CN110208438A - 一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法 - Google Patents

一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，该方法包括：利用高效液相串联质谱仪检测至少三个标准溶液得到相应色谱图，标准溶液中含浓度已知的多种维生素及其内标物；根据标准溶液中各个维生素与其内标物的浓度比值、相应色谱图中两者的峰面积比值，拟合得到各个维生素的标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品，并加入浓度已知的多种内标物，经样品前处理以得到待测样品；在相同检测条件下检测待测样品得到其色谱图；将该色谱图中各个维生素与其内标物的峰面积比值，代入到相应标准曲线方程，并根据所添加的其内标物的浓度，计算出待检测血液中各个维生素的含量。本发明能够同时检测血液中多种脂溶性维生素的含量。

Description

一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法
技术领域
本发明涉及化学技术领域，特别涉及一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法。
背景技术
脂溶性维生素与人体健康状况息息相关。
维生素A与正常视觉有密切关系，为骨骼正常生长所必需，有助于细胞的增生与生长，并对上皮的正常形成，发育以及维持十分重要。近年证实，维生素A有延缓或阻止前病变，防止化学性致癌物作用，特别是防止上皮恶性肿瘤的作用。通过血清维生素A定量测定，对某些疾病的诊断和疗效观察有很大意义。比如异常结果有：(1)降低：维生素A缺乏症(夜盲症、干眼症、角膜软化病)、脂类吸收不良综合征、毛囊角化增生症、锌缺乏症、肝损害、阻塞性黄疸、甲状腺功能亢进症，外伤等；(2)升高：维生素A过剩症、肾功能不全、甲状腺功能减退症。
25-羟维生素D是维生素D在体内的主要存在形式。维生素D不仅仅影响钙磷代谢，而且具有广泛的生理作用，是维持人体健康、细胞生长和发育的必不可少的物质，与多种疾病密切相关。在人体内有两种形式的维生素D，维生素D3(胆钙化醇)和维生素D2(麦角钙化醇)。
具体地，25-羟基维生素D3是胆固醇的衍生物，也称胆钙化醇，其活性形式有25-羟25-羟基维生素D3(25-(OH)2-VitD3)，1,25-二羟维生素D3(1,25-(OH)2-VitD3)两种，其中25-二羟维生素D3为主要形式。其生物学作用主要包括：①促进小肠粘膜对钙和磷的吸收；②促进肾小管对钙、磷的重吸收；③调节血钙平衡；④调节骨钙的沉积和释放。羟基维生素D缺乏主要表现为骨质软化症(osteomalacia)、骨质疏松症(osteoporosis)及佝偻病等。前者常见于成人和孕产妇，后者多发生于儿童。25-羟维生素D过多常由于过量摄入维生素D引起。其临床表现为疲劳、无力、食欲缺乏、恶心、呕吐、腹泻等，严重者可有生长发育迟缓、高热、脱水、癫痫发作等，可引起肾、脑、肺、胰腺等脏器有异位钙化灶和肾结石。
维生素E是生育酚与三烯生育酚的总称。α-生育酚是维生素E中最具生物活性的形式，可以有效阻止脂肪氧化时活性氧化物的形成，为细胞膜上的重要组成成分，亦是细胞膜上的主要抗氧化剂。生育酚对人体最重要的生理功能是促进生殖，还可改善脂质代谢，缺乏时导致血浆胆固醇与甘油三脂的升高，形成动脉粥样硬化；稳定细胞膜和细胞内脂类部分，减低红细胞脆性，防止溶血，缺乏时出现溶血性贫血。大剂量可促进毛细血管及小血管的增生，改善周围循环。另外对防治男性不育症也有一定帮助。比如异常结果有：(1)降低：维生素E缺乏病；(1)偏高：出血性脑卒中。
维生素K1参与肝内凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ等的合成，并且是凝血过程中纤维蛋白原转变成纤维蛋白的促进因子。人体内维生素K1缺乏可造成凝血障碍，导致凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症等。维生素K1作为医药制剂，在临床上应用于凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症的防治以及梗阻性黄疸、胆瘘、慢性腹泻等所致出血，香豆素类、水杨酸钠等所致的低凝血酶原血症。已有研究报道，维生素K1补充过量可导致严重的不良反应，包括呼吸困难、过敏样反应、紫绀、过敏性休克等，累及系统/器官以呼吸系统损害、全身性损害为主。
维生素K2作为谷氨酸-γ-羧化酶的辅酶参与机体的正常凝血过程。临床上可广泛用于治疗新生儿、婴儿及孕妇由于维生素K缺乏造成的出血症；治疗和预防骨质疏松症，维生素K2生成骨蛋白质，再与钙共同生成骨质，增加骨密度，防止骨折，同时，饮食中加入适当的维生素K2可以有效地降低冠状动脉钙化；近几年，研究发现，维生素K2对多种恶性肿瘤细胞有生长抑制作用，并可诱导肝细胞癌、卵巢癌等多种实体瘤和白血病骨髓增生异常综合征的细胞凋亡，具有明显的抗肿瘤作用，且与多种抗肿瘤药有协同作用。
目前，可利用HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法)，检测单种脂溶性维生素，但尚未有血液中多种脂溶性维生素同时测定的方法。
发明内容
本发明提供了一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，能够同时检测血液中多种脂溶性维生素的含量。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供了一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，包括：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测N个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的至少两种脂溶性维生素及其内标物，不同标准溶液中同一脂溶性维生素的浓度不同，且N≥3；以标准溶液中，一脂溶性维生素的浓度与其内标物的浓度的比值为一二维坐标，以及以该标准溶液的色谱图中，该脂溶性维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值为另一二维坐标，拟合得到该脂溶性维生素的标准曲线方程，从而得到各种脂溶性维生素的标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品；将一定量的含有浓度已知的至少两种内标物的混合内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品；利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样品，得到所述待测样品的色谱图；将所述待测样品的色谱图中，一脂溶性维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值，代入到该脂溶性维生素的标准曲线方程中，并根据所添加的其内标物的浓度，计算出所述待检测血液中该脂溶性维生素的含量，从而得到所述待检测血液中各种脂溶性维生素的含量；其中，第i种脂溶性维生素的标准曲线方程为：yi＝ki×xi+bi，其中，yi表征峰面积比值，xi表征浓度比值，ki和bi均表征系数。
本发明提供了一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，能够同时检测血液中多种脂溶性维生素的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的维生素A的化学结构式；
图3是本发明一实施例提供的25-羟基维生素D2的化学结构式；
图4是本发明一实施例提供的25-羟基维生素D3的化学结构式；
图5是本发明一实施例提供的维生素E的化学结构式；
