CN115932095A - 血清中脂溶性维生素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及营养物质检测技术领域，具体涉及血清中脂溶性维生素的检测方法。本发明提供一种测定血清中脂溶性维生素的检测方法，此方法操作简单，无需进行复杂的净化提纯步骤就可以获得较纯的含有待测物的处理液，此处理液可直接用于液相色谱串联质谱检测，一次样本处理可同时完成多种维生素的定量和定性分析，提高了检测通量；同时本方法具有较好的除磷脂、除蛋白效果，可降低本底，提高检测的灵敏度，具有较好的利用价值。

Description

血清中脂溶性维生素的检测方法

技术领域

本发明涉及营养物质检测技术领域，具体涉及血清中脂溶性维生素的检测方法。

背景技术

脂溶性维生素包含维生素A、D、E、K，是维持正常的生理功能而必需从食物中获得的一类有机物质，在人体生长和代谢过程中发挥着极其重要的作用。

维生素A(视黄醇)是维持人体正常视觉功能不可缺少的营养素，此外，其在血清中的表达与人体免疫系统的功能存在密切联系。在机体维生素A缺乏的状态下，很容易出现抵抗能力减弱的情况，从而导致呼吸道等易感系统出现感染性疾病。有研究表明，在儿童群体中，由于其自身的生理解剖特点及某些不良生活习惯，VA缺乏与支气管炎、扁桃体炎等呼吸道疾病的发生有密切关联，因此对其呼吸系统感染预防以及治疗中，需要在日常膳食中注意维生素A的添加补充。VA过量则会导致一些中毒症状。

维生素D主要调节人体内钙、磷代谢，维持血浆钙、磷水平，从而维持骨骼的正常生长和发育。除了对钙吸收的作用以外，对于自身免疫疾病也具有重要作用，包括多发性硬化症、Ⅰ型糖尿病以及类风湿性关节炎。定期检测维生素D水平并进行有针对性的补充，对感染性疾病的控制与预防具有重要意义。维生素D主要有两种活性成分组成：维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。其在人体内的代谢路径为：在肝脏中代谢为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，然后经由肾脏转化为1,25-二羟基维生素D2和1,25-二羟基维生素D3，其中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3是反映体内维生素D水平的主要循环形式，目前为国际上公认的衡量维生素D的最佳指标。

维生素E(VE)又名生育酚，是最主要的抗氧化剂之一，具有抗炎、维持正常免疫功能和抑制细胞增殖等生理作用，能促进性激素的分泌，尤其是生育过程中一个必不可少的营养成分。妊娠期妇女营养需求高，身体代谢快，可产生大量自由基，若体内VE含量过低，无法捕获过多的自由基造成自由基过量，会引发胎盘老化、胎膜早破，发生妊娠期高血压、糖尿病等疾病。

维生素K1参与人体内凝血因子的合成，对正常的血液凝结有重要作用，人体内维生素K1缺乏可造成凝血障碍，导致凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症等。而维生素K1补充过量可导致严重的不良反应，包括呼吸困难、紫绀、过敏性休克等。

目前市面上检测维生素D主要采用酶联免疫法和化学发光法，检测维生素A、E主要采用液相色谱法。目前也有液相与质谱联用的检测方式出现。授权号为CN 106442754 B的专利公开了一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，将血清样本进行液液萃取后进行液相色谱或液相色谱串联质谱检测。其标准曲线的做法：90μL混合标准工作液加10μL内标混匀，取80μL直接进样。样本的前处理过程：首先将全血样本离心，取上清得血清，然后加入纯水或甲酸水稀释后加入沉淀剂涡旋离心去蛋白，再加入正己烷萃取，取上清液氮吹，加复溶液上机检测。使用的检测仪器为液相色谱(荧光检测器)或液相色谱串联质谱。此方法虽然能进一步净化样本，但样本纯化不彻底，样本中的杂质含量较高，不利于实现临床样本中维生素含量的自动化检测。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供血清中脂溶性维生素的检测方法。

本发明提供了血清中脂溶性维生素的检测方法，其包括对待测血清样品进行前处理后，采用液相色谱串联质谱检测；

本发明中，所述待测全血样品前处理包括：将待测样品与内标溶液混匀后依次加入沉淀剂、磁珠溶液，磁分离后取上清进行液相色谱串联质谱检测定量分析；

所述内标溶液的溶剂为甲醇，所述内标溶液包括：490～510μg/mL维生素A-D6、90～110μg/mL 25-羟基维生素D2-D3、90～110μg/mL 25-羟基维生素D3-D3、490～510μg/mL维生素E-D6和990～1010ng/mL维生素K1-D7；

