CN117554534A - 一种脂溶性维生素的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种脂溶性维生素的检测方法及试剂盒。检测方法包括：将样本与蛋白沉淀剂混合，离心后取上清液，采用液相色谱‑串联质谱法进行检测；蛋白沉淀剂包括甲醇、乙腈和二氯甲烷的混合液。本发明提供了一种通过蛋白沉淀法同时测定多种脂溶性维生素的试剂盒及检测方法，前处理方法简单，准确度高，该方法能满足相关法规对维生素A、25‑OHD2、25‑OHD3、维生素E、维生素K1的线性、重复性、批间差、准确度等的要求，对评估血清脂溶性维生素含量具有重要参考意义。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种脂溶性维生素的检测方法及试剂盒。
背景技术
维生素(Vitamin)是维持人体健康的必需微量元素，其以酶或辅酶的形式参与人体新陈代谢过程，调节人体的生长、发育。维生素A（VA）、25-OHD2（25羟基维生素D2）、25-OHD3（25羟基维生素D3）、维生素E（VE）、维生素K1（VK1）是脂溶性维生素，因人体不能合成或合成的维生素极其微量，只能从食物中摄取。脂溶性维生素摄取不足或缺乏，易导致人体生理机能、新陈代谢、细胞调节等障碍，诱发多种疾病。一般而言，成人均衡膳食无需额外补充脂溶性维生素，但特殊人群如孕妇、老年人、骨质疏松患者以及儿童普遍缺乏维生素，若盲目补充大量，易蓄积致中毒。如早期妊娠妇女摄取大量维生素A增加婴儿出生缺陷风险。对于存在营养吸收障碍者、有肝脏疾病者以及炎症性肠病者或生长迟缓儿童，应常规监测脂溶性维生素的浓度。对于这些特殊人群者，通常每6个月监测1次，具体监测频率取决于疾病的严重程度。故科学、精准的检测人体脂溶性维生素含量，可准确评估、筛查脂溶性维生素的异常状态，针对性进行个体化调整补充，提高维生素治疗的安全性和有效性。
现有技术中，有关脂溶性维生素的检测方法及试剂盒较多，但基本都是以液液萃取或者SPE进行前处理，使得前处理过程复杂、耗时较多，且大幅增加检测的成本。
因此，如何提供一种前处理方法简单、且能够同时准确测定五种脂溶性维生素的检测方法以及配套使用的试剂盒，是本领域亟需解决的技术难题。
发明内容
基于此，本发明提供了一种通过蛋白沉淀法进行前处理，然后联合液相色谱-串联质谱法实现对五种脂溶性维生素准确检测的方法，具体发明内容如下。
首先，本发明提供了一种脂溶性维生素的检测方法，包括：
将样本与蛋白沉淀剂混合，离心后取上清液，采用液相色谱-串联质谱法进行检测；
所述蛋白沉淀剂包括甲醇、乙腈和二氯甲烷的混合液；
液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱；
流动相A为甲酸水溶液；流动相B为甲酸甲醇溶液；其中，流动相A中甲酸与水的体积比为（0.15~0.3）：100，流动相B中甲酸与甲醇的体积比为（0.15~0.3）：100；
梯度洗脱程序如下：
所有时间段流动相A和流动相B的体积百分比之和为100%。
本发明通过对大量蛋白沉淀剂的筛选后，发现选择甲醇、乙腈和二氯甲烷组成的蛋白沉淀剂能够同时对多种脂溶性维生素（维生素A、25-OHD2、25-OHD3、维生素E、维生素K1）实现较好的蛋白沉淀效果，使得这些脂溶性维生素的提取效率获得兼顾，通过一步蛋白沉淀后均达到较高的提取效果，有利于后续采用液相色谱-串联质谱法检测。
进一步，本发明针对上述蛋白沉淀剂前处理后的样本，对液相色谱的条件进行适配研究，发现在上述液相色谱的条件下才能够实现对多种脂溶性维生素的精准检测，使得蛋白沉淀法联合液相色谱-串联质谱法检测脂溶性维生素满足线性、重复性、批间差、准确度等方法学的各项要求。
更优选地，流动相A中甲酸与水的体积比为（0.15~0.25）：100，流动相B中甲酸与甲醇的体积比为（0.15~0.25）：100。
最优选地，流动相A中甲酸与水的体积比为0.2：100，流动相B中甲酸与甲醇的体积比为0.2：100。
优选地，甲醇、乙腈和二氯甲烷的体积比为（70~80）：（10~20）：（5~15）。
优选地，甲醇、乙腈和二氯甲烷的体积比为（72~78）：（12~18）：（8~12）。