图6是本发明一实施例提供的维生素K1的化学结构式；
图7是本发明一实施例提供的维生素K2(MK4)的化学结构式；
图8是本发明一实施例提供的一标准溶液中维生素A的色谱图；
图9是本发明一实施例提供的一标准溶液中维生素A的同位素内标的色谱图；
图10是本发明一实施例提供的一待测样品中维生素A的色谱图；
图11是本发明一实施例提供的一待测样品中维生素A的同位素内标的色谱图；
图12是本发明一实施例提供的一标准溶液中25-羟基维生素D2的色谱图；
图13是本发明一实施例提供的一标准溶液中25-羟基维生素D2的同位素内标的色谱图；
图14是本发明一实施例提供的一待测样品中25-羟基维生素D2的色谱图；
图15是本发明一实施例提供的一待测样品中25-羟基维生素D2的同位素内标的色谱图；
图16是本发明一实施例提供的一标准溶液中25-羟基维生素D3的色谱图；
图17是本发明一实施例提供的一标准溶液中25-羟基维生素D3的同位素内标的色谱图；
图18是本发明一实施例提供的一待测样品中25-羟基维生素D3的色谱图；
图19是本发明一实施例提供的一待测样品中25-羟基维生素D3的同位素内标的色谱图；
图20是本发明一实施例提供的一标准溶液中维生素E的色谱图；
图21是本发明一实施例提供的一标准溶液中维生素E的同位素内标的色谱图；
图22是本发明一实施例提供的一待测样品中维生素E的色谱图；
图23是本发明一实施例提供的一待测样品中维生素E的同位素内标的色谱图；
图24是本发明一实施例提供的一标准溶液中维生素K1的色谱图；
图25是本发明一实施例提供的一标准溶液中维生素K1的同位素内标的色谱图；
图26是本发明一实施例提供的一待测样品中维生素K1的色谱图；
图27是本发明一实施例提供的一待测样品中维生素K1的同位素内标的色谱图；
图28是本发明一实施例提供的一标准溶液中维生素K2(MK4)的色谱图；
图29是本发明一实施例提供的一标准溶液中的同位素内标的色谱图；
图30是本发明一实施例提供的一待测样品中维生素K2(MK4)的色谱图；
图31是本发明一实施例提供的一待测样品中维生素K2(MK4)的同位素内标的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
如图1所示，本发明实施例提供了一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，可以包括以下步骤：
步骤101：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测N个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的至少两种脂溶性维生素及其内标物，不同标准溶液中同一脂溶性维生素的浓度不同，且N≥3。
步骤102：以标准溶液中，一脂溶性维生素的浓度与其内标物的浓度的比值为一二维坐标，以及以该标准溶液的色谱图中，该脂溶性维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值为另一二维坐标，拟合得到该脂溶性维生素的标准曲线方程，从而得到各种脂溶性维生素的标准曲线方程，其中，第i种脂溶性维生素的标准曲线方程为：yi＝ki×xi+bi，其中，yi表征峰面积比值，xi表征浓度比值，ki和bi均表征系数。
步骤103：处理待检测血液得到血液样品。
步骤104：将一定量的含有浓度已知的至少两种内标物的混合内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品。
步骤105：利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样品，得到所述待测样品的色谱图。
步骤106：将所述待测样品的色谱图中，一脂溶性维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值，代入到该脂溶性维生素的标准曲线方程中，并根据所添加的其内标物的浓度，计算出所述待检测血液中该脂溶性维生素的含量，从而得到所述待检测血液中各种脂溶性维生素的含量。
优选地，各种维生素的内标物为其同位素内标物。
详细地，这6个步骤分别限定了标准溶液的检测、标准曲线方程的获得、待检测血液的处理、待测样品的获得、待测样品的检测、待检测血液中各种脂溶性维生素含量的计算，从而完成对血液中多种脂溶性维生素含量的检测。
详细地，由于yi＝ki×xi+bi可变形为xi＝yi/ki-bi/ki，1/ki和-bi/ki均表征系数，故步骤102中，既可以以峰面积比值为纵坐标且以浓度比值为横坐标，也可以以峰面积比值为横坐标且以浓度比值为纵坐标。
详细地，由于样品的前处理过程会涉及到样品混匀，故待检测血液中脂溶性维生素的含量，与血液样品及待测样品中脂溶性维生素的含量是一致的。
本发明实施例中，可利用高效液相串联质谱仪对标准溶液进行检测，以拟合得出代表各种脂溶性维生素的标准曲线方程，然后取待检测血液样品，该待检测血液样品经过前处理后，使用相同的高效液相串联质谱仪对待测的样品进行检测，得到待测血液yi值，将待测血液样品的yi代入上述标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中脂溶性维生素含量与内标物浓度的比值xi，由于各个内标物浓度是已知的，故通过计算可以得到待检测血液样品中的各种脂溶性维生素的浓度。
可见，本发明实施例提供的这一检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，是将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，使干扰因素大大减少，且特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，同时分析时间缩短。
实施例二
本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少两种脂溶性维生素包括：维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2中的至少两种。
请参考图2至图6，图2示出了维生素A的化学结构式，图3示出了25-羟基维生素D2的化学结构式，图4示出了25-羟基维生素D3的化学结构式，图5示出了维生素E的化学结构式，图6示出了维生素K1的化学结构式。
详细地，这里的维生素K2可以为维生素K2(MK4)、维生素K2(MK7)、维生素K2(MK9)。请参考图7，图7示出了维生素K2(MK4)的化学结构式。
详细地，对应于上述步骤101，在检测标准溶液之前，首先需要配置各个标准溶液。进一步地，在配置各个标准溶液之前，还需配置各个标准储备液、各个标准工作液、各个内标储备液和混合内标工作液。
详细地，对于标准溶液的配置，至少可以存在下述实施例三。
实施例三
本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少两种脂溶性维生素的种类数为6；
在所述步骤101之前，进一步包括：
步骤A1：利用移液器移取90μL第一标准工作液、10μL第二标准工作液和10μL所述混合内标工作液至离心管中，其中，第一标准工作液中含有浓度已知的维生素A和浓度已知的维生素E，第二标准工作液中含有浓度已知的25-羟基维生素D2、浓度已知的25-羟基维生素D3、浓度已知的维生素K1和浓度已知的维生素K2；
步骤A2：将该离心管在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混匀1min-2min后，移取上清液以得到标准溶液。举例来说，转速的取值可以为1500、1700、1900、2100、2300或2500；涡旋时间的取值可以为1、1.2、1.4、1.6、1.8或2。
本发明实施例适用于需要同时测定上述6种脂溶性维生素的应用场景。由于维生素A和维生素E的浓度需要现配现用现标定，故本发明实施例可配置两份标准工作液，一份含维生素A和维生素E，另一份含另外四种维生素。
