CN111999397A - 一种同时检测多种脂溶性维生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了脂溶性维生素检测技术领域，具体领域为一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其检测方法包括如下步骤：将10‑200μL样本血浆与蛋白质沉淀液、维生素氘代内标物100‑3000rpm震荡1‑5min充分混匀得溶液A，再将溶液A以200‑12000rpm于0‑8℃离心得上清液；步骤2：使用液质联用仪分析上清液的脂溶性维生素，通过内标法计算样本血浆的脂溶性维生素含量。本法检测的维生素种类较现有方法更多，本法可在不通过SLE、SPE等材料辅助下完成对样本进行富集，有效降低检测成本，本法所需血量较现有方法较少，同时样本血量减少又使患者尤其婴幼儿的依从性较好，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及脂溶性维生素检测技术领域，具体领域为一种同时检测血浆(清)6种脂溶性维生素的方法。
背景技术
维生素，分为脂溶性维生素和水溶性维生素两类，是维持人体生命活动必须的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质。维生素缺乏或过量均会导致营养性疾病的发生；
维生素A有促进生长、繁殖，维持骨骼、上皮组织、视力和粘膜上皮正常分泌等多种生理功能；维生素D又称抗佝偻病维生素，为固醇类衍生物，其家族成员中最重要的成员是25羟基-维生素D3(胆钙化醇)和25羟基-维生素D2(麦角钙化醇)，皆为脂溶性维生素，当其缺乏时，会产生维生素D缺乏症，主要表现为骨骼病变，同时伴有肌肉松弛，非特异性神经精神症状、生长迟缓，免疫力低下及相应的血浆生化改变，严重缺乏时，会形成抗维生素D佝偻病、软骨营养不良、老年人骨质疏松症等；维生素E有抗氧化的作用，能防止不饱和脂肪酸的自身氧化，因而有保护生物膜的功能，使生物膜中的不饱和脂肪酰不致于因氧化变硬，使膜遭到破坏，又能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加，使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产；维生素K对正常的血液凝结有重要作用,缺乏维生素K会出现血凝缓慢，甚至可导致大出血，同时其也具有明确的抗骨质疏松作用。
因此，检测人血浆(清)对于临床诊断具有重要意义。目前随着液相色谱和质谱技术的发展，基于液相色谱、液质联用方法检测维生素的方法随之出现，中国专利，公开号为：CN110763788A，公开了一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法，然而其需要的采血量高达0.25mL，这在临床采血环节，特别是对依从性较差的人群(婴幼儿)仍具有困难，且其前处理过程使用了SLE萃取板，明显增加检测成本；中国专利，公开号为：CN110927310A，公开了一种同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，该法只能够检测维生素D，局限性大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测血浆(清)6种脂溶性维生素的方法，本法能克服现有方法的不足，提升检测效率，减少检测的样本量，扩大检测方法可应用的范围，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其检测方法包括如下步骤：
步骤1：将10-200μL样本血浆与蛋白质沉淀液、维生素氘代内标物100-3000rpm震荡1-5min充分混匀得溶液A，再将溶液A以200-12000rpm于0-8℃离心得上清液，其中血浆的来源可以为足跟血、静脉血、指尖血、耳垂血中的一种或几种，且不为乳糜血或严重溶血的样本；
步骤2：使用液质联用仪分析上清液的脂溶性维生素，通过内标法即通过维生素与其氘代内标物的离子强度比值(纵轴)和二者的浓度之比(横轴)计算样本血浆(清)的脂溶性维生素含量。建立准确的标准回归曲线以供计算样本血液的维生素含量，其方法为：将血浆替换为含有三种或三种以上不同浓度视黄醇、α-生育酚、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素K1、维生素K2的标准品溶液，同法操作，对血液样本采用的余下方法与参数，对标准品溶液也完全一致而不发生任何变动。