在上述配比下，对多种脂溶性维生素的同时提取效果更好。
优选地，梯度洗脱的流速为0.6~1 mL/min。
优选地，色谱柱为C18柱，其规格为2.6 μm，30×3mm；
更优选地，色谱柱采用Kinetex 2.6μm C18，30×3 mm。
优选地，色谱柱的柱温为35~45℃。
优选地，所述检测方法还包括：将样本与蛋白沉淀剂以及内标物混合，离心后取上清液，采用液相色谱-串联质谱法进行检测。
优选地，所述样本包括待测样本、质控品、标准品中的至少一种。
优选地，所述待测样本为血清。
优选地，所述脂溶性维生素为维生素A、25-OHD2、25-OHD3、维生素E、维生素K1中的至少一种。
优选地，所述样本与蛋白沉淀剂的体积比为1：（4~6）。
优选地，将样本与蛋白沉淀剂混合，振荡提取，离心后取上清液。
优选地，在1500rpm以上振荡提取5 min以上。
优选地，在12000 rpm以上离心10 min以上后取上清液。
进一步，本发明提供了实现上述任一检测方法的试剂盒，包括如下组分：
校准品C1~C6，质控品1~3，内标浓储液，蛋白沉淀剂以及流动相添加剂；其中，
校准品C1~C6中维生素A的浓度依次为：40~80 ng/mL、100~140 ng/mL、200~300ng/mL、500~700 ng/mL、1000~1500 ng/mL、2000~2500 ng/mL；
校准品C1~C6中25-OHD2的浓度依次为：1~2.5 ng/mL、3~5 ng/mL、6~10 ng/mL、15~25 ng/mL、35~45 ng/mL、60~85 ng/mL；
校准品C1~C6中25-OHD3的浓度依次为：2~5 ng/mL、6~10 ng/mL、12~18 ng/mL、35~45 ng/mL、75~85 ng/mL、150~165 ng/mL；
校准品C1~C6中维生素E的浓度依次为：600~1000 ng/mL、1500~2000 ng/mL、3000~3500 ng/mL、7500~8500 ng/mL、15000~18000 ng/mL、30000~35000 ng/mL；
校准品C1~C6中维生素K1的浓度依次为：0.1~0.25 ng/mL、0.3~0.5 ng/mL、0.6~1ng/mL、1.5~2.5 ng/mL、3.5~5 ng/mL、6~8.5 ng/mL；
质控品1~3中维生素A的浓度依次为：100~200 ng/mL、800~1000 ng/mL、1500~2000ng/mL；
质控品1~3中25-OHD2的浓度依次为：2~10 ng/mL、25~40 ng/mL、50~65 ng/mL；
质控品1~3中25-OHD3的浓度依次为：8~15 ng/mL、50~70 ng/mL、100~125 ng/mL；
质控品1~3中维生素E的浓度依次为：1500~2500 ng/mL、10000~15000 ng/mL、20000~25000 ng/mL；
质控品1~3中维生素K1的浓度依次为：0.2~1 ng/mL、2~4 ng/mL、5~7 ng/mL；
内标浓储液中包括：浓度为8000~12000 ng/mL的维生素A-d6、浓度为500~800 ng/mL的25-OHD2-d3、浓度为800~1200 ng/mL的25-OHD3-d6、浓度为8000~12000 ng/mL的维生素E-d6、浓度为30~50 ng/mL的维生素K1-d7；
蛋白沉淀剂中包括甲醇、乙腈和二氯甲烷；
流动相添加剂为甲酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种通过蛋白沉淀法同时测定多种脂溶性维生素的试剂盒及检测方法，前处理方法简单，准确度高，该方法能满足相关法规对维生素A、25-OHD2、25-OHD3、维生素E、维生素K1的线性、重复性、批间差、准确度等的要求，对评估血清脂溶性维生素含量具有重要参考意义。
附图说明
图1是实施例检测方法检测维生素A的液相色谱图。
图2是实施例检测方法检测25-OHD2的液相色谱图。
图3是实施例检测方法检测25-OHD3的液相色谱图。
图4是实施例检测方法检测维生素E的液相色谱图。
图5是实施例检测方法检测维生素K1的液相色谱图。
图6是对比例2检测方法检测25-OHVD2的液相色谱图。