详细地，对于储备液和工作液的配置，至少可以存在下述实施例四。
实施例四
本发明实施例与实施例三基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：在步骤A1之前，进一步包括：
步骤B1：精确称取10mg的维生素A的标准品，并置于10mL容量瓶中，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第一标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
步骤B2：选购25-羟基维生素D2的浓度在10μg/mL-1000μg/mL之间的第三标准储备液；
步骤B3：选购25-羟基维生素D3的浓度在10μg/mL-1000μg/mL之间的第四标准储备液；
步骤B4：精确称取25mg的维生素E的标准品，并置于5mL容量瓶中，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第二标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
步骤B5：精确称取10mg的维生素K1的标准品，并置于10mL容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到第五标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
步骤B6：精确称取10mg的维生素K2的标准品，并置于10mL容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到第六标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
步骤B7：临用前测定所述第一标准储备液中维生素A的浓度、所述第二标准储备液中维生素E的浓度，然后根据所述第一标准储备液中维生素A的浓度和所述第二标准储备液中维生素E的浓度，取一定量的所述第一标准储备液于一定体积的容量瓶中，用无水乙醇进行稀释并定容，以得到第一校正工作液，并取一定量的所述第二标准储备液于一定体积的容量瓶中，用无水乙醇进行稀释并定容，以得到第二校正工作液，再取一定量的所述第一校正工作液和一定量的所述第二校正工作液于一定体积的容量瓶中，用90％甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述第一标准工作液，且所述第一标准工作液中维生素A的浓度介于0.03125μg/mL-4.0μg/mL之间，维生素E的浓度介于0.625μg/mL-80μg/mL之间；
步骤B8：取一定量的所述第三标准储备液、一定量的所述第四标准储备液、一定量的所述第五标准储备液、一定量的所述第六标准储备液置于一定体积的容量瓶中，用90％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述第二标准工作液，且所述第二标准工作液中25-羟基维生素D2的浓度介于3.9ng/mL-500ng/mL之间，25-羟基维生素D3的浓度介于12.5ng/mL-1600ng/mL之间，维生素K1的浓度介于0.5ng/mL-1000ng/mL之间，维生素K2的浓度介于0.5ng/mL-1000ng/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月；
步骤B9：取10mg维生素A的内标物，该内标物为维生素A的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第一内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
步骤B10：选购25-羟基维生素D2的内标物的浓度为100μg/mL为第三内标储备液，该内标物为25-羟基维生素D2的同位素内标物，且浓度为100μg/mL，并在-80℃下保存，有效期为1年；
步骤B11：取0.5mg25-羟基维生素D3的内标物，该内标物为25-羟基维生素D3的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第四内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
步骤B12：取1mg维生素E的内标物，该内标物为维生素E的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第二内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；
步骤B13：取1mg维生素K1的内标物，该内标物为维生素K1的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第五内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；
步骤B14：取0.25mg维生素K2的内标物，该内标物为维生素K2的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第六内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；
步骤B15：取一定量的所述第一内标储备液、一定量的所述第二内标储备液、一定量的所述第三内标储备液、一定量的所述第四内标储备液、一定量的所述第五内标储备液、一定量的所述第六内标储备液置于一定体积的容量瓶中，用90％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述混合内标工作液，且所述混合内标工作液中维生素A的同位素的浓度为4μg/mL，维生素E的同位素的浓度为33μg/mL，25-羟基维生素D2的同位素的浓度为100ng/mL，25-羟基维生素D3的同位素的浓度为350ng/mL，维生素K1的同位素的浓度为30ng/mL，维生素K2的同位素的浓度为30ng/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。
请参考上述步骤B1～B6，可依次配置或选购这6种维生素的标准储备液。
在步骤B7中，临用前测定维生素A标准储备液和维生素E标准储备液的浓度，据此按需配置维生素A校正工作液和维生素E校正工作液，并进行浓度换算。再据此按需配置两者的一系列混合标准工作液，并进行浓度换算。
在步骤B8中，根据另外四种维生素标准储备液的浓度，按需配置四者的一系列混合标准工作液，并进行浓度换算。
请参考上述步骤B9～B14，可依次配置或选购这6种维生素的内标物的内标储备液。在步骤B15中，根据六种内标储备液的浓度，按需配置六者的混合内标工作液，并进行浓度换算。
由于拟合一标准曲线方程时，至少需要三个坐标点才可保证最基本的拟合准确度，故对于任一维生素来说，应得到一系列不同维生素浓度的标准溶液。基于此，至少可以存在下述实施例五至实施例八。
实施例五
本发明实施例与实施例二基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D2时，所述N个标准溶液中25-羟基维生素D2的浓度包括：3.906ng/mL、7.8125ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL中的至少三个。
实施例六
本发明实施例与实施例二基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D3时，所述N个标准溶液中25-羟基维生素D3的浓度包括：12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL中的至少三个。
实施例七
