸代谢产物的质谱测定方法”，该方法中一种或多种分析物在电离之前被衍生化，前处理过程复杂，且运行时间长，增加了检测成本。由于细胞内各成分含量复杂多样，简单、准确和快速定性定量细胞中有机酸很关键。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：

一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，所述4种有机酸的中英文名称及结构式如下表：

本发明通过以下方案实现：

(1)通过制备相同浓度的混标储备液R0，用空白基质稀释得到标准品储备液和高中低三种浓度的质控品溶液；

标准品溶液的制备：称取对应4种有机酸的标准品，分别用甲醇配制为浓度相同的标准品母液，分别取标准品母液混合得到相同浓度的混标储备液R0，将混标储备液R0用空白基质稀释得到标准品储备液W1，将标准品储备液W1用空白基质逐级稀释得到另外8个浓度点的标准品储备液W2-W9；混标储备液及标准品储备液的浓度如下表：

质控品溶液的制备：分别取20μL，120μL，320μL标准品储备液W1，用空白基质定容至400μL，混匀，分别得到低中高三个质控品。

(2)样本的处理：在1.5mLPE离心管中用胰酶消化细胞，并进行离心，离心收集固体后用PBS溶液清洗，之后用一定量的水、甲醇和乙腈的混合溶液提取剂提取，提取液在液氮中冷冻，之后室温融化后超声破碎细胞，沉淀过夜，并再次以10000rpm离心5min，离心取上清液，得到细胞裂解液；即为样本溶液。

优选地，混合溶液提取剂由水、甲醇和乙腈按比例：水：甲醇：乙腈＝1：1：1或水：甲醇：乙腈＝1：1：2或水：甲醇：乙腈＝1：2：2或水：甲醇：乙腈＝2：2：1混合得到；

具体地，在1.5mLPE离心管中用胰酶消化肺癌细胞，并进行离心，离心收集固体后用100-500μLPBS溶液清洗，之后用400-800μL的水、甲醇和乙腈的混合溶液提取剂提取，提取液在液氮中冷冻5-10min，之后室温融化后超声破碎细胞，沉淀过夜，并再次以10000-21000rpm离心5min，离心取上清液，得到细胞裂解液；即为样本溶液。

(2)有机酸的测定；

将样本溶液、质控品溶液和标准品溶液分别吸取100μL于96孔板中，待进样；

检测条件如下：

色谱条件：

流动相A液：0.05-0.3％的甲酸水溶液；

即，甲酸浓度可选择0.05，0.1，0.15，0.18，0.2，0.22，0.25和0.28中的任意数值。

流动相B液：0.05-0.3％甲酸的乙腈溶液；

即，甲酸浓度可选择0.06，0.1，0.14，0.17，0.21，0.25，0.28和0.3中的任意数值。

色谱柱型号：kinetexPS-C18，C8，PFP柱(三者选其一)；

柱规格为2.1mm×50mm，2.6μm，2.1mm×100mm，2.6μm或者2.1mm×150mm，3μm；

采用梯度洗脱的方式，洗脱梯度如下：在0-3.5min，流动相B液的体积分数升到第一体积分数，在3.5-3.51min，流动相B液的体积分数降到第二体积分数，在3.51-4min，流动相B液的体积分数维持在第二体积分数；其中，所述第一体积分数为45％-55％；所述第二体积分数为0-5％。

下表为其中一具体的试验条件：

所用洗脱梯度：在0-3.5min，流动相B液的体积分数由0％升到50％，在3.5-3.51min，流动相B液的体积分数降到0％，在3.51-4min，流动相B液的体积分数维持在0％；

流速：0.1-0.5mL/min，柱温为25-40℃，进样1-10μL；

即，流速可以选择0.1，0.15，0.2，0.3，0.4和0.5中的任意数值。

柱温可以选择25，26，30，32，35和40中的任意数值。

进样可以选择1，2，3，4，5，6，7，8，9和10中的任意数值。

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，负离子模式；

喷雾毛细管电压(Capliary)：-4500V；

离子源温度：500℃；

离子源雾化气(Gas1)：50psi；

离子源加热辅助气(Gas2)：50psi；

气帘气(CUR)：25psi；

碰撞气(CAD)：9psi；

扫描模式：多反应监测

各个目标物的质谱参数如下表：

用外标法通过绘制标准曲线进行定量计算；其中标准曲线以标准品溶液的浓度为X轴，以每一浓度相对应峰的面积为Y轴，进行线性回归分析，得到对应4种有机酸的外标曲线。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1)采用非衍生化的方法进行检测，极大地简化了前处理方式；

