CN115639299A - 一种同时检测血液样品中vk1、mk-4和mk-7的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时检测血液样品中VK1、MK‑4和MK‑7的方法，通过采用磷脂去除板处理样品，并在蛋白沉淀剂中添加4％TCA，可以有效去除90％磷脂类干扰物，降低干扰物对MS检测离子的抑制，尤其可以明显降低基质抑制效应，消除基线噪音，提高信噪比，降低定量下限，提高检测的精准性，实现血液样品中VK1、MK‑4和MK‑7的高准确性和高灵敏度检测，满足临床所需；并能保护仪器和色谱柱免受污染，降低仪器维护频率，提高色谱柱寿命。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学分析技术领域，尤其涉及一种同时检测血液样品中VK1、MK-4和MK-7的方法。
背景技术
维生素K1和维生素K2均为脂溶性维生素，这两种维生素均是维持人体机能正常运行所必需的。其中，维生素K1参与肝内凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ等的合成，并且是凝血过程中纤维蛋白原转变成纤维蛋白的促进因子。维生素K2作为谷氨酸-γ-羧化酶的辅酶参与机体的正常凝血过程。维生素K2是一类具有聚合异戊二烯侧链的甲基萘醌结构的脂溶性维生素，依据侧链聚合异戊二烯侧链的长短不同，至少有14种形式，以MK-n表示。目前研究较多和广泛应用的存在形式主要是MK-4和MK-7。
维生素K1缺乏可造成人体凝血障碍，导致凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症等。且有研究表明，人体内维生素K1过量可导致严重的不良反应，包括呼吸困难、过敏样反应、过敏性休克等，累及系统/器官以呼吸系统损害、全身性损害为主。临床上，维生素K2具有活化骨钙蛋白，促进能量释放，具有治疗骨质疏松症、预防动脉硬化和器官钙化等健康效应。同时，饮食中加入适当的维生素K2可以有效地降低冠状动脉钙化。此外，近几年研究发现，维生素K2对多种恶性肿瘤细胞有生长抑制作用，并可诱导肝细胞癌、卵巢癌等多种实体瘤和白血病骨髓增生异常综合征的细胞凋亡，具有明显的抗肿瘤作用，且与多种抗肿瘤药有协同作用。因此，检测血液中维生素K1和维生素K2则显得十分重要。
由于血液中维生素K1和K2的浓度低，维生素K的脂溶性以及易受脂质的干扰，测定血液中维生素K比较困难。在维生素K的检测方法中，HPLC-UV法的敏感性和选择性都低，不适合临床常规检测。与紫外分光光度法相比，HPLC-电化学法(ECD)需要柱后还原法将维生素K的醌式结构转化为相应的酚式结构；液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)是以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图，实现对待测物的测定，能提供同时检测多种指标的能力，LC-MS因具有较高的灵敏度和选择性，已经成为小分子定量的金标准。目前市场上广泛应用的维生素K2主要是MK-4和MK-7，MK-4和MK-7的精准检测是营养状况和疾病诊断治疗监测的重要指标，准确测定人血中MK-4和MK-7的含量具有十分重要的意义。因此临床上对同时检测维生素K1、MK-4和MK-7具有迫切需求。
CN110208437A提供了一种同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK-4)的方法，采用乙醇作为蛋白沉淀剂，正己烷作为萃取剂，氮气吹干后乙腈复溶。但其检测灵敏度偏低，维生素K1的定量下限(LOQ)为0.05ng/mL，维生素K2(MK-4)的定量下限(LOQ)为0.08ng/mL，而正常人血清中MK-4浓度范围为0.15±0.17ng/mL，该检测方法无法覆盖到正常人的参考浓度范围。