本发明实施例与实施例二基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少两种脂溶性维生素包括维生素K1时，所述N个标准溶液中维生素K1的浓度包括：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL中的至少三个。
实施例八
本发明实施例与实施例二基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少两种脂溶性维生素包括维生素K2时，所述N个标准溶液中维生素K2的浓度包括：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL中的至少三个。
基于上述内容可知，由于维生素A的浓度需要现配现用现标定，故所述至少两种脂溶性维生素包括维生素A时，不会预先限定这N个标准溶液中维生素A的浓度有哪些。不过，可以限定这些浓度的个数为至少三个，数值介于0.03125μg/mL-4.0μg/mL之间。同理，由于维生素E的浓度需要现配现用现标定，故所述至少两种脂溶性维生素包括维生素E时，不会预先限定这N个标准溶液中维生素E的浓度有哪些。不过，可以限定这些浓度的个数为至少三个，数值介于0.625μg/mL-80μg/mL之间。
详细地，现有对维生素的检测，可采用高效液相色谱分离后与多波长吸收或联合吸收或荧光吸收相结合的检测方法，但这一方法易存在特异性差、样品处理复杂导致样本处理期间维生素含量的变化、分析时间长，方法特异性差，整个检测过程时间长的问题。
而本发明实施例提供的维生素检测方法，是采用高效液相串联质谱法进行检测，可解决上述问题。如此，需要控制一定的检测条件，以达到良好的检测效果。基于此，可存在下述实施例九。
实施例九
本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述检测条件包括：液相条件和串联质谱条件；
其中，所述液相条件包括：色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm，流动相为含体积比为0.05％-0.25％甲酸的甲醇水溶液和含体积比为0.05％-0.25％甲酸的甲醇乙腈溶液，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为85：15，甲醇乙腈溶液中甲醇与乙腈的体积比为3：1，分析时间为8.0min，柱温为25℃-33℃，进样量为10μL-30μL，流速为0.55mL/min-0.65mL/min；
其中，所述串联质谱条件包括：采用大气压化学电离源APCI(AdvancedConfiguration and Power Interface，高级配置与电源接口)，正离子扫描模式，选择反应监测模式，温度为300℃，气帘气压力为20psi，碰撞气流速为5μL/min，离子喷雾电压为5500V，雾化气压力为25psi。
举例来说，对于0.05％-0.25％这一取值范围，具体取值可以为0.05、0.1、0.15、0.2或0.25。此外，柱温的取值可以为25、27、29、31或33；进样量的取值可以为10、15、20、25或30；流速的取值可以为0.55、0.57、0.59、0.61、0.63或0.65。
在上述实施例九的实现基础之上，至少可以存在下述实施例十至实施例十二，或其中一个或多个实施例的结合。
实施例十
本发明实施例与实施例九基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述液相条件还包括：Poroshell 120EC-C18色谱柱。
实施例十一
本发明实施例与实施例九基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述液相条件包括：柱温为30℃。
实施例十二
本发明实施例与实施例九基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述液相条件包括：流速为0.6mL/min；
洗脱过程为：甲醇水溶液和甲醇乙腈溶液的百分用量比，在3.1min-6.5min的洗脱时间范围内为0:100，在其他洗脱时间范围内为100：0。
可见，这一洗脱方式为梯度洗脱，且洗脱过程可参照下述表1。
表1
详细地，对应于上述步骤103，对于如何处理待检测血液，至少可以存在下述实施例十三。
实施例十三
本发明实施例与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述步骤103包括：取不少于5mL(比如可以为6mL、8mL或10mL)的待检测血液，在3500rpm下离心10min，取上清液以作为血液样品，所述血液样品的保存条件为，置于-20℃下保存直至分析前备用。通常情况下，这一上清液可以为血清或血浆。
详细地，对应于上述步骤104，对于如何获得待测样品，至少可以存在下述实施例十四。
实施例十四
本发明实施例与实施例二基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述步骤104包括：用移液枪移取一定量的含有浓度已知的至少两种内标物的混合内标工作液，置于离心管中，再加入50μL-300μL(比如50μL、100μL、150μL、200μL、250μL或300μL)所述血液样品，再加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合2min-5min(比如2min、3min、4min或5min)；涡旋混合后在离心管中加入一定量的萃取试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合3min-10min(比如3min、5min、7min或10min)，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min(比如4min、5min或6min)；移取一定量离心后的上清液至离心管中，并转移至氮气吹干装置上以将上清液吹干；对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min(比如4min、5min或6min)，得到待测样品。
举例来说，对于1500rpm-2500rpm这一取值范围，具体取值可以为1500、1700、2000、2300或2500；对于10000rpm-15000rpm这一取值范围，具体取值可以为10000、11000、12000、13000、14000或15000。
本发明实施例中，通过简化前处理步骤，缩短样品处理时间。
通常情况下，待检测的维生素的种类不同时，上述复溶处理会有所差异，以保证良好的溶解效果，从而保证检测准确度。比如，需要检测维生素D类时，需在乙腈初溶后再进行纯水复溶，甚至可直接使用乙腈的纯水溶液进行复溶，但是乙腈的纯水溶液会对维生素K类的溶液造成影响。基于此，在上述实施例十四的实现基础之上，至少可以存在下述实施例十五至实施例十七。
实施例十五
本发明实施例与实施例十四基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3，且不包括维生素K1和/或维生素K2时，所述对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，包括：移取一定量的乙腈水溶液至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min。举例来说，转速的取值可以为1500、1700、2000、2300或2500；涡旋时间的取值可以为1、1.5、2、2.5或3。
实施例十六
本发明实施例与实施例十四基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3，且包括维生素K1和/或维生素K2时，所述对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，包括：移取一定量的乙腈至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min，再移取一定量的纯水至离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min。其中，转速和涡旋时间的具体取值可以同实施例十五所述。