2)采用简单的外标法定量检测有机酸浓度：避免使用昂贵的内标物，采用简单的外标法定量，极大程度地降低了检测成本；另外，标准曲线可被重复被使用，提高检测的效率；

3)同时测定4种有机酸浓度：通过设置液相色谱以及质谱条件，完成同时检测4种有机酸的效果，极大地提高整个测定过程的通量；

4)极大缩短分析时间：通过优化液相条件，极大地优化整个分析时间，缩短分析时间至4-5min，可快速高效地获取多种有机酸浓度，提高检测效率；

5)前处理简单：该方案对样本的前处理简单，通过优化选择仪器以及测试条件来实现高效高通量同时检测的效果，简化操作步骤，提高检测效率；

6)检测灵敏度高：通过不断优化前处理与仪器方法，实现每种药物都达到较高的灵敏度，满足临床检测的需求。

附图说明

图1是根据本发明的一实施例的4种有机酸的标准品的MRM提取离子色谱图；

图2示出了本发明的一实施例含KIV样品的MRM提取离子色谱图；

图3示出了本发明的一实施例含KIC样品的MRM提取离子色谱图；

图4示出了本发明的一实施例含SA样品的MRM提取离子色谱图；

图5示出了本发明的一实施例含α-KG样品的MRM提取离子色谱图；

图6示出了本本发明的一实施例的KIV的定量标准工作曲线；

图7示出了本发明的一实施例含KIC的定量标准工作曲线；

图8示出了本发明的一实施例含SA的定量标准工作曲线；

图9示出了本发明的一实施例含α-KG的定量标准工作曲线；

图10示出了本发明的一实施例的4种有机酸的定量标准工作曲线；

图11示出了对比例1的色谱图；

图12示出了对比例2的色谱图。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

仪器：Sciex 5500MD三重四级杆质谱仪(美国，Sciex公司),岛津高效液相色谱系统(日本，Shimadzu Scientific公司)；KQ-500E超声波清洗器；H1650R台式高速冷冻离心机(中国，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；G560E涡旋混合器(美国，ScientificIndustries公司)；屈臣氏蒸馏水，购自广州屈臣氏食品饮料有限公司(中国)；BT125D电子天平(德国，赛多利斯股份公司)；移液器(EPPENDORF，德国)。

试剂耗材：乙腈、甲醇(Merck，美国)；高纯水(娃哈哈)；甲酸(SIGMAAldrich,美国)；色谱柱(ACE，英国)；

标准品：

质控样品：

质控样品是已知浓度含量的样品，用来鉴定本方法测量结果是否准确，购于Bio-Rad Laboratories。

实施例1

色谱质谱条件如上发明内容所示，通过色谱和质谱条件的控制，使其可同时检测4种有机酸。且通过该色谱和质谱条件的优选选择，以提高样品检测的灵敏度，以及对应配置简单的前处理即可，提高检测效率和质量。

在本实施例中，选择色谱条件和质谱条件具体如下，但值得注意的是，上述色谱质谱条件中提及的其他参数选择也在可操作范围之内：

色谱条件：

色谱柱：kinetexPS-C18(2.1×50mm，2.6μm)；流动相A液为0.1％甲酸水溶液，流动相B液为0.1％甲酸甲醇溶液；流速为0.5mL/min，柱温为35℃，进样量为5μL；所用洗脱梯度如下：其中流动相A液体积+流动相B液体积＝100％，在0-3.5min，流动相B液升到50％，在3.5-3.51min，流动相B液降到0％，在3.51-4min，流动相B液维持在0％。

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式；喷雾毛细管电压(Capliary)：-4500V；离子源温度：500℃；离子源雾化气(Gas1)：50psi；离子源加热辅助气(Gas2)：50psi；气帘气(CUR)：25psi；碰撞气(CAD)：9psi；扫描模式：多反应监测(见表4)。

一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液、质控品溶液及样本溶液的制备；

标准品母液的制备(以琥珀酸为例)：

称取琥珀酸标准品10mg，用甲醇定容至10mL，得到1mg/mL的单标母液。其他标准品母液的制备过程同上，分别得到4种有机酸对应的标准品母液。

混标储备液R0配制：

取ɑ-酮戊二酸10μL，琥珀酸母液10μL，4-甲基-2-氧戊酸10μL，2-氧代-3-甲基丁酸10μL，用甲醇稀释至1mL得到混合标准储备溶液R0(10μg/mL)

标准品溶液的制备：

空白基质：水：甲醇：乙腈1：2：2

取100μL混合标准储备溶液R0，加入1900μL空白基质，混匀，得到W1。W2由700μL的W1和300μL的空白基质混合得到；W3由400μL的W1和600μL的空白基质混合得到；W4由200μL的W1和800μL的空白基质混合得到；W5由100μL的W1和900μL的空白基质混合得到；W6由160μL的W1和1840μL的空白基质混合得到；W7由500μL的W6和500μL的空白基质混合得到；W8由250μL的W6和750μL的空白基质混合得到；W9由150μL的W6和1050μL的空白基质混合得到；浓度范围为10-500ng/mL。

