CN113933410B - 一种同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，包括以下步骤：取生物样品，加入三种待测物的同位素内标混合溶液，再加入提取溶剂提取，离心，取上清液干燥后用复溶液溶解，得到待测样品，采用液相色谱串联质谱法检测；所述液相色谱串联质谱法所采用的色谱柱为C18色谱柱，所述C18色谱柱的粒径为1.6～2.2μm，所述C18色谱柱的长度为40～60mm。本发明的检测方法不仅能同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，且特异性强，针对维生素K1、MK4和MK7都获得良好的色谱分离度(保留时间相差大于0.5min)，基线低，基质干扰少，方法检测限低，灵敏度高，且稳定性强。

Description

一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法
技术领域
本发明涉及分析领域，特别是涉及一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法。
背景技术
维生素K是2-甲基-1,4-萘醌及其衍生物的总称，目前已发现的天然脂溶性维生素K有两种：一种是在苜蓿中提出的油状物—维生素K1(VK1)，又称叶绿醌；另一种是在腐败鱼肉中获得结晶体维生素K2。维生素K2包括几种不同的形式，人类饮食中最常见的维生素K2形式为甲萘醌-4(MK4)和甲萘醌-7(MK7)。MK4主要存在于动物产品中，如蛋黄、肉、肝和黄油。MK7则由细菌合成，主要存在于发酵食品中。
维生素K又称凝血维生素，是合成各种凝血因子的必要辅助因子，在血液稳态中起不可或缺的作用。各种研究表明，缺乏维生素K会导致血液中活跃的凝血因子浓度降低，从而导致出血。此外维生素K营养状况也与骨质疏松症有关。人类流行病学和干预研究表明，维生素K可以减少骨质疏松症患者的骨质流失，降低骨折风险。另有研究表明，维生素K2可抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，并诱导肝细胞癌、卵巢癌等多种实体瘤和血液系统疾病的细胞凋亡，具有明显的抗肿瘤作用，且与多种抗肿瘤药物有协同作用。临床给与维生素K2补充治疗干预，可降低肿瘤发生风险。因此，体液中VK1、MK4和MK7的精准检测是膳食摄入、营养状况和疾病诊断治疗监测的重要指标。准确灵敏地测定生物样品中VK1、MK4和MK7的含量具有十分重要的意义。
但是，目前国内外关于维生素K的研究主要集中在VK1的检测上。目前尚未有同时检测多种样品类型中VK1、MK4和MK7的报道。
发明内容
由于VK1、MK4和MK7具有相同的2-甲基-1,4-萘醌环，经过质谱三重四级杆筛选和碰撞后，三种化合物产生相同的定量离子(质荷比187)，因此三种化合物在质谱检测上容易相互影响，导致检测结果不准确。同时MK7在结构上由于含有相对较长的类异戊二烯链，理化性质上和VK1、MK4相差较大。已有的文章报道关于MK7的检测，皆存在检测时间过长，基线高，目标物响应极低的情况，同时由于基质干扰严重，MK7检测稳定性差。VK1和MK4理化性质较为接近，在色谱行为上表现较为一致，一般检测方法较难以将两者在色谱上实现分离，导致检测结果互相干扰。
基于此，本发明的目的是提供一种能同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法。本发明方法特异性强，针对维生素K1、MK4和MK7都获得良好的色谱分离度(保留时间相差大于0.5min)，可避免由于相同的定量子离子产生的定量干扰；同时本方法在各种样品类型检测中，检测结果基线低，基质干扰少，质谱通道无干扰。由于维生素K2在各种生物样品类型中的含量较低，本方法检测限低，灵敏度高，稳定性强，可同时提供VK1、MK4和MK7的精准检测。
具体技术方案如下：
一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，包括以下步骤：