实施例十七
本发明实施例与实施例十四基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述至少两种脂溶性维生素不包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3时，所述对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，包括：移取一定量的乙腈至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min。其中，转速和涡旋时间的具体取值可以同实施例十五所述。
此外，在上述实施例十四的实现基础之上，至少可以存在下述实施例十八至实施例二十，或其中一个或多个实施例的结合。
实施例十八
本发明实施例与实施例十四基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述内标工作液的移取量为10μL。
实施例十九
本发明实施例与实施例十四基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述沉淀蛋白试剂为乙醇，乙醇的用量为100μL-500μL。比如，这一用量取值可以为100、200、300、400或500。
实施例二十
本发明实施例与实施例十四基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：所述萃取试剂为正己烷，正己烷的用量为800μL-1200μL。比如，这一用量取值可以为800、900、1000、1100或1200。
综合上述实施例一至实施例二十，至少可以存在下述实施例二十一。
实施例二十一
本发明实施例提供了一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，可以包括以下步骤。
(一)标准溶液的标定
首先用移液器分别移取90μL至少三种不同浓度标准工作液G、10μL至少三种不同浓度标准工作液H和10μL混合内标工作液分别置于离心管中，混合制成至少三种不同浓度的标准溶液。如此，各标准溶液中均含有上述6种维生素和各自对应的内标物。将标准溶液分别在转速为1500rpm下涡旋混匀1min后，分别移取上清液，利用高效液相串联质谱仪对上清液进行检测，得到至少三种不同浓度标准溶液的色谱图。从上述各种浓度标准溶液的色谱图中分别得到各种维生素色谱峰面积及其内标物色谱峰面积。分别以上述至少三个不同浓度的各种维生素色谱峰面积与其内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1、y2、y3、y4、y5、y6，对应以上述至少三个不同浓度的各种维生素浓度与其内标物浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x1、x2、x3、x4、x5、x6，将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a×x1+b、y2＝c×x2+d、y3＝e×x3+f、y4＝g×x4+h、y5＝i×x5+j、y6＝k×x6+l，并且得系数a～l。
标准工作液G为含有维生素A和维生素E的溶液，标准工作液H为含有25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3的溶液、维生素K1、维生素K2(MK4)的溶液，混合内标工作液为含有维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2(MK4)同位素内标的溶液。
(1)标准储备液的配制：
标准储备液A：精确称取维生素A标准品10mg置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液A，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月；标准储备液A的浓度临用前校正。
标准储备液B：购买25-羟基维生素D2的标准溶液，浓度为100μg/mL。
标准储备液C：购买25-羟基维生素D3的标准溶液，浓度为100μg/mL。
标准储备液D：精确称取维生素E标准品25mg置于5mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解，并定容于5mL，得到标准储备液D，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。
标准储备液E：精确称取维生素K1标准品10mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液E，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月；标准储备液E的浓度临用前校正。
标准储备液F：精确称取维生素K2(MK4)标准品10mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液F，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。
(2)标准工作液的配制
标准工作液G：首先配制维生素A和维生素E的校正工作液，并将等体积的校正工作液进行混合，配制得到混合校正液，其中维生素A的浓度为4.0μg/mL，维生素E的浓度为80.0μg/mL；将混合液用90％甲醇进行稀释，得到含有0.03125μg/mL-4.0μg/mL维生素A、0.625μg/mL-80μg/mL维生素E的系列标曲中间液G，临用前配制。
维生素A校正液的配制：
取标准品母液一支，室温下避光放置30min，平衡至室温；吸取标准品母液84μL，用乙醇稀释至3mL，混匀；在325nm波长下测定吸光值，结合标准比吸光系数按照公式(1)(2)计算出标准溶液的实际浓度，避光操作。采用以下公式(1)(2)计算：
CX＝A/E×稀释倍数 (1)
稀释倍数＝10000×3mL/84μL (2)
式中：CX—待标定的标准溶液的实际浓度值，单位为g/100mL；
A—325nm处测定的待标定标准溶液的吸光度平均值；
E—维生素A的1％比吸光系数＝1835。
维生素A标准品校正液现用现配，无需保存。
维生素E校正液的配制：
取标准品母液一支，室温下避光放置30min，平衡至室温；吸取标准品母液75μL，置5mL容量瓶中，用乙醇定容，混匀；在292nm波长下测定吸光值，结合标准比吸光系数按照公式(3)(4)计算出标准溶液的实际浓度，避光操作。采用以下公式(3)(4)计算：
CX＝A/E×稀释倍数 (3)
稀释倍数＝10000×5mL/75μL (4)
式中：CX—待标定的标准溶液的实际浓度值，单位为g/100mL；
A—292nm处测定的待标定标准溶液的吸光度平均值；
E—维生素E的1％比吸光系数＝76。
维生素E标准品校正液，现用现配，无需保存。
标准工作液H：取适量步骤(a)中标准储备液B、标准储备液C，标准储备液D，标准储备液F，用90％的甲醇水溶液进行稀释混合，得到含有3.9ng/mL-500ng/mL25-羟基维生素D2、12.5ng/mL-1600ng/mL25-羟基维生素D3、0.5-1000ng/mL维生素K1、0.5-1000ng/mL维生素K2的系列标曲混合中间液H，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。
(c)内标储备液的配制
内标储备液I：取维生素A-d3标准品10mg置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解，并定容于10mL，得到内标储备液I，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。