图7是对比例2检测方法检测25-OHVD2的液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
由于无本底的人源样本难以获得，下述实施例采用牛血清白蛋白作为人体的替代基质配制标准曲线的各个浓度点及质控。
实施例
本实施例提供了一种脂溶性维生素的检测方法以及配套使用的试剂盒。
试剂盒主要包括的试剂如表1所示。
表1
进一步，本实施例提供了采用上述试剂盒定量检测血清中脂溶性维生素的检测方法，步骤包括：
1、配制流动相试剂
流动相A：用量筒准确移取1000 mL水，加入2mL甲酸后过滤并超声脱气，待用；
流动相B：用量筒准确移取1000 mL甲醇，加入2mL甲酸混匀后过滤并超声脱气，待用；
洗针液配制：用量筒准确移取400 mL甲醇，100 mL水混匀后过滤并超声脱气，待用。
2、前处理以及液相色谱-串联质谱法检测
（1）检测前溶液准备
a)样品制备：将待测样本取出，恢复至室温，所有校准品和质控品精确加入0.8mL纯化水，待组分充分溶解后涡旋混匀；
b)样本萃取液制备：将蛋白沉淀剂和内标取出，恢复至室温，加入1.65mL内标浓储液于蛋白沉淀剂，混匀待用；
（2）上机样本制备
化合物提取：校准品、质控品和待测样本各取50 μL至2 mL离心管，加入250μL样本萃取液，1500 rpm振荡提取5 min；
离心：14000 rpm下离心10 min；取上层200 μL至洁净96孔V型板中；
上机检测：4000 rpm离心3 min，上机检测；
液相色谱-串联质谱的仪器品牌和型号为AB 4500。
（3）液相色谱以及质谱条件
液相色谱条件：
色谱柱：Kinetex 2.6μm C18，30×3 mm；
柱温：40℃；
进样体积：40μL；
样本管理器温度：5℃；
梯度洗脱条件如表2所示。
表2
质谱条件:
离子源参数如表3所示，离子信息如表4所示。
表3
表4
标注星号为定量离子。
待测样本的维生素A的液相色谱图如图1所示，25-OHD2的液相色谱图如图2所示，25-OHD3的液相色谱图如图3所示，维生素E的液相色谱图如图4所示，维生素K1的液相色谱图如图5所示。
3、线性范围评价
3.1、验证方法：按照上述处理方法处理待测产品校准品C1~C6溶液，每个浓度重复测试3次，参考公式计算线性回归的相关系数r，相关系数r应≥0.990。
r：线性回归相关系数；
xi：C1~C6的浓度；
yi：对应浓度溶液中校准品与其内标的峰面积比值均值。
3.2、接受标准：维生素A、25-OHD2、25-OHD3、维生素E、维生素K1回归的相关系数r均≥0.990。
3.3、实验结果
线性范围：维生素A线性范围60-2400ng/mL（表5），25-OHD2线性范围2-80 ng/mL（表6），25-OHD3线性范围4-160 ng/mL（表7），维生素E线性范围800-32000 ng/mL（表8），维生素K1线性范围0.2-8 ng/mL（表9）。
3.4、结论：维生素A、25-OHD2、25-OHD3、维生素E、维生素K1回归的相关系数r均≥0.990，满足接受标准。
表5
表6
表7
表8
表9
4、重复性评价
4.1、验证方法：按照上述检测方法处理产品校准品C1~C6溶液及质控品，取实际人源样本测试本底作为低值，加入高浓度标样的样本作为高值，每个样本重复测定5次，分三批测试，参考公式计算重复性的变异系数（CV）。
CV：重复性的变异系数；
：5次测量结果的平均值；
S：5次测量结果的标准差。
4.2、接受标准：低值质控品的变异系数CV≤15%，高值质控品的变异系数CV≤15%。
4.3、实验结果：
25-OHD2、25-OHD3、维生素A、维生素E、维生素K1的批内批间精密度测试结果依次如表10~表14所示。
表10
表11
表12
表13
表14
4.4、结论：低值质控品的变异系数CV≤15%，高值质控品的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
5、基质效应评价
5.1、实验流程
通过相对基质效应评价内源性化合物的基质效应。选取目标分析物的溶剂样本（A，BSA）、血清基质样本（B，HS）以及二者的1∶1混合液（C），分别处理后进样分析。如果1∶1混合液样本的响应值与生物基质样本和替代基质样本响应值的均值相比，差异低于20%，则证明基质效应是否存在并不影响目标分析物的准确定量。