CN109668980A提供了一种高效液相色谱单独检测血液中维生素MK-7的方法，但该方法无法实现维生素K1、MK-4和MK-7的同时检测；另外由于MK-7的基质效应较大，该方法无法有效去除基质对MK-7的影响，难以保证检测准确度。
CN113933410A提供了一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，该方法由于不能有效去除血液基质中的杂质，其附图中的色谱图都是采用乙醇配制的标准曲线样品或是尿液样品进行检测的图谱，并非血液样本的检测图谱，若采用该方法进行血液样本检测，图谱中会有非常严重的干扰峰，基线噪音高，信噪比低，难以保证检测准确度。
综上，由于血液基质样本杂质较多，造成色谱峰中干扰峰较多，尤其MK-7的基质效应较大，基线噪音高，现有产品多采用蛋白沉淀或液液萃取等前处理方法，无法有效去除基质中的磷脂类干扰物带来的基质效应，影响MK7定量的准确度和精密度。因此急需找到一种能同时检测血液中的维生素K1、MK-4和MK-7，并能有效去除基质中的干扰物，降低基线噪音，提高信噪比，降低定量检测下限，提高检测精准性的检测方法。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种同时检测血液样品中VK1、MK-4和MK-7的方法，通过采用磷脂去除板处理样品，并在蛋白沉淀剂中添加4％TCA，明显提升磷脂去除板的功效，显著去除干扰物，降低基线噪音，提高信噪比，VK1、MK-4和MK-7的定量下限分别为0.003ng/mL、0.005ng/mL和0.012ng/mL，提高检测的加标回收率，从而实现血液样品中VK1、MK-4和MK-7的高准确度和高灵敏度检测。
一方面，本发明提供了一种同时检测血液样品中VK1、MK-4和MK-7的方法，所述血液样品需先经含有有机酸的蛋白沉淀剂处理，再经磷脂去除板处理。
本发明在血液样本的前处理过程中，增加了一步磷脂去除板的净化过程，并通过在用于前处理的蛋白沉淀剂中添加有机酸，能显著提升磷脂去除板的净化效果，降低基线噪音，提高信噪比，VK1、MK-4和MK-7的定量下限分别为0.003ng/mL、0.005ng/mL和0.012ng/mL，极大地提高了VK1、MK-4和MK-7的检测准确性，其原因可能是添加酸有助于磷脂的磷酸基团特异性结合到磷脂去除板的填料上，可以达到和待测物分离的效果。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
(1)取血液样品与含有机酸的蛋白沉淀剂混匀，所述有机酸为三氯乙酸、乙酸或甲酸中的任意一种或多种；
(2)加入萃取剂萃取，取上层有机相；
(3)上层有机相加入磷脂去除板处理；
(4)液相色谱串联质谱检测。
本发明在前期研究时，检测血液样本中的维生素K时，样品前处理通常包括蛋白沉淀和液液萃取两步，发现检测图谱中干扰峰较多，并且基线噪音高，基质效应大，对精确检测VK1、MK-4和MK-7存在严重影响，比如由于背景峰较高，会使检测信噪比降低，定量检测下限较高，检测灵敏度低，而且干扰峰如果与待测物的峰难以分离，会导致检测结果偏高，检测结果不准确。
基线噪音也称基线噪声，不同的仪器，不同的操作条件它们的基线噪声都是不一样的，当把谱图放大，看到的基线上的一些小的波动就是基线噪声。
本发明所述信噪比是指目标待测物的峰高与背景峰的峰高的比值，所述背景峰就是指基线噪音。背景峰是基线噪音产生的连续上下波动的峰，计算信噪比为目标峰的峰高与目标峰保留时间位置附近的背景峰峰高的比值，由Analyst软件计算获得。
本发明所述定量检测下限是指样品中的目标待测物能被准确定量测定的最低值。
信噪比的大小影响着检测结果的准确性，当干扰物多时，目标待测峰的基线噪音高，信噪比低，难以保证检测结果的准确性，甚至会造成某些干扰峰与待测物的峰难以分离，导致检测结果偏高，因此为了保证检测结果的准确性，需要提高信噪比。同时，信噪比的大小也影响着定量检测下限的变化，当信噪比较低时，定量检测下限就会升高，而当信噪比提高时，定量检测下限能明显降低。