内标储备液J：选购25-羟基维生素D2-d3标准品溶液(100μg/mL)，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。
内标储备液K：取25-羟基维生素D3-d6标准品0.5mg置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解，并定容于10mL，得到内标储备液K，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。
内标储备液L：取维生素E-d6标准品1mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液L，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。
内标储备液M：取维生素K1-d7标准品1mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液M，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。
内标储备液N：取维生素K2(MK4)-d7标准品0.25mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液N，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。
(d)混合内标工作液的配制
取适量步骤(c)中内标储备液I、内标储备液J、内标储备液K、内标储备液L、内标储备液M、内标储备液N，用90％的甲醇水溶液进行稀释，得到含维生素A-d3 4μg/mL、25-羟基维生素D2-d3 100ng/mL、25-羟基维生素D3-d6 350ng/mL、维生素E-d6 33μg/mL、维生素K1-d7 30ng/mL、维生素K2-d7 30ng/mL的混合内标工作液，-80℃保存，避光，有效期3个月。
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。
(三)待测样品处理
(e)用移液枪移取10μL步骤(d)的内标工作液于2mL的离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清或血浆，再加入200μL无水乙醇，在1500rpm的转速下涡旋混合3min后，加入1000μL正己烷，在1500rpm的转速下涡旋混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取上清液900μL至干净的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干，移取乙腈90μL至上清吹干的1.5mL离心管中，在1500rpm的转速下涡旋混合1min后，再移取纯水10μL，在1500rpm的转速下涡旋混合1min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取90μL即为待测样品。
(四)待测样品的检测
使用高效液相串联质谱仪对上述步骤(e)待测样品进行检测，同时得到上述待测样品的色谱图。从该色谱图中可以得到维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2(MK4)色谱峰面积及其内标物色谱峰面积。将各种维生素色谱峰面积与相应内标物色谱峰面积的比值y1、y2、y3、y4、y5、y6代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待测样品中各种维生素与其内标物的浓度比值x1、x2、x3、x4、x5、x6。由于各个内标物在混合内标工作液中的浓度是已知的，由此可计算得到该待测样品中各种维生素的浓度。当然，待测样品中维生素的浓度，即为待检测血液中维生素的浓度。
液相条件为：色谱柱：安捷伦公司的Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50×3.0mm2.7um)；梯度洗脱：流动相为含体积比为0.2％甲酸的甲醇水溶液，甲醇与水的体积比为85：15，和含体积比为0.2％甲酸的甲醇乙腈溶液，甲醇与乙腈的体积比为3：1；分析时间：8.0min；柱温：30℃；进样量：20ul；流速：0.6mL/min。
串联质谱条件为：采用大气压化学电离源APCI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，温度300℃，气帘气压力20psi；碰撞气5μL/min；离子喷雾电压5500V；雾化气压力25psi。
此外，串联质谱条件还包括下述表2所示内容。
表2
物质名称 保留时间/min 母离子 子离子 DP EP CE CXP
VA 2.54 269.2 213.2 70 10 20 7
VA-IS 2.54 272.2 216.2 70 10 20 7
VD2 2.25 413.1 337.2 40 8 15 11
VD2-IS 2.25 416.1 340.2 40 8 15 11
VD3 2.07 401.3 365.2 40 8 17 14
VD3-IS 2.07 407.3 371.2 40 8 17 14
VE 5.25 431.4 165.1 70 10 25 10
VE-IS 5.25 437.4 171.1 70 10 25 10
VK1 6.25 451.2 187 65 11 32 10
VK1-IS 6.26 458.2 194 65 11 32 10
VK2 4.85 445.2 187.1 60 5 27 7
VK2-IS 4.85 452.2 194.1 70 10 20 7
表2中，VA表示维生素A，VD2表示25-羟基维生素D2，VD3表示25-羟基维生素D3，VE表示维生素E，VK1表示维生素K1，VK2表示维生素K2，-IS表示对应维生素的同位素。
本实施例中技术方法论证如下：
一、本发明实施例的线性关系和定量限
制备不同来源的血清样本，分别加入10μl混合内标工作液，按本发明实施例前处理及测定条件进行测定，以定量离子色谱峰面积—浓度作图，得到标准曲线。结果表明，6种维生素的线性范围和定量限如下：
维生素A：
检测限：0.00011μg/mL；定量限：0.00033μg/mL；线性范围：维生素A在0.014μg/mL到1.8μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
25-羟基维生素D2
检测限：0.12ng/mL；定量限：0.363ng/mL；线性范围：25-羟基维生素D2在0.39ng/mL到50ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
25-羟基维生素D3
检测限：0.20ng/mL；定量限：0.65ng/mL；线性范围：25-羟基维生素D3在1.25ng/mL到160ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
维生素E
检测限：0.058μg/mL；定量限：0.174μg/mL；线性范围：维生素E在0.28μg/mL到36μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
维生素K1
检测限：0.017ng/mL；定量限：0.05ng/mL；线性范围：维生素K1(MK4)在0.05ng/mL到100ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
维生素K2(MK4)
检测限：0.017ng/mL；定量限：0.05ng/mL；线性范围：维生素K2(MK4)在0.05ng/mL到100ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
二、本发明实施例的回收率和精密度