取生物样品，加入包含三种待测物的同位素内标混合溶液，再加入提取溶剂提取，离心，取上清液干燥后用复溶液溶解，得到待测样品，采用液相色谱串联质谱法检测；
所述液相色谱串联质谱法所采用的色谱柱为C18色谱柱，所述C18色谱柱的粒径为1.6～2.2μm，所述C18色谱柱的长度为40～60mm。
在其中一些实施例中，所述色谱柱的粒径为1.6～2.0μm，进一步为1.6～1.9μm，更进一步为1.6～1.8μm。
在其中一些实施例中，所述色谱柱的长度为45～55mm，进一步为45～53mm，更进一步为48～53mm。
在其中一些实施例中，所述色谱柱的粒径为1.7μm，色谱柱的长度为50mm。
在其中一些实施例中，所述液相色谱串联质谱法的流动相A为0.15～0.25wt％甲酸的水溶液，流动相B为0.15～0.25wt％甲酸的甲醇溶液，采用梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序包括：
0～0.5min，流动相B的体积百分比为88～92％；
0.5～1min，流动相B的体积百分比由88～92％升高到95～98％；
1～2min，流动相B的体积百分比由95～98％升高到99～100％；
2～4.5min，流动相B的体积百分比为99～100％；
4.5～5.6min，流动相B的体积百分比由99～100％降低到88～92％；
5.6～6min，流动相B的体积百分比为88～92％。
在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的程序包括：
0～0.5min，流动相B的体积百分比为90％；
0.5～1min，流动相B的体积百分比由90％升高到97％；
1～2min，流动相B的体积百分比由97％升高到100％；
2～4.5min，流动相B的体积百分比为100％；
4.5～5.6min，流动相B的体积百分比由100％降低到90％；
5.6～6min，流动相B的体积百分比为90％。
在其中一些实施例中，所述色谱柱的内径为1.8～2.4μm，优选为2.1μm。
在其中一些实施例中，所述液相色谱串联质谱法的色谱条件还包括：
进样量(8～20)μL；
柱温为40-45℃；
流速为(0.5±0.1)mL/min。
在其中一些实施例中，所述提取溶剂为正己烷。
在其中一些实施例中，所述复溶液为甲醇或含甲酸的甲醇溶液。
在其中一些实施例中，所述生物样品为血浆、血清、脑脊液或尿液。
在其中一些实施例中，所述三种待测物的同位素内标混合溶液为：含有1.0～1.6ng/mL VK1-d7、0.8～1.4ng/mL MK4-d7和1.0～2.5ng/mMK7-d7的乙醇溶液。
在其中一些实施例中，所述生物样品和同位素内标混合溶液的体积比为1：(1～3)。
在其中一些实施例中，所述生物样品和复溶液的体积比为1：(0.2～1.0)。
在其中一些实施例中，所述液相色谱串联质谱法的质谱参数包括：
VK1定量离子对：451.4/187.2；
VK1定性离子对：451.4/199.2；
VK1-d7内标离子对：458.5/194.1；
MK4定量离子对：445.2/187.1；
MK4定性离子对：445.2/227.1；
MK4-d7内标离子对：452.3/194.1；
MK7定量离子对：649.5/187.1；
MK7定性离子对：649.5/227.2；
MK7-d7内标离子对：656.6/194.1；
采用APCI离子源，正离子模式，多重反应监测离子扫描模式。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人在研究中发现，要实现生物样品中VK1、MK4和MK7同时检测并实现三者很好的分离，尤其是要实现MK7与VK1、MK4很好的分离，色谱柱的选择非常关键，尤其是色谱柱的粒径和长度对于MK7的色谱和质谱行为影响很大。本发明通过采用特定粒径1.6～2.2μm、特定长度40～60mm的C18色谱柱进行液相色谱串联质谱法检测，配合本发明的其他步骤，本发明最终实现了一种能实现同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，并且还具有以下几方面优点：(1)特异性强，针对维生素K1、MK4和MK7都获得良好的色谱分离度(保留时间相差大于0.5min)，峰型好；(2)基线低，基质干扰少，方法的检测限低，灵敏度高，且稳定性强。(3)分析时间短，只需6min；(4)同时适用于多种样品类型。