因此为了能同时准确检测血液中的维生素K1、MK-4和MK-7，并能降低定量检测下限，必须降低基线噪音，消除干扰峰，提高信噪比。
为了能降低基线噪音，降低定量检测下限，提高检测的准确性和灵敏度，本发明经过大量研究，发现在液液萃取的基础上增加一步磷脂去除板的处理，对降低背景峰和去除干扰峰、提高信噪比具有明显效果，再深入研究发现，在蛋白沉淀中添加三氯乙酸、乙酸或甲酸等有机酸能明显促进磷脂去除板的净化作用，进一步有效去除干扰峰，提高信噪比，降低定量检测下限，对同时检测VK1、MK-4和MK-7，并提升检测准确度具有非常显著的效果。
进一步地，步骤(1)所述有机酸为三氯乙酸。
研究证明，相比较于其他有机酸，TCA(三氯乙酸)去除干扰峰的效果更优。
进一步地，步骤(1)所述蛋白沉淀剂为乙醇：乙腈：异丙醇＝90:5:5，所述三氯乙酸含量为4％。
蛋白沉淀也是血液样本前处理的重要一步，选择合适的蛋白沉淀剂，并搭配三氯乙酸，既能够起到很好的沉淀蛋白的效果，又能促进磷脂去除板的净化作用，更有利于降低基线噪音，去除干扰峰，提高信噪比。
本发明考察了蛋白沉淀剂(乙醇：乙腈：异丙醇＝90:5:5)中TCA的不同(体积比)含量(3％、4％、5％、6％等等)，发现4％TCA的干扰峰去除效果最优，信噪比最大。
在一些方式中，所述蛋白沉淀剂可以与内标溶液混合成内标工作溶液后一起添加至样品中。
进一步地，步骤(3)所述磷脂去除板为FastRemover磷脂去除板。
不同的磷脂去除板对样本的净化效果存在区别，比较了FastRemover、中性Al2O3、碱性Al2O3、Bio Scavenger等多种磷脂去除板，综合目标待测物的峰面积及对色谱峰中干扰峰的去除效果，优选采用FastRemover磷脂去除板来提升净化效果。
进一步地，步骤(3)所述磷脂去除板的处理过程为：取上层有机相上样至磷脂去除板对应的孔中，静置5min后正压压缩收集流出液，正压压干后加入异辛烷淋洗，收集淋洗液氮气吹干后乙醇复溶。
进一步地，步骤(2)所述萃取剂为异辛烷。
经过对萃取剂的筛选和优化，优选采用异辛烷为萃取剂，提升检测灵敏度。
进一步地，步骤(4)所述液相色谱的流动相A为水：甲醇：异丙醇＝8:1:1，流动相B为甲醇：异丙醇＝9:1，流动相A和流动相B中都含有0.1％甲酸。
研究证明，流动相中添加乙腈会对目标待测物的信号响应产生抑制，优选采用甲醇来配制流动相，有助于提高检测灵敏度。
另一方面，本发明提供了三氯乙酸用于提高磷脂去除板的去除血浆样品中干扰物的效果的用途。
进一步地，所述三氯乙酸添加在处理血浆样品的蛋白沉淀剂中，所述蛋白沉淀剂为乙醇：乙腈：异丙醇＝90:5:5。
再一方面，本发明提供了三氯乙酸用于帮助磷脂去除板去除血液样品中的磷脂或干扰物，提高血液样品中VK1、MK-4和MK-7检测的信噪比的用途。
再一方面，本发明提供了磷脂去除板用于提高血液样品中VK1、MK-4和MK-7检测的信噪比的用途。
再一方面，本发明提供了磷脂去除板用于提升血液样品中VK1、MK-4和MK-7的检测准确性的用途。
本发明通过增加磷脂去除板进行样品前处理，提高信噪比，使样品中的VK1、MK-4和MK-7的加标回收率明显提升，有效保证了检测的准确性。
本发明提供的方法具有以下有益效果：
1、能同时准确检测血液样品中VK1、MK-4和MK-7；
2、提高信噪比，降低定量下限，VK1、MK-4和MK-7的定量下限分别为0.003ng/mL、0.005ng/mL和0.012ng/mL，覆盖正常人的参考浓度范围；
3、可以有效去除90％磷脂类干扰物，降低干扰物对MS检测离子抑制，明显降低样品中的基质效应，尤其可以明显降低MK-7的基质抑制效应；
4、保护仪器和色谱柱免受污染，降低仪器维护频率，提高色谱柱寿命；
5、实现血液样品中VK1、MK-4和MK-7的高灵敏度和高准确性检测，满足临床所需。
附图说明
图1为实施例2中采用磷脂去除板前处理血清样本检测图谱，其中(1)为VK1的检测图谱，(2)为MK-4的检测图谱，(3)为MK-7的检测图谱；