分别取6种维生素的标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，6种维生素的回收率和精密度分别如下述表3。6种维生素在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为94.1％～103.8％。
综合上述验证试验，本发明实施例的回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，可同时检测血液中6种维生素，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。
请参考图8至图31可知，血清样本中各种维生素的保留时间与其标准工作溶液一致。该方法以同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
表3
综上所述，本发明的实施例具有至少如下有益效果：
1、本发明实施例中，将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，使干扰因素大大减少，且特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，同时分析时间缩短。
2、本发明实施例中，以同位素标记物为内标物，使目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个〃....〃”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种同时检测血液中多种脂溶性维生素含量的方法，其特征在于，包括：
利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测N个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的至少两种脂溶性维生素及其内标物，不同标准溶液中同一脂溶性维生素的浓度不同，且N≥3；
以标准溶液中，一脂溶性维生素的浓度与其内标物的浓度的比值为一二维坐标，以及以该标准溶液的色谱图中，该脂溶性维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值为另一二维坐标，拟合得到该脂溶性维生素的标准曲线方程，从而得到各种脂溶性维生素的标准曲线方程；
处理待检测血液得到血液样品；
将一定量的含有浓度已知的至少两种内标物的混合内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品；
利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样品，得到所述待测样品的色谱图；
将所述待测样品的色谱图中，一脂溶性维生素的峰面积与其内标物的峰面积的比值，代入到该脂溶性维生素的标准曲线方程中，并根据所添加的其内标物的浓度，计算出所述待检测血液中该脂溶性维生素的含量，从而得到所述待检测血液中各种脂溶性维生素的含量；
其中，第i种脂溶性维生素的标准曲线方程为：yi＝ki×xi+bi，其中，yi表征峰面积比值，xi表征浓度比值，ki和bi均表征系数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述检测条件包括：液相条件和串联质谱条件；
其中，所述液相条件包括：色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm，流动相为含体积比为0.05％-0.25％甲酸的甲醇水溶液和含体积比为0.05％-0.25％甲酸的甲醇乙腈溶液，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为85：15，甲醇乙腈溶液中甲醇与乙腈的体积比为3：1，分析时间为8.0min，柱温为25℃-33℃，进样量为10μL-30μL，流速为0.55mL/min-0.65mL/min；
其中，所述串联质谱条件包括：采用大气压化学电离源APCI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，温度为300℃，气帘气压力为20psi，碰撞气流速为5μL/min，离子喷雾电压为5500V，雾化气压力为25psi。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述液相条件还包括：Poroshell 120 EC-C18色谱柱；
和/或，
所述液相条件包括：柱温为30℃；
和/或，
所述液相条件包括：流速为0.6mL/min；
洗脱过程为：甲醇水溶液和甲醇乙腈溶液的百分用量比，在3.1min-6.5min的洗脱时间范围内为0：100，在其他洗脱时间范围内为100：0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述至少两种脂溶性维生素包括：维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2中的至少两种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D2时，所述N个标准溶液中25-羟基维生素D2的浓度包括：3.906ng/mL、7.8125ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL中的至少三个；
和/或，
所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D3时，所述N个标准溶液中25-羟基维生素D3的浓度包括：12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL中的至少三个；
和/或，
所述至少两种脂溶性维生素包括维生素K1时，所述N个标准溶液中维生素K1的浓度包括：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL中的至少三个；
和/或，
所述至少两种脂溶性维生素包括维生素K2时，所述N个标准溶液中维生素K2的浓度包括：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL中的至少三个。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述将一定量的含有浓度已知的至少两种内标物的混合内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品，包括：
用移液枪移取一定量的含有浓度已知的至少两种内标物的混合内标工作液，置于离心管中，再加入50μL-300μL所述血液样品，再加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合2min-5min；
涡旋混合后在离心管中加入一定量的萃取试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合3min-10min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min；
移取一定量离心后的上清液至离心管中，并转移至氮气吹干装置上以将上清液吹干；
对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min，得到待测样品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3，且不包括维生素K1和/或维生素K2时，所述对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，包括：移取一定量的乙腈水溶液至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min；
或，