同理，其他标准品溶液也如上制备，混标储备液R0及标准品储备液的浓度见表1：

表1

质控品的制备：

分别取20μL，120μL，320μL标准品溶液W1，用空白基质定容至400μL，混匀，分别得到低中高三个浓度的质控品。

样品处理：

测试样品的处理：采用1.5mL PE离心管来进行样品的制备，精准量取标准曲线样品，质控样品，细胞裂解液(用胰酶消化，离心收集后再用200μLPBS溶液清洗,之后用400μL水：甲醇：乙腈按比例1:2:2混合的混合溶液提取，在液氮中冷冻5min，室温融化后超声破碎细胞，沉淀过夜，10000g离心5min，离心取上清)100μL于96孔板中，待进样。

质控品的处理：同于样品溶液的处理；

标准品溶液的处理：同于样品溶液的处理。

数据处理：

实验采用MRM模式监测4种有机酸的离子对(Q1/Q3)，选择不同离子对的DP/CE/CXP等进行优化，从优化色谱图中即可看到离子最高信号强度所对应的最佳结果，其他的参数可根据仪器提供的参考值范围选择合适的数值，以保证较强的信号强度。

获取标准品的离子色谱图：

将标准品储备液进样获取其离子色谱图，如图1所示。4种有机酸的标准品，在目标峰出峰时间±1min内基本没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1是4种有机酸MRM提取离子色谱图。

获取样本的离子色谱图：

获取不同样本对应的谱图，并得到不同样本的峰面积。如图2到图5所示。

获取外标曲线：

采用外标定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品溶液的峰面积为Y轴，建立外标标准曲线，4种有机酸在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数基本都在0.99以上，曲线谱图如图6到图10所示，具体参数如表2所示：

表2：4种有机酸线性回归方程及线性相关系数：

分析物	曲线浓度(ng/mL)	线性方程	线性系数
				琥珀酸	10-500	y＝1709.839x+3389.8389	0.99965
ɑ-酮戊二酸	10-500	y＝15523.412x+624610.225	0.99388
				4-甲基-2-氧戊酸	10-500	y＝36340.061x+71415.635	0.99924
2-氧代-3-甲基丁酸	10-500	y＝22796.677x+24773.121	0.99945

获取质控品对应的离子色谱图：

质控品是已知的浓度含量,用来鉴定该方法的测定结果是否准确。用当天的标准曲线校准质控品的浓度，记录校准浓度与已知浓度的偏差，累积到一定数量后计算均值与CV值，并作出相关的质控图，参考相关标准判定方法是否受控。

待测样品的检测：

待测样品1检测得到的色谱，如图2到5所示，可知，测定的数据如下：琥珀酸浓度分别为164ng/mL，ɑ-酮戊二酸浓度75ng/mL，4-甲基-2-氧戊酸浓度为45ng/mL，2-氧代-3-甲基丁酸浓度为1.77ng/mL，均在线性范围内。

准确度验证

准确度实验：组间准确度，通过分析至少三天两个不同浓度样品(每个浓度点做6个平行样品)来得到，见表3；合格的标准要求平均测量的每一个水平的浓度在15％理论值以内，即准确度的范围在85％-115％之间。质控：LQC低浓度质控；MQC中浓度质控；HQC高浓度质控

表3：质控样检测三天的准确度数据

精密度验证

精密度：一次测定三个不同浓度的QC，每个浓度的样本数量要求不小于5个(n＝6)，合格的标准要求每一个水平的浓度QC样品的CV≤15％，如表4：

表4：

样品类型	精密度LQC(％)	精密度MQC(％)	精密度HQC(％)
				SA	4.2	2.1	3.3
ɑ-KG	2.2	1.9	3.2
				KIC	3.1	2.6	3.6
KIV	1.5	2.9	4.2

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于改变了洗脱梯度参数，洗脱梯度如下：

在0-0.01min，流动相A液的体积升到15％，在0.01-6min，流动相A液的体积由15％升到100％；在6-6.5min，流动相A液的体积维持在100％；在6.5-12min，流动相A液的体积由100％下降到15％。在该梯度下对标准品进行检测，结果见图11。

对比例2

对比例2与实施例1的区别在于改变了洗脱梯度参数，洗脱梯度如下：

在0-0.5min，流动相A液的体积升到25％，在0.5-1.5min，流动相A液的体积由25％降到5％；在1.5-2.9min，流动相A液的体积由5％升到25％；在2.9-6min，流动相A液的体积维持在25％。在该梯度下对标准品进行检测，结果见图12。