图2为实施例2中采用无磷脂去除板前处理(液液萃取法)血清样本检测图谱，其中(1)为VK1的检测图谱，(2)为MK-4的检测图谱，(3)为MK-7的检测图谱；
图3为实施例3中的第1～4种处理方式后VK1的检测图谱，其中(1)为第1种处理方式，(2)为第2种处理方式，(3)为第3种处理方式，(4)为第4种处理方式；
图4为实施例3中的第1～4种处理方式后MK-4的检测图谱，其中(1)为第1种处理方式，(2)为第2种处理方式，(3)为第3种处理方式，(4)为第4种处理方式；
图5为实施例3中的第1～4种处理方式后MK-7的检测图谱，其中(1)为第1种处理方式，(2)为第2种处理方式，(3)为第3种处理方式，(4)为第4种处理方式；
图6为实施例4中的蛋白沉淀剂中添加4％TCA的MK-7的检测色谱图；
图7为实施例4中的蛋白沉淀剂中添加3％FA的MK-7的检测色谱图；
图8为实施例4中的蛋白沉淀剂中添加3％HAC的MK-7的检测色谱图；
图9为实施例7中的MK-4在流动相B为乙腈:异丙醇＝9:1(0.1％FA)时的检测图谱；
图10为实施例7中的MK-4在流动相B为甲醇:异丙醇＝9:1(0.1％FA)时的检测图谱。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。应当指出的是，实施例只是对本发明的详细阐述，不能以此限定本发明的保护范围，本发明的实施例中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均能够以任何方式组合，均在本实发明的保护范围之内。本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
实施例1、本发明提供的同时检测血液样本中的VK1、MK-4和MK-7的方法
一、样品制备
1.校准品和质控样品的配制
将VK1，MK-4和MK-7标准品配制成混合溶液，作为标准工作液和质控工作液的储备液，标准工作液的储备液与4％BSA按1:19的体积比混合，质控工作液的储备液与混合空白血清1:99的体积比混合，分别配制校准曲线和质控样品。校准曲线配制7个系列浓度(C1～C7)，质控样品配制2个系列浓度(LQC和HQC)，分别如下表1和表2所示。
表1、VK1，MK-4和MK-7在校准曲线中的7个系列浓度(C1～C7)
| 校准曲线 | MK-4(ng/mL) | MK-7(ng/mL) | VK<sub>1</sub>(ng/mL) |
| C1 | 0.025 | 0.025 | 0.025 |
| C2 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| C3 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| C4 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| C5 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| C6 | 2 | 2 | 2 |
| C7 | 5 | 5 | 5 |
表2、VK1，MK-4和MK-7在质控样品中的2个系列加标浓度(LQC和HQC)
| 质控品 | MK-4(ng/mL) | MK-7(ng/mL) | VK1 |
| LQC | 0.3 | 0.3 | 0.45 |
| HQC | 1.5 | 1.5 | 3.0 |
2、内标溶液的配制
(1)内标准品工作液的配制
配制混合内标准品工作液，VK1-d4，MK-4-d7和MK-7-d7的浓度分别为1μg/mL，2μg/mL和6μg/mL。
(2)蛋白沉淀剂的配制
分别量取900mL乙醇，50mL乙腈和50mL异丙醇，配制成含90％乙醇，5％乙腈和5％异丙醇的混合溶液；取576mL上述混合溶液，加入384mL超纯水和三氯乙酸溶液40mL，制得1000mL蛋白沉淀剂。