进一步地，在选择特定粒径1.7μm、特定长度50mm的C18色谱柱的基础上，再结合本发明特定的液相条件，尤其是结合本发明特定的梯度洗脱程序，可以进一步提高MK4、MK7的检测特异性和检测灵敏度，有效排除各种样本基质中的干扰，从而适用于多种生物样本类型的检测。
附图说明
图1为VK1、MK4、MK7的液相质谱图；
图2为VK1、MK4、MK7的标准曲线图；
图3为采用不同粒径C18色谱柱检测的MK7色谱图；
图4为采用不同长度C18色谱柱检测的MK7色谱图；
图5为液相梯度初始有机相浓度低于88％时检测的色谱图；
图6为液相梯度初始有机相浓度高于92％时检测的色谱图；
图7为尿液样品中VK1和VK1-D7的色谱图；
图8为尿液样品中MK4和MK4-D7的色谱图；
图9为尿液样品中MK7和MK7-D7的色谱图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明的发明人在研究中发现，MK7由于含有相对较长的类异戊二烯链，理化性质上和VK1、MK4相差较大，在质谱和色谱上的表现也存在多种限制，常见问题为MK7质谱参数难以获得、色谱分离程度不佳、响应较低、基线高、基质干扰严重。这可能也是目前国内外关于维生素K的研究主要集中在VK1上，而没有实现VK1、MK4和MK7同时检测的原因。为了解决以上技术难题，本发明的发明人进行了大量的研究和尝试，并通过试验反复论证，最终提供了一种能同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法。具体技术方案如下：
一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，包括以下步骤：
取生物样品，加入三种待测物的同位素内标混合溶液，再加入提取溶剂提取，离心，取上清液干燥后用复溶液溶解，得到待测样品，采用液相色谱串联质谱法检测；
所述液相色谱串联质谱法所采用的色谱柱为C18色谱柱，所述C18色谱柱的粒径为1.6～2.2μm，所述C18色谱柱的长度为40～60mm。
进一步优选地，所述色谱柱的粒径为1.7μm，色谱柱的长度为50mm。
本发明的发明人在研究中发现，要实现生物样品中VK1、MK4和MK7同时检测并实现三者很好的分离，尤其是要实现MK7与VK1、MK4很好的分离，色谱柱的选择非常关键，尤其是色谱柱的粒径和长度对于MK7的色谱和质谱行为影响很大。本发明通过采用特定粒径1.6～2.2μm、特定长度40～60mm的C18色谱柱进行液相色谱串联质谱法检测，配合本发明的其他步骤，最终实现了一种能实现同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，并且还具有以下几方面优点：(1)特异性强，针对维生素K1、MK4和MK7都获得良好的色谱分离度(保留时间相差大于0.5min)，峰型好，无干扰峰；(2)响应度高，基线低，基质干扰少，方法的检测限低，灵敏度高，且稳定性强。(3)分析时间短，只需6min；(4)同时适用于多种样品类型，包括血清、血浆、脑脊液、尿液等。
优选地，所述液相色谱串联质谱法的流动相A为0.15～0.25wt％甲酸的水溶液，流动相B为0.15～0.25wt％甲酸的甲醇溶液，采用梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序包括：
0～0.5min，流动相B的体积百分比为88～92％；
0.5～1min，流动相B的体积百分比由88～92％升高到95～98％；
1～2min，流动相B的体积百分比由95～98％升高到99～100％；
2～4.5min，流动相B的体积百分比为99～100％；
4.5～5.6min，流动相B的体积百分比由99～100％降低到88～92％；
5.6～6min，流动相B的体积百分比为88～92％。
进一步优选地，所述梯度洗脱的程序包括：