优选的，步骤1中的蛋白质沉淀液与血浆的体积比为50:1-1:1。
优选的，蛋白质沉淀液可以为甲醇和甲酸水溶液、乙醇和甲酸水溶液、异丙醇和甲酸水溶液或乙腈和甲酸水溶液中的一种或几种混合物；
优选的，其中甲醇水溶液、乙醇水溶液、异丙醇水溶液和乙腈水溶液的体积分数均为50.0-100.0％，甲酸水溶液体积分数为0-1％。
优选的，步骤1中溶液A通过液-液萃取的方式进行富集纯化，液-液萃取的具体方法为：向溶液A中加入用于血浆的萃取溶剂，以200-3000rpm转速充分混匀1-10min，再以1000-20000rpm于0-8℃离心3-15min，吸取50-80％体积的萃取溶剂上清液，干燥，加入100-300μL复溶液，以200-3000rpm转速充分混匀1-5min。
优选的，萃取溶剂可以为体积分数为70.0-100.0％的乙酸乙酯的甲醇或乙醇溶液、体积分数为70.0-100.0％的环己烷的甲醇或乙醇溶液、体积分数为70.0-100.0％的二氯甲烷的甲醇或乙醇溶液、体积分数为70.0-100.0％的正己烷的甲醇或乙醇溶液中的一种。
优选的，复溶液可以为甲醇和甲酸水溶液、乙醇和甲酸水溶液或乙腈和甲酸水溶液中的一种或几种混合物。
优选的，其中甲醇水溶液、乙醇水溶液和乙腈水溶液的体积分数均为70.0-100.0％，甲酸水溶液体积分数为0-1％。
优选的，步骤1中的氘代内标为：视黄醇、α-生育酚、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素K1、维生素K2的氘代内标。
优选的，步骤2中的色谱条件为：流动相为含体积分数为0.01-0.2％甲酸、0-5.0mM甲酸铵的水(A相)和含体积分数为0.01-0.2％甲酸、0.5-5.0mM甲酸铵的甲醇(B相)，流速0.2-0.6mL/min：进样量1-20μL。
与现有技术相比本发明的有益效果是：一种同时检测多种脂溶性维生素的方法:
1、本法检测的维生素种类较现有方法更多。
2、本法可在不通过SLE、SPE等材料辅助下完成对样本进行富集，有效降低检测成本。
3、本法所需血量较现有方法较少，同时样本血量减少又使患者尤其婴幼儿的依从性较好，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中D3与D3-IS的MRM离子色谱图；
图2为本发明实施例1中K1、K2的标准品和K1、K2的内标的MRM离子色谱图；
图3为本发明实施例1中A与A-IS的MRM离子色谱图；
图4为本发明实施例1中D2与D2-IS的MRM离子色谱图；
图5为本发明实施例1中E与E-IS的MRM离子色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
步骤1：标准品溶液的配制：配制含视黄醇(VA)、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、α-生育酚(VE)和VK1、VK2的浓度分别为1000、40、160、11280、100ng/mL的混合标准溶液1mL，溶剂为色谱乙醇，将其标记为1#管，再准备8只试管，分别标记2#-9#，均加入200μL乙醇，从1#管中移取200μL溶液至2#管中，混匀后再移取200μL至3#，混匀后直至第9#管混匀完毕，得到9支不同浓度的标准品混合溶液。
步骤2：内标溶液的配制：配制含有d3-视黄醇、d6-α生育酚、d3-25-羟基维生素D2、d6-25-羟基维生素D3、d7-VK1、d7-K1、d7-K2浓度分别为3750、5000、25、25、833、208ng/mL的混合内标溶液，溶剂为色谱乙醇。
步骤3：前处理：用移液枪移取20μL的1#-9#标准品溶液于2.0mL塑料离心管中，依次加入20μL内标溶液，180μL蛋白沉淀液(甲醇：乙腈＝1：1，v/v)，2000rpm涡旋混匀2min，加入1200μL正己烷，以2000rpm震荡5min，再以4000rpm离心10min，取上清液1000μL到1.5mL塑料离心管中，氮气吹干，加入200μL含0.1％FA的乙腈，2000rpm涡旋混匀1min，以4000rpm离心10min，取100μL上清液装于液相小瓶等待进样。