(3)内标工作溶液的配制
在制得的1000mL蛋白沉淀剂中加入内标准品工作液1mL，即为内标工作溶液。
二、样品前处理
待测人血清样品，校准品和质控品采用如下方法进行前处理：
(1)取200μL校准品/质控品/待测人血清样本，加入2mL离心管中；加入600μL内标工作液，2000rpm转速下振荡5min。
(2)加入1mL异辛烷，2000rpm转速下涡旋振荡10min，12000rpm转速下离心5min，取上层有机相700μL加到FastRemover磷脂去除板对应孔中，静置5min；
(3)正压仪调节压力控制液体以1滴/秒的流速流下，正压压干1min后加入1000μL异辛烷淋洗，收集淋洗液氮气吹干后150μL 80％乙醇复溶，检测。
三、样品检测
液相色谱串联质谱系统：CalQuant-S液相色谱串联质谱检测系统，色谱柱：Phenyl-Hexyl(2.6μm，3.0*50mm，Phenomenex)，流动相A：水:甲醇:异丙醇＝8:1:1(0.1％FA)，流动相B：甲醇:异丙醇＝9:1(0.1％FA),流速：0.6mL/min，柱温：40℃，进样器温度：15℃，进样体积：40μL。
梯度洗脱条件如下表3所示。
表3、梯度洗脱条件
质谱检测条件：离子源为大气压化学电离源(APCI)，正离子模式，离子源参数为：脱溶剂气(GS1)为55psi，离子源加热温度为350℃，气帘气(Curtain Gas，CUR)为25psi，碰撞气(Collision Gas，CAD)为9psi，雾化电流NC为3μA。扫描方式为多反应监测(MultipleReaction Monitoring，MRM)模式。
化合物的质谱参数如表4所示：
表4化合物的质谱参数
四、数据处理及分析
绘制标准曲线：标准曲线以维生素K2和维生素K1校准品的浓度为横坐标，以维生素K2，维生素K1与其各自内标峰面积比为纵坐标，进行线性拟合，获得线性回归方程。线性方程及相关系数r如表5所示。维生素K1，维生素K2(MK-4)和维生素K2(MK-7)在0.025-5.0ng/mL浓度范围内，线性较好，相关系数r均大于0.9900。
表5、线性方程及相关系数r
| 检测指标 | 线性方程及相关系数 |
| MK-4 | y＝0.21804x+0.00125(r＝0.99976) |
| MK-7 | y＝0.13876x-9.37602e-4(r＝0.99915) |
| VK<sub>1</sub> | y＝0.24790x-7.36836e-5(r＝0.99695) |
信噪比为目标待测物的峰高与背景峰的峰高的比值，其中的背景峰是由基线噪音产生的，是连续上下波动的峰，计算信噪比为目标峰的峰高与目标峰保留时间位置附近的背景峰峰高的比值，由软件计算获得，(软件版本：Analyst 1.7.2)进行计算获得；定量检测下限是指样品中的目标待测物能被准确定量测定的最低值，回收率在85％-115％范围内，信噪比S/N＝10的最低浓度点为本发明的定量下限(LOQ)；加标回收率为血清质控品(LQC)测定值与理论值的比值，重复5次计算平均加标回收率。本实施例提供的同时检测血液样本中的VK1、MK-4和MK-7的方法，能使VK1、MK-4和MK-7的定量检测下限分别达到0.003ng/mL、0.005ng/mL和0.012ng/mL，加标回收率达到93.19％～107.83％，精密度达到0.2～5.5％。结果见表6。
表6、VK1，MK-4和MK-7方法定量限检测数据
| 检测指标 | 检测峰面积 | 信噪比 | 定量下限(LOQ) | 加标回收率(％) |
| VK1 | 578600 | 2465 | 0.003 | 107.83 |
| MK-4 | 176300 | 628 | 0.005 | 93.19 |
| MK-7 | 62070 | 573 | 0.012 | 99.02 |
实施例2、不同前处理法同时检测新鲜血清样本中VK1，MK-4和MK-7结果比较