0～0.5min，流动相B的体积百分比为90％；
0.5～1min，流动相B的体积百分比由90％升高到97％；
1～2min，流动相B的体积百分比由97％升高到100％；
2～4.5min，流动相B的体积百分比为100％；
4.5～5.6min，流动相B的体积百分比由100％降低到90％；
5.6～6min，流动相B的体积百分比为90％。
优选地，所述色谱柱的内径为1.8～2.4μm，优选为2.1μm。
在选择特定粒径1.6～2.2μm、特定长度40～60mm的C18色谱柱的基础上，再结合本发明特定的液相条件，尤其是结合本发明特定的梯度洗脱程序，可以进一步提高MK4、MK7的检测特异性和检测灵敏度，有效排除各种样本基质中的干扰，从而适用于多种生物样本类型的检测。
优选地，同位素内标混合溶液的溶剂为乙醇，可以沉淀生物样品中的蛋白，提取溶剂为正己烷，通过本发明的前处理操作，使得前处理后的样品基质干净，目标检测物提取效率高。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例一一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的测定方法
VK1、MK4、MK7三种待检测物质的混合内标溶液的制备：以乙醇为溶剂，配制含有1.4ng/mL VK1-d7，1.2ng/mL MK4-d7和2.0ng/mLMK7-d7的混合内标溶液。
样品前处理：在200μL混合病人血清待测样品中加入400μL VK1、MK4、MK7三种待检测物质的混合内标溶液，使待测样品中的蛋白质沉淀，震荡5min，静置15分钟，加入正己烷提取，10000rpm离心10min获得上清液，氮气吹干，加入80μL复溶液甲醇溶解，得待测样品。
采用液相色谱串联质谱法检测待测样品，色谱条件为：
使用粒径1.7μm，内径2.1mm，长度50mm的BEH C18色谱柱；
流动相：A相为含0.2wt％甲酸的水溶液，B相为含0.2wt％甲酸的甲醇溶液。进样量10μL；柱温为45℃；流速为0.5mL/min。
采用梯度洗脱，洗脱程序如表1所示：
表1
Figure BDA0003268490360000081
质谱条件为：APCI源正离子模式，多重反应监测离子扫描模式(MRM)。质谱离子源参数设置如表2所示，质谱方法参数如表3所示。
表2质谱离子源参数设置
Figure BDA0003268490360000082
表3质谱方法参数
Figure BDA0003268490360000083
Figure BDA0003268490360000091
实施例一的效果通过对该方法进行验证来确认，具体验证参数和验证结果如下所示：
本例采用含有VK1、MK4和MK7的混合标准品溶液进行试验。
含有VK1、MK4和MK7的混合标准品溶液的配制：用天平准确称取5.0mg VK1、5.0mgMK4和5.0mg MK7标准品，分别溶解于50mL乙醇溶液中，配置成浓度为100.0ng/mL的VK1储备液，100.0ng/mL的MK4储备液，100.0ng/mL的MK7储备液。分别取以上三种储备液各50μL，于1.0mLEP管中混合，加入950μL乙醇震荡混匀，配置成VK1、MK4和MK7混合标准品溶液(浓度均为5ng/mL)，采用实施例一的检测方法进行定量检测。
图1为VK1、MK4、MK7及其同位素内标的液相质谱图；其中，横坐标为出峰时间，单位为min，纵坐标为响应强度，单位为cps。图1的结果显示，VK1、MK4、MK7及其同位素内标的色谱峰型平滑，分离度较好；同时MK4和MK7响应响度较高，基线低，说明本例的液相色谱串联质谱法，能够同时检测VK1、MK4、MK7。
线性范围验证
本例以4％BSA基质为曲线基质，配制了VK1、MK4、MK7系列梯度浓度的标准品，通过实施例一的检测方法进行检测验证。
检测结果如表4所示，以浓度为横坐标，检测物与对应内标的峰面积的比值(AreaRatio)为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。
表4 VK1、MK4、MK7标准品线性范围实验数据