色谱条件：
色谱柱：Agilent EC18 3.0*50mm,2.7Micron；流速：0.4mL/min；进样量：15μL；柱温：30℃；流动相：含0.1％(v/v)甲酸(A)的水；含0.1％(v/v)甲酸、1.0mM甲酸铵的甲醇(B)；线性梯度洗脱条件为：0min 80％B，2min时升至100％B，以100％B等度洗脱至4.1min，4.11min改为80％B，再等度洗脱至5min。
质谱条件：
扫描方式：MRM多反应监测参数如下(D3代表25-羟基维生素D3，D2代表25-羟基维生素D2，A代表视黄醇，E代表α-生育酚)
从0.7min将CTO.RVR由1切换至0(即将柱子洗脱液由输送至废液切换至离子源)开始采集MS数据，雾化气：3mL/min，加热气5mL/min，干燥气15mL/min，加热块温度500℃，DL温度：150℃，接口温度350℃。
实验结果：
6种维生素的各浓度标准品的峰面积、理论浓度、实际浓度及其相应内标物的峰面积、理论浓度如表所示。
使用内标法，即通过维生素与其氘代内标物的离子强度比值(纵轴)和二者的浓度之比(横轴)计算样本血浆(清)的脂溶性维生素含量。
因此，6种维生素的标准回归曲线分别为：
K1：y＝1.1694x+0.0058，R2＝0.9976
K2：y＝0.7582x-0.0105，R2＝0.9998
A：Y＝(12.7168)X+(0.206820)，R2＝0.9920
D2：Y＝(0.599755)X+(-0.00144604)，R2＝0.9923
D3:Y＝(0.753027)X+(0.0217980)，R2＝0.9947
E:Y＝(0.0904242)X+(0.0288287)，R2＝0.9917
实施例2
步骤1：血液样本的采集：使用带有促凝胶的黄盖采血管采集64名健康成人的静脉血，血液经4000rpm离心10min，得血清，将64人血清分别混合均匀，得混合血清，分装保存于-80℃。另取50mL混合血清，添加浓度为1000，20000，100，100，10，10ug/mL的维生素A，E，D2，D3，K1，K2溶液各32.5，32.5，10.35，20.5，0.5，0.5μL(即向每1mL混合血清添加了0.65，13，0.0207，0.04106，0.0001，0.0001ug的维生素A，E，D2，D3，K1，K2)，充分混匀，得标准添加血清，分装保存于-80℃。
步骤2：内标溶液的配制：配制含有d3-视黄醇、d6-α生育酚、d3-25-羟基维生素D2、d6-25-羟基维生素D3、d7-VK1、d7-K1、d7-K2浓度分别为3750、5000、25、25、833、208ng/mL的混合内标溶液，溶剂为色谱乙醇。
步骤3：前处理：取2.0mL塑料离心管，依次加入20μL的血清，20μL内标溶液，180μL蛋白沉淀液(甲醇：乙腈＝1：1，v/v)，2000rpm涡旋混匀2min。加入1200μL正己烷，于以2000rpm震荡5min，再4000rpm离心10min，取上清液1000μL到1.5mL塑料离心管中，氮气吹干，加入200μL含0.1％FA的乙腈，2000rpm涡旋混匀1min，4000rpm离心10min，取100μL上清液装于液相小瓶等待进样。
色谱条件：
色谱柱：Agilent EC18 3.0*50mm,2.7Micron；流速：0.4mL/min；进样量：15μL；柱温：30℃；流动相：含体积分数为0.1％甲酸的水；含体积分数为0.1％甲酸、1.0mM甲酸铵的甲醇(B)；线性梯度洗脱条件为：0min 80％B，2min时升至100％B，以100％B等度洗脱至4.1min，4.11min改为80％B，再等度洗脱至5min。
质谱条件：
扫描方式：MRM多反应监测参数如下(D3代表25-羟基维生素D3，D2代表25-羟基维生素D2，A代表视黄醇，E代表α-生育酚)
从0.7min将CTO.RVR由1切换至0(即将柱子洗脱液由输送至废液切换至离子源)开始采集MS数据，雾化气：3mL/min，加热气5mL/min，干燥气15mL/min，加热块温度500℃，DL温度：150℃，接口温度350℃。
实验结果：
精密度实验
混合血清维生素K1、K2检测结果如下表所示：