5.2、接受标准
基质偏差（%）=（A+B/2）/C，相对基质0.8~1.2。
5.3、实验结果
25-OHD2、25-OHD3、维生素A、维生素E、维生素K1的基质效应实验结果依次如表15~表19所示。
表15
表16
表17
表18
表19
5.4、结论
1∶1混合液样本的响应值与生物基质样本和替代基质样本响应值的均值相比，差异范围为-5.81%~7.44%，基质效应不影响最终的准确定量分析，基质效应考察满足方法学评价要求。
6、准确度
6.1试验过程
准确度采用加标回收实验评价，通过在血清样品中加入不同浓度标准溶液，每个浓度平行制备6份。根据收集临床正常血清样品中脂溶性维生素的本底浓度水平，分别添加3个浓度水平的标准溶液，通过加标浓度与加标实测浓度计算回收率，评价准确度。
6.2接受标准
回收率：85%-115%。
6.3、实验结果
25-OHD2、25-OHD3、维生素A、维生素E、维生素K1的加标回收测试结果依次如表20~表24所示。
表20
表21
表22
表23
表24
6.4、结论
所有结果满足准确度在标示值的±15％以内，满足要求。
综上所述，本实施例的检测方法一次检测可同时得到五种脂溶性维生素的含量，具有灵敏度高，重复性好，准确性高，特异性好等特点。该检测方法维生素A线性范围60-2400ng/mL，25-OHD2线性范围2-80ng/mL，25-OHD3线性范围4-160ng/mL，维生素E线性范围800-32000ng/mL，维生素K1线性范围0.2-8ng/mL。相关系数均r≥ 0.990；低值质控品重复性的变异系数（CV）≤ 15%，高值质控品重复性的变异系数（CV）≤ 15%；基质效应差异范围为-5.81%~7.44%，加标回收率为85%~115%。
对比例1
本对比例提供了一种脂溶性维生素的检测方法，步骤仅与实施例不同的是：
将二氯甲烷分别替换为等体积的异丁醇、乙酸乙酯以及叔丁醇。
液相色谱检测实施例校准品C1中25-OHVD2结果如表25所示。
表25
结果表明，在五种脂溶性维生素中，25-OHVD2响应低，无法满足液相色谱检测要求，说明选择其它蛋白沉淀剂时，对25-OHVD2的提取效率差。
对比例2
本对比例提供了一种脂溶性维生素的检测方法，步骤仅与实施例不同的是：
洗脱条件中，将流动相起始（0~0.3min）流动相B的体积百分比由50%分别调整为75%和65%。
实施例校准品C1中25-OHVD2的液相色谱图分别如图6（75%）和图7（65%）所示。
结果发现，在高甲醇比例的起始流动相条件下，25-OHVD2的峰形明显分叉。
对比例3
本对比例提供了一种脂溶性维生素的检测方法，步骤仅与实施例不同的是：
蛋白沉淀剂采用甲醇和乙腈体积比1:1混合液。
液相色谱检测实施例校准品C1中25-OHVD2和VK1结果如表26所示。
表26
实验结果表明，使用甲醇/乙腈体积比1：1混合液作为蛋白沉淀剂时，25-OHVD2和VK1的峰面积显著低于实施例的蛋白沉淀剂。
对比例4
本对比例提供了一种脂溶性维生素的检测方法，步骤仅与实施例不同的是：
将流动相A和B中的添加剂0.2%甲酸分别替换为0.1%甲酸，0.3%甲酸（%表示甲酸与水或甲酸与甲醇的体积比）。
液相色谱检测实施例校准品C1中VK1结果如表27所示。
表27
结果表明，甲酸含量增加VK1的响应增加了1倍，考虑到高含量的酸会缩短色谱柱的寿命，流动相A和B中优选为0.2%甲酸。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种脂溶性维生素的检测方法，其特征在于，包括：
将样本与蛋白沉淀剂混合，离心后取上清液，采用液相色谱-串联质谱法进行检测；
所述蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈和二氯甲烷的混合液；
液相色谱的条件包括：
色谱柱为C18柱；
流动相A为甲酸水溶液；流动相B为甲酸甲醇溶液；其中，流动相A中甲酸与水的体积比为（0.15~0.3）：100，流动相B中甲酸与甲醇的体积比为（0.15~0.3）：100；