按照实施例1提供的步骤完成样品制备和前处理，采用磷脂去除板法和液液萃取法(不经过磷脂板处理)分别检测新鲜血清样本。从图9-10和表7可以看出，磷脂去除板法的色谱峰更干净，信噪比明显提高，而且磷脂去除板法提取的目标物峰面积显著高于液液萃取法，可以显著提高血液样本中尤其是MK-4的检出率和定量准确性。
表7、不同前处理方法检测新鲜血清样本比较
由于本实施例直接采用临床的新鲜血清样本，其中的待测物VK1，MK-4和MK-7含量低，且基线噪音，干扰峰都更明显，但经磷脂去除板处理后，能明显降低基线噪音，减少干扰峰，提高信噪比，从而降低定量检测下限。
实施例3、磷酸去除板和有机酸对质控品检测结果的影响
本实施例取低点血清质控(LQC)作为待测样本，按照实施例1提供的步骤完成样品制备和前处理，其中蛋白沉淀剂为90％乙醇，5％乙腈和5％异丙醇的混合溶液，经蛋白沉淀和异辛烷萃取后，分别采用以下4种方式进行处理：1、不经磷脂去除板处理，直接进样检测；2、经FastRemover磷脂去除板处理后进样检测；3、在蛋白沉淀剂中添加4％TCA，不经磷脂去除板处理，直接进样检测；4、在蛋白沉淀剂中添加4％TCA，经FastRemover磷脂去除板处理后进样检测。分析4种不同方式对血清质控品LQC中VK1，MK-4和MK-7的检测峰面积、信噪比的影响，其中信噪比为目标待测峰的峰高与背景峰的峰高的比值，信噪比通过计算机软件(软件版本：Analyst 1.7.2)进行计算获得；检测结果如表8所示，4种方式对检测低点血清质控样品中VK1、MK-4和MK-7的色谱图如图3～5，其中图3为第1～4种处理方式后VK1的检测图谱，图4为第1～4种处理方式后MK-4的检测图谱，图5为第1～4种处理方式后MK-7的检测图谱，其中图1～3的(1)为第1种处理方式，(2)为第2种处理方式，(3)为第3种处理方式，(4)为第4种处理方式。
表8、4种不同处理方式对VK1，MK-4和MK-7检测的影响
由表8，对比方式1和2可以看出，相比于前处理未使用磷脂去除板的情况，前处理使用磷脂去除板但不添加有机酸，其提高信噪比，降低定量下限的效果并不显著。故使用磷脂去除板进行前处理沉淀剂中需要加入有机酸。本实施例比较过多种磷脂去除板，因此这里以FastRemover磷脂去除板进行举例说明。
图3～图5中的干扰峰主要为磷脂类物质，经FastRemover磷脂去除板处理后，基线噪音和干扰峰都显著下降。
对比方式2和4可以看出，在添加磷脂去除板的基础上，在蛋白沉淀剂中添加有机酸，能帮助磷脂去除板提高去除磷脂的效果，使目标待测物检测图谱中的背景峰高明显降低，进一步提高信噪比，降低定量检测下限，其原因可能是添加酸有助于磷脂的磷酸基团特异性结合到磷脂去除板的填料上，可以和待测物达到分离的效果。本实施例尝试比较过多种有机酸，4％TCA效果更明显，因此这里以4％TCA进行举例说明。
需要说明的是，检测峰面积的高低并不能说明哪种处理方式的优劣，目标待测物的检测峰面积还需要与内标的检测峰面积相比，计算比值，因此检测峰面积高时，内标的检测峰面积也高，其比值相差可能就没这么明显了；但如果背景峰高，则会使信噪比降低，定量检测下限较高，影响低浓度样品检测准确度；而且干扰峰如果与待测物的峰难以分离，会导致检测结果偏高，检测结果不准确。因此在检测过程中，首先必须尽量降低背景峰，分离干扰峰，提高信噪比，才能保证检测结果的准确性，才能使定量检测下限进一步下降。信噪比越高和待测物峰面积越大的处理方式越具有优越性，较优的前处理方法需要同时考虑信噪比高低和检测峰面积的大小。
因此最佳的处理方式为第4种，在蛋白沉淀剂中添加4％TCA，还需经FastRemover磷脂去除板处理后进样检测，使VK1、MK-4和MK-7的信噪比分别达到2869、628、573，定量检测下限分别为0.003ng/mL、0.005ng/mL和0.012ng/mL，检测结果更加准确。
实施例4、不同有机酸对磷脂去除板处理效果的影响
1、不同种类有机酸的影响