混合血清维生素A和E的检测结果如下：
混合血清维生素D2和D3检测结果如下：
加标回收率实验
混合加标血清维生素K1、K2检测结果如下表所示：
混合加标血清维生素A和E的检测结果如下表所示：
混合加标血清维生素D2和D3的检测结果如下表所示：
加标回收率
使用加标回收率来检验方法的准确性
综上，本法精密度小于8.5％，回收率87.4-106.7％，具有较稳定的精密度与准确度。
实际临床样品的检测
检测8例0-30月龄的婴幼儿的维生素含量，结果如下表。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：其检测方法包括如下步骤：
步骤1：将10-200μL样本血浆与蛋白质沉淀液、维生素氘代内标物100-3000rpm震荡1-5min充分混匀得溶液A，再将溶液A以200-12000rpm于0-8℃离心得上清液；
步骤2：使用液质联用仪分析上清液的脂溶性维生素，通过内标法，将维生素与其氘代内标物的离子强度比值作为纵轴和二者的浓度之比作为横轴计算样本血浆的脂溶性维生素含量。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：步骤1中的蛋白质沉淀液与血浆的体积比为50:1-1:1。
3.根据权利要求2所述的一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：蛋白质沉淀液可以为甲醇和甲酸水溶液、乙醇和甲酸水溶液、异丙醇和甲酸水溶液或乙腈和甲酸水溶液中的一种或几种混合物。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：其中甲醇水溶液、乙醇水溶液、异丙醇水溶液和乙腈水溶液的体积分数均为50.0-100.0％，甲酸水溶液体积分数为0-1％。
5.根据权利要求1所述的一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：步骤1中溶液A通过液-液萃取的方式进行富集纯化，液-液萃取的具体方法为：向溶液A中加入用于血浆的萃取溶剂，以200-3000rpm转速充分混匀1-10min，再以1000-20000rpm于0-8℃离心3-15min，吸取50-80％体积的萃取溶剂上清液，干燥，加入100-300μL复溶液，以200-3000rpm转速充分混匀1-5min。
6.根据权利要求5所述的一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：萃取溶剂可以为体积分数为70.0-100.0％的乙酸乙酯的甲醇或乙醇溶液、体积分数为70.0-100.0％的环己烷的甲醇或乙醇溶液、体积分数为70.0-100.0％的二氯甲烷的甲醇或乙醇溶液、体积分数为70.0-100.0％的正己烷的甲醇或乙醇溶液中的一种。
7.根据权利要求5所述的一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：复溶液可以为甲醇和甲酸水溶液、乙醇和甲酸水溶液或乙腈和甲酸水溶液中的一种或几种混合物。
8.根据权利要求7所述的一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：其中甲醇水溶液、乙醇水溶液和乙腈水溶液的体积分数均为70.0-100.0％，甲酸水溶液体积分数为0-1％。
9.根据权利要求1所述的一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：步骤1中的氘代内标为：视黄醇、α-生育酚、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素K1、维生素K2的氘代内标。
10.根据权利要求1所述的一种同时检测多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：步骤2中的色谱条件为：流动相为含体积分数为0.01-0.2％甲酸、0-5.0mM甲酸铵的水(A相)和含体积分数为0.01-0.2％甲酸、0.5-5.0mM甲酸铵的甲醇(B相)，流速0.2-0.6mL/min：进样量1-20μL。
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