梯度洗脱程序如下：
；
所有时间段流动相A和流动相B的体积百分比之和为100%；
所述脂溶性维生素为维生素A、25-OHD2、25-OHD3、维生素E和维生素K1。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，甲醇、乙腈和二氯甲烷的体积比为（70~80）：（10~20）：（5~15）。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，甲醇、乙腈和二氯甲烷的体积比为（72~78）：（12~18）：（8~12）。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，梯度洗脱的流速为0.6~1 mL/min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括：将样本与蛋白沉淀剂以及内标物混合，离心后取上清液，采用液相色谱-串联质谱法进行检测。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样本包括待测样本、质控品、标准品中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本为血清。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样本与蛋白沉淀剂的体积比为1：（4~6）。
9.一种实现权利要求1~8中任一项所述检测方法的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：
校准品C1~C6，质控品1~3，内标浓储液，蛋白沉淀剂以及流动相添加剂；其中，
校准品C1~C6中维生素A的浓度依次为：40~80 ng/mL、100~140 ng/mL、200~300 ng/mL、500~700 ng/mL、1000~1500 ng/mL、2000~2500 ng/mL；
校准品C1~C6中25-OHD2的浓度依次为：1~2.5 ng/mL、3~5 ng/mL、6~10 ng/mL、15~25ng/mL、35~45 ng/mL、60~85 ng/mL；
校准品C1~C6中25-OHD3的浓度依次为：2~5 ng/mL、6~10 ng/mL、12~18 ng/mL、35~45ng/mL、75~85 ng/mL、150~165 ng/mL；
校准品C1~C6中维生素E的浓度依次为：600~1000 ng/mL、1500~2000 ng/mL、3000~3500ng/mL、7500~8500 ng/mL、15000~18000 ng/mL、30000~35000 ng/mL；
校准品C1~C6中维生素K1的浓度依次为：0.1~0.25 ng/mL、0.3~0.5 ng/mL、0.6~1 ng/mL、1.5~2.5 ng/mL、3.5~5 ng/mL、6~8.5 ng/mL；
质控品1~3中维生素A的浓度依次为：100~200 ng/mL、800~1000 ng/mL、1500~2000 ng/mL；
质控品1~3中25-OHD2的浓度依次为：2~10 ng/mL、25~40 ng/mL、50~65 ng/mL；
质控品1~3中25-OHD3的浓度依次为：8~15 ng/mL、50~70 ng/mL、100~125 ng/mL；
质控品1~3中维生素E的浓度依次为：1500~2500 ng/mL、10000~15000 ng/mL、20000~25000 ng/mL；
质控品1~3中维生素K1的浓度依次为：0.2~1 ng/mL、2~4 ng/mL、5~7 ng/mL；
内标浓储液中包括：浓度为8000~12000 ng/mL的维生素A-d6、浓度为500~800 ng/mL的25-OHD2-d3、浓度为800~1200 ng/mL的25-OHD3-d6、浓度为8000~12000 ng/mL的维生素E-d6、浓度为30~50 ng/mL的维生素K1-d7；
蛋白沉淀剂中包括甲醇、乙腈和二氯甲烷；
流动相添加剂为甲酸。
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