Figure BDA0003268490360000092
Figure BDA0003268490360000101
表4的结果显示，VK1、MK4、MK7标准曲线的相关系数R2均≥0.99，说明本发明用液相色谱串联质谱法测定VK1、MK4、MK7，在对应浓度范围内都呈现良好的线性。
定量限与检测限验证
基于配置的标准曲线低点进行梯度稀释，以RSD小于20％，回收率在85％～115％范围内，且信噪比大于10的最低浓度点视为本发明方法的定量限浓度(LOQ)；以信噪比接近并大于3时所对应的标准品浓度值，确定为本发明方法的检出限(LOD)，结果具体如表5和表6所示，结果显示，本发明方法VK1、MK4、MK7的定量限分别为0.0132ng/mL、0.0200ng/mL、0.0199ng/mL。本发明方法VK1、MK4、MK7的检测限分别为0.0102ng/mL、0.0125ng/mL、0.0124ng/mL。定量限和检出限均足以满足临床样本检测需求。
表5 VK1、MK4、MK7方法定量限检测数据
Figure BDA0003268490360000111
Figure BDA0003268490360000121
表6 VK1、MK4、MK7方法检测限检测数据
Figure BDA0003268490360000122
精密度验证
基于配置的标准曲线方程，采用本实施例的检测方法，收集血清样品，混合均匀，采用VK1、MK4和MK7的标准品溶液加标，得到低、中、高三个浓度水平的样品进行精密度实验，评估检测方法的稳定性。每个浓度水平的样品每批次平行处理2个，每个进样1次，连续测定10天。检测结果如表7所示，本例同时检测血清样品中的VK1、MK4和MK7，批间不精密度均小于6％，说明方法稳定性好。
表7 VK1、MK4、MK7的批间不精密度检测结果
Figure BDA0003268490360000131
Figure BDA0003268490360000141
实施例二
由于MK7含有相对较长的类异戊二烯链，理化性质和VK1、MK4相差较大，在质谱和色谱上的表现也存在多种限制，常见问题为MK7质谱参数难以获得、色谱分离程度不佳、响应较低、基线高、基质干扰严重等。本发明的发明人在研究中意外发现，在用C18柱检测MK7时，液相色谱柱的粒径和长度对于MK7色谱峰的峰型具有很大的影响。本例具体分析比较了不同粒径C18柱(1.7μm、2.5μm、2.7μm)和不同长度C18柱(50mm、100mm)对MK7质谱和色谱分离检测结果的影响(检测样品为混合血清样品，其他具体条件参考实施例一)，分析结果如图3和图4所示。
由图3可知，色谱柱粒径大小影响MK7的质谱和色谱行为。色谱柱粒径为2.7μm和2.5μm时，MK7色谱峰很宽，从而与基质存在的干扰峰的分离困难，并且基线高。而选用实施例1中的1.7μm粒径的C18色谱柱，色谱峰窄且峰型好，基线低，与其他干扰峰能很好的分离，最终MK7可获得更好的色谱分离效果和质谱响应强度。
由图4可知，色谱柱长度会明显地影响MK7的质谱和色谱行为。色谱柱长度为100mm时，MK7很难与干扰物质取得分离，且质谱响应相对更低，分析时间更长，检测效率低。而色谱柱为50mm时，MK7峰型好，更容易与干扰物质分离，且质谱响应高，基线低，最终MK7可获得更好的色谱分离效果和质谱响应强度。
实施例三
本发明检测方法中的液相洗脱有机相初始浓度和洗脱梯度程序影响VK1、MK4、MK7的色谱行为。本例采用实施例一配制的VK1、MK4和MK7混合标准品溶液进行试验。当液相梯度初始有机相浓度低于88％时，发现MK4出峰时间延迟，难以和干扰物质有效分离，且响应强度降低。如图5所示，分析比较85％和90％的液相梯度初始有机相浓度对MK4出峰的影响，85％初始有机相条件下，MK4出峰时间延迟约0.45min，响应强度相对降低约45％，目标物难以和基质中的干扰物进行有效分离，且目标通道基线也较高。
当液相梯度初始有机相浓度高于92％时，有效洗脱增强，发现MK7出峰时间提前，但和干扰物的有效分离降低，且基线也相应提高，图6所示，分析比较90％和95％的液相梯度初始有机相浓度对MK7出峰的影响，95％初始有机相条件下，MK7出峰时间相对提前约0.4min，但和同通道内干扰物质无法进行较好的分离，基线也相应提高。