由图11和图12可得知，洗脱梯度的改变，会导致谱图重叠，无法实现分离检测的目的。

本发明采用HPLC-MS方法同时测定了人细胞裂解液中4种有机酸的存在及含量。本发明采用外标法的方法进行定量测量，即，不需要昂贵的内标物降低检测成本。且本发明不需要对样本进行衍生化即对样品的前处理步骤简单。且本研究优化色谱和质谱条件，以在短时间(4min)内即可高通量高灵敏度地同时检测到4种有机酸，鉴于考察本实验的结果精准度和可重复性，比对精密度与准确度数据，可知该方法的精准度且可重复性均很高。总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理步骤简单，在4之内可同时完成4种有机酸的分离和检测，且采用外标法的方式简单地实现有机酸的定量，可重复性高且成本低下，精密度和可重复性均符合基本要求，为临床医学提供一种可靠的检测方法。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，所述4种有机酸分别为α-酮戊二酸、琥珀酸、4-甲基-2-氧戊酸和2-氧代-3-甲基丁酸；

包括以下步骤：

(1)分别用空白基质稀释相同浓度的混标储备液R0得到不同浓度的标准品储备液和高中低三种浓度的质控品溶液；

(2)对样本的处理：通过用胰酶消化细胞，并离心后用PBS清洗，之后用混合溶液提取剂提取，冷冻、破碎，得到样本溶液；其中，混合溶液提取剂由水、甲醇和乙腈混合而成；

(3)有机酸的测定；

将样本溶液、质控品溶液和标准品储备液进行检测；

检测条件如下：

色谱条件：

流动相A液：0.05-0.3％的甲酸水溶液；

流动相B液：0.05-0.3％甲酸的乙腈溶液；

色谱柱型号：kinetexPS-C18，C8或PFP柱；

柱规格为2.1mm×50mm，2.6μm，2.1mm×100mm，2.6μm或者2.1mm×150mm，3μm；

采用梯度洗脱的方式，洗脱梯度如下：在0-3.5min，流动相B液的体积分数升到第一体积分数，在3.5-3.51min，流动相B液的体积分数降到第二体积分数，在3.51-4min，流动相B液的体积分数维持在第二体积分数；其中，所述第一体积分数为45％-55％；所述第二体积分数为0-5％；

流速：0.1-0.5mL/min，柱温为25-40℃，进样1-10μL。

2.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源，负离子模式；

喷雾毛细管电压：-4500V；

离子源温度：500℃；

离子源雾化气：50psi；

离子源加热辅助气：50psi；

气帘气：25psi；

碰撞气：9psi；

扫描模式：多反应监测

各个目标物的质谱参数

3.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，步骤(1)中混标储备液R0及标准品储备液的浓度如下：

4.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，步骤(2)中的样本为肺癌细胞。

5.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，步骤(2)中对样本的处理具体如下：在1.5mLPE离心管中用胰酶消化肺癌细胞，并进行离心，离心收集固体后用100-500μLPBS溶液清洗，之后用400-800μL的水、甲醇和乙腈的混合溶液提取剂提取，提取液在液氮中冷冻5-10min，之后室温融化后超声破碎细胞，沉淀过夜，并再次离心，取上清液，得到细胞裂解液；即为样本溶液。

6.根据权利要求4所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，所述混合溶液提取剂由水、甲醇和乙腈按比例：水：甲醇：乙腈＝1：1：1或水：甲醇：乙腈＝1：1：2或水：甲醇：乙腈＝1：2：2或水：甲醇：乙腈＝2：2：1混合得到。

7.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：用外标法通过绘制标准曲线进行定量计算；其中标准曲线以标准品溶液的浓度为X轴，以每一浓度相对应峰的面积为Y轴，进行线性回归分析，得到对应4种有机酸的外标曲线。

8.一种用于权利要求1所述的高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括标准品、稀释剂、混合溶液提取剂和流动相；

其中，稀释剂包括甲醇和空白基质；

标准品如下：α-酮戊二酸标准品、琥珀酸标准品、4-甲基-2-氧戊酸标准品和2-氧代-3-甲基丁酸标准品；

混合溶液提取剂由水、甲醇和乙腈按比例：水：甲醇：乙腈＝1：1：1或水：甲醇：乙腈＝1：1：2或水：甲醇：乙腈＝1：2：2或水：甲醇：乙腈＝2：2：1混合得到；

流动相包括流动相A液和流动相B液；流动相A液为0.05-0.3％的甲酸水溶液；流动相B液为0.05-0.3％甲酸的乙腈溶液。

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