所述至少两种脂溶性维生素包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3，且包括维生素K1和/或维生素K2时，所述对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，包括：移取一定量的乙腈至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min，再移取一定量的纯水至离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min；
或，
所述至少两种脂溶性维生素不包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3时，所述对上清液吹干的离心管中的物质进行复溶处理，包括：移取一定量的乙腈至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述内标工作液的移取量为10μL；
和/或，
所述沉淀蛋白试剂为乙醇，乙醇的用量为100μL-500μL；
和/或，
所述萃取试剂为正己烷，正己烷的用量为800μL-1200μL。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述至少两种脂溶性维生素的种类数为6；
在所述分别检测N个标准溶液之前，进一步包括：
利用移液器移取90μL第一标准工作液、10μL第二标准工作液和10μL所述混合内标工作液至离心管中，其中，第一标准工作液中含有浓度已知的维生素A和浓度已知的维生素E，第二标准工作液中含有浓度已知的25-羟基维生素D2、浓度已知的25-羟基维生素D3、浓度已知的维生素K1和浓度已知的维生素K2；
将该离心管在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混匀1min-2min后，移取上清液以得到标准溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
在所述得到标准溶液之前，进一步包括：
精确称取10mg的维生素A的标准品，并置于10mL容量瓶中，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第一标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
选购25-羟基维生素D2的浓度在10μg/mL-1000μg/mL之间的第三标准储备液；
选购25-羟基维生素D3的浓度在10μg/mL-1000μg/mL之间的第四标准储备液；
精确称取25mg的维生素E的标准品，并置于5mL容量瓶中，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第二标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
精确称取10mg的维生素K1的标准品，并置于10mL容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到第五标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
精确称取10mg的维生素K2的标准品，并置于10mL容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到第六标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
临用前测定所述第一标准储备液中维生素A的浓度、所述第二标准储备液中维生素E的浓度，然后根据所述第一标准储备液中维生素A的浓度和所述第二标准储备液中维生素E的浓度，取一定量的所述第一标准储备液于一定体积的容量瓶中，用无水乙醇进行稀释并定容，以得到第一校正工作液，并取一定量的所述第二标准储备液于一定体积的容量瓶中，用无水乙醇进行稀释并定容，以得到第二校正工作液，再取一定量的所述第一校正工作液和一定量的所述第二校正工作液于一定体积的容量瓶中，用90％甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述第一标准工作液，且所述第一标准工作液中维生素A的浓度介于0.03125μg/mL-4.0μg/mL之间，维生素E的浓度介于0.625μg/mL-80μg/mL之间；
取一定量的所述第三标准储备液、一定量的所述第四标准储备液、一定量的所述第五标准储备液、一定量的所述第六标准储备液置于一定体积的容量瓶中，用90％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述第二标准工作液，且所述第二标准工作液中25-羟基维生素D2的浓度介于3.9ng/mL-500ng/mL之间，25-羟基维生素D3的浓度介于12.5ng/mL-1600ng/mL之间，维生素K1的浓度介于0.5ng/mL-1000ng/mL之间，维生素K2的浓度介于0.5ng/mL-1000ng/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月；
取10mg维生素A的内标物，该内标物为维生素A的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第一内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
选购25-羟基维生素D2的内标物的浓度为100μg/mL为第三内标储备液，该内标物为25-羟基维生素D2的同位素内标物，且浓度为100μg/mL，并在-80℃下保存，有效期为1年；
取0.5mg25-羟基维生素D3的内标物，该内标物为25-羟基维生素D3的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解并定容，以得到第四内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；
取1mg维生素E的内标物，该内标物为维生素E的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第二内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；
取1mg维生素K1的内标物，该内标物为维生素K1的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第五内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；
取0.25mg维生素K2的内标物，该内标物为维生素K2的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到第六内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；
取一定量的所述第一内标储备液、一定量的所述第二内标储备液、一定量的所述第三内标储备液、一定量的所述第四内标储备液、一定量的所述第五内标储备液、一定量的所述第六内标储备液置于一定体积的容量瓶中，用90％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述混合内标工作液，且所述混合内标工作液中维生素A的同位素的浓度为4μg/mL，25-羟基维生素D2的同位素的浓度为100ng/mL，25-羟基维生素D3的同位素的浓度为350ng/mL，维生素E的同位素的浓度为33μg/mL，维生素K1的同位素的浓度为30ng/mL，维生素K2的同位素的浓度为30ng/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。
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