综合考虑VK1、MK4和MK7的色谱分离效果和质谱响应强度，液相梯度的最优方案为：初始有机相比例为90％，保持时间0.5min；0.5～1min，有机相的体积百分比由90％升高到97％；1～2min，有机相的体积百分比由97％升高到100％；2～4.5min，有机相的体积百分比为100％；4.5～5.6min，有机相的体积百分比由100％降低到90％；5.6～6min，保持有机相的体积百分比为90％进行平衡。
实施例四
本例对另一种样本类型——尿液样品类型中的VK1、MK4和MK7进行了提取和检测验证。具体的，取待检24小时尿液200μL，采用实施例一中的前处理、液相和质谱检测方法，尿液样品类型中VK1和VK1-d7、MK4和MK4-d7、MK7和MK7-d7的色谱图如图7、8和9所示。
检测结果显示，本例同时检测VK1、MK4、MK7的方法，能够有效地检测出尿液样品中的VK1、MK4、MK7，通过内标沉淀剂沉淀蛋白，正己烷液液萃取的前处理操作，样品基质干净，目标检测物提取效率高，再经过优化改进的流动相成分和比例，使得VK1、MK4、MK7在色谱行为上具有良好的分离度和峰型，无干扰峰，且质谱响应高，特别是MK7，从而准确有效的同时检出多种样品类型中的VK1、MK4和MK7。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取生物样品，加入三种待测物的同位素内标混合溶液，再加入提取溶剂提取，离心，取上清液干燥后用复溶液溶解，得到待测样品，采用液相色谱串联质谱法检测；
所述液相色谱串联质谱法所采用的色谱柱为C18色谱柱，所述C18色谱柱为粒径1.7μm，内径2.1mm，长度50mm的BEH C18色谱柱；
流动相：A相为含0.2wt%甲酸的水溶液，B相为含0.2wt %甲酸的甲醇溶液；进样量10 μL；柱温为45℃；流速为0.5mL/min；
采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序包括：
0~0.5min，流动相B的体积百分比为90%；
0.5~1min，流动相B的体积百分比由90%升高到97%；
1~2min，流动相B的体积百分比由97%升高到100%；
2~4.5min，流动相B的体积百分比为100%；
4.5~5.6min，流动相B的体积百分比由100%降低到90%；
5.6~6min，流动相B的体积百分比为90%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂为正己烷；所述生物样品为血浆、血清、脑脊液或尿液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三种待测物的同位素内标混合溶液为：含有1.0~1.6ng/mL VK1-d7、0.8~1.4ng/mL MK4-d7和1.0~2.5 ng/mLMK7-d7的乙醇溶液；所述复溶液为甲醇或含甲酸的甲醇溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述生物样品和同位素内标混合溶液的体积比为1：1~3；和/或，所述生物样品和复溶液的体积比为1 ： 0.20~1.0。
5.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱法的质谱参数包括：
VK1定量离子对：451.4/187.2；
VK1定性离子对：451.4/199.2；
VK1-d7内标离子对：458.5/194.1；
MK4定量离子对：445.2/187.1；
MK4定性离子对：445.2/227.1；
MK4-d7内标离子对：452.3/194.1；
MK7定量离子对：649.5/187.1；
MK7定性离子对：649.5/227.2；
MK7-d7内标离子对：656.6/194.1；
采用APCI离子源，正离子模式，多重反应监测离子扫描模式。
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