本实施例取低点血清质控(LQC)作为待测样本，按照实施例1提供的步骤完成样品制备和前处理，其中蛋白沉淀剂中的有机酸分别采用如表9所示的不同有机酸，并以不加有机酸作为空白对照，完成蛋白沉淀、萃取和磷脂去除板处理等前处理后，进行液相色谱质谱联用系统分析，分析不同有机酸对血清质控品LQC中VK1，MK-4和MK-7的检测峰面积、信噪比的影响，检测结果如表9所示，由于MK-7的基质效应影响更明显，因此这里以MK-7的检测色谱图进行举例说明，详见图6～8所示，其中图6为添加4％TCA的MK-7的检测色谱图，图7为添加3％FA的MK-7的检测色谱图，图8为添加3％HAC的MK-7的检测色谱图。
表9、不同有机酸对样品中VK1，MK-4和MK-7检测的影响
由图6～8和表9可以看出，在蛋白沉淀剂中添加不同有机酸，会直接影响到VK1，MK-4和MK-7的检测图谱中的干扰峰的高低，从而会影响信噪比，影响定量检测下限。
比如当添加的有机酸为HAC时，虽然VK1，MK-4和MK-7的峰面积比较高，但是干扰峰也同样非常高，信噪比偏低，定量检测下限更高；而当添加的有机酸为TCA时，虽然VK1，MK-4和MK-7的峰面积稍低，但是基线噪音更低，干扰峰较少，图谱更干净，信噪比更高，定量检测下限更低，检测结果更准确。因此有机酸优选采用TCA。
2、不同浓度TCA的影响
本实施例取低点血清质控(LQC)作为待测样本，按照实施例1提供的步骤完成样品制备和前处理，其中蛋白沉淀剂中的有机酸分别采用如表10所示的不同浓度的TCA，完成蛋白沉淀、萃取和磷脂去除板处理等前处理后，进行液相色谱质谱联用系统分析，分析不同浓度TCA对血清质控品LQC中VK1，MK-4和MK-7的检测峰面积、信噪比的影响，检测结果如表10所示。
表10、不同浓度TCA对样品中VK1，MK-4和MK-7检测的影响
由表10可以看出，在蛋白沉淀剂中添加不同浓度的TCA，会直接影响到VK1，MK-4和MK-7色谱峰的峰面积和信噪比，从而影响定量检测下限和检测结果的准确性。优选采用4％的TCA，此时基线噪音更低，干扰峰较少，图谱更干净，信噪比更高，定量检测下限更低，检测结果更准确。
实施例5、不同磷脂去除板对磷脂去除效果的影响
本实施例取低点血清质控(LQC)作为待测样本，按照实施例1提供的步骤完成样品制备和前处理，蛋白沉淀剂中的有机酸为4％TCA，完成蛋白沉淀、萃取和磷脂去除板处理等前处理后，进行液相色谱质谱联用系统分析，其中磷脂去除板分别选用如表11所示的4种不同种类的磷脂去除板，分析不同磷脂去除板对血清质控品(LQC)中VK1，MK-4和MK-7检测的峰面积、信噪比的影响，检测结果如表11所示。
表11、不同磷脂去除板对样品中VK1、MK-4和MK-7检测的影响
由表11可以看出，不同种类磷脂去除板对样品中干扰物的去除效果存在明显区别，其中FastRemover磷脂去除板的净化效果最好，样品中VK1，MK-4和MK-7的检测图谱的信噪比，和待测物的峰面积都最大，定量检测下限更低，检测结果更准确，其原因可能是FastRemover磷脂去除板填料中含有的二氧化钛和氧化锆能够特异性吸附磷酸基团物质，有效去除90％的磷脂类干扰物。
实施例6、不同蛋白沉淀剂对检测结果的影响
本实施例分别采用如表12所示的不同种类的蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，取低点血清质控(LQC)作为待测样本，按照实施例1提供的步骤完成样品制备和前处理，完成蛋白沉淀、萃取和磷脂去除板处理等前处理后，进行液相色谱质谱联用系统分析，分析不同蛋白沉淀剂对血清质控品(LQC)中VK1，MK-4和MK-7检测的峰面积的影响，检测结果如表12所示。
表12、不同蛋白沉淀剂对样品中VK1、MK-4和MK-7检测的影响
| 蛋白沉淀剂 | VK1 | MK-4 | MK-7 |
| EtOH:ACN:IPA＝90:5:5 | 644200 | 20810 | 36870 |
| EtOH:ACN:IPA＝80:15:5 | 308000 | 11460 | 20490 |
| EtOH:ACN:IPA＝75:15:10 | 607000 | 20820 | 35590 |
| EtOH:ACN:IPA＝70:25:5 | 311700 | 14200 | 19280 |
| EtOH:ACN:IPA＝60:30:10 | 490000 | 19840 | 31740 |
由表12可以看出，采用不同的蛋白沉淀剂，在其他条件(如基线噪音更低、干扰峰、信噪比等等)都不变的情况下，采用蛋白沉淀剂为EtOH:ACN:IPA＝90:5:5时，能使样品中VK1，MK-4和MK-7检测的图谱峰面积更大，有助于提高检测灵敏度。
实施例7、流动相的筛选
本实施例取低点血清质控(LQC)作为待测样本，按照实施例1提供的步骤完成样品制备和前处理，然后分别采用如表10所示的两种流动相进行液相色谱质谱联用系统分析，分析不同流动相对血清质控品(LQC)中VK1，MK-4和MK-7检测结果的影响，检测峰面积如表13所示，其中MK-4的检测图谱见图9、图10，图9为MK-4在流动相1时的检测图谱，图10为MK-4在流动相2时的检测图谱。
表13、流动相对样品中VK1、MK-4和MK-7检测的影响
由图9、10都可以看出，从色谱图的峰面积可以看出，B相中添加乙腈时对3种目标待测物的信号响应抑制较明显；当流动相B为乙腈:异丙醇＝9:1(0.1％FA)时，图7中的MK-4峰高为35000，而当流动相B为甲醇:异丙醇＝9:1(0.1％FA)时，图8中的MK-4峰高为260000。
同样，由表13也可以看出，采用流动相B为甲醇:异丙醇＝9:1(0.1％FA)时，VK1，MK-4和MK-7的峰面积可以显著提高，提高检测灵敏度，因此流动相B优选为甲醇:异丙醇＝9:1(0.1％FA)。
本发明未尽事宜为公知技术。虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (10)
1.一种同时检测血液样品中VK1、MK-4和MK-7的方法，其特征在于，所述血液样品需先经含有有机酸的蛋白沉淀剂处理，再经磷脂去除板处理。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取血液样品与含有机酸的蛋白沉淀剂混匀，所述有机酸为三氯乙酸、乙酸或甲酸中的任意一种或多种；
(2)加入萃取剂萃取，取上层有机相；
(3)上层有机相加入磷脂去除板处理；
(4)液相色谱串联质谱检测。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述有机酸为三氯乙酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白沉淀剂为乙醇：乙腈：异丙醇＝90:5:5，所述三氯乙酸含量为4％。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述磷脂去除板为FastRemover磷脂去除板。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述磷脂去除板的处理过程为：取上层有机相上样至磷脂去除板对应的孔中，静置5min后正压压缩收集流出液，正压压干后加入异辛烷淋洗，收集淋洗液氮气吹干后乙醇复溶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述萃取剂为异辛烷。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述液相色谱的流动相A为水：甲醇：异丙醇＝8:1:1，流动相B为甲醇：异丙醇＝9:1，流动相A和流动相B中都含有0.1％甲酸。
9.三氯乙酸用于帮助磷脂去除板去除血液样品中的磷脂，提高血液样品中VK1、MK-4和MK-7检测的信噪比的用途。
10.磷脂去除板用于提高血液样品中VK1、MK-4和MK-7检测的信噪比的用途。
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