所述沉淀剂为乙腈，实验结果表明，沉淀剂中甲醇比例越高，沉淀越不紧密，磁吸过后的溶液澄清度越低；以乙腈为沉淀剂磁吸后的溶液澄清，杂质去除效果好。

所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～6mg/mL。

进一步的，在本发明中，

所述内标溶液为：500μg/mL维生素A-D6、100μg/mL 25-羟基维生素D2-D3、100μg/mL 25-羟基维生素D3-D3、500μg/mL维生素E-D6和1000ng/mL维生素K1-D7；

所述磁珠溶液中的甲醇的体积分数为20％，磁珠的浓度为2mg/mL；所述磁珠溶液中的磁珠类型为羧基官能团磁珠；所述的羟基官能团包括1-18烷基、辛基、苯基、环己基等类型官能团。

所述待测血清样品、内标溶液、沉淀剂与磁珠溶液的体积比为10：1：40：10。

本发明所述的检测方法中，所述脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K；所述维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3；

本发明所述的检测方法中，所述液相色谱串联质谱的色谱条件包括：

流动相A为甲酸水溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；

流动相B为甲酸甲醇溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；

洗脱程序为：

第0～1.80min，流动相A的体积分数为20％至5％；

第1.80～2.60min，流动相A的体积分数由5％至0％；

第2.60～3.60min，流动相A的体积分数为0％；

第3.60～3.61min，流动相A的体积分数由0％至20％；

第3.61～4.0min，流动相A的体积分数为20％；

第4.00～4.50min，流动相A的体积分数为20％。

进一步的，所述液相色谱串联质谱的色谱条件还包括：色谱柱：Kinetex C18(2.6μm，2.1×50mm)，柱温：45℃，进样量20μL，进样温度：8℃，流速：0.5mL/min；

本发明中，所述液相色谱串联质谱的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描；所述正离子MRM扫描具体参数为：离子化电压5500(V)、温度550℃、气帘气35psi、碰撞气7psi、喷雾气50psi、辅助加热气50psi。

在一些具体的实施例中，本发明采用C18柱进行所述的色谱分析。

本发明中，所述的液相色谱串联质谱条件用于脂溶性维生素的检测，其检测结果准确，能实现脂溶性维生素的定性及定量分析；液相色谱串联质谱条件结合特定步骤和试剂组合的前处理，如磁珠溶液和特定沉淀剂的使用，大大降低了本底，减少了杂质干扰，使脂溶性维生素检测的准确度、精确度、和灵敏度进一步提高。并且本发明剔除了需要手工操作的步骤，仅有简单的加样、移样、混匀、磁分离等操作过程，使检测效率进一步提高，更加利于样本高通量处理。因此，本发明所述的检测方法中的各技术特征对检测效果和检测效率产生影响，因此，应作为一个整体进行保护。

本发明提供了检测血清中脂溶性维生素的试剂盒，其包括质控品、校准品、内标溶液、稀释液、沉淀剂、磁珠溶液、流动相A和流动相B；

所述质控品包括低值质控品和高值质控品；

所述低值质控品为：0.4134～0.6202μg/mL维生素A、0.012518～0.018778μg/mL25-羟基维生素D2、0.012469～0.018703μg/mL 25-羟基维生素D3、6.8184～10.2276μg/mL维生素E和0.0004122～0.0006184μg/mL维生素K1；

所述高值质控品为：1.2546～1.8820μg/mL维生素A、0.03939～0.05909μg/mL 25-羟基维生素D2、0.03965～0.05947μg/mL 25-羟基维生素D3、12.2597～18.3895μg/mL维生素E和0.002037～0.003055维生素K1；

所述校准品稀释液溶剂为BSA溶液；所述校准品为：0.02～2μg/mL维生素A、4～400μg/mL 25-羟基维生素D2、4～400μg/mL 25-羟基维生素D3、0.2～20μg/mL维生素E和0.1～10μg/mL维生素K1；

所述内标溶液为：490～510μg/mL维生素A-D6、90～110μg/mL 25-羟基维生素D2-D3、90～110μg/mL 25-羟基维生素D3-D3、490～510μg/mL维生素E-D6和990～1010ng/mL维生素K1-D7；

所述沉淀剂为乙腈；

流动相A为甲酸水溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；

流动相B为甲酸甲醇溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；

所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～6mg/mL。

进一步的，本发明所述的试剂盒中，

所述低值质控品为：0.5168μg/mL维生素A、0.015648μg/mL 25-羟基维生素D2、0.015586μg/mL 25-羟基维生素D3、8.523μg/mL维生素E和0.0005153μg/mL维生素K1；

所述高值质控品为：1.5683μg/mL维生素A、0.04924μg/mL 25-羟基维生素D2、0.04956μg/mL 25-羟基维生素D3、15.3246μg/mL维生素E和0.002546μg/mL维生素K1；

所述内标溶液为：500μg/mL维生素A-D6、100μg/mL 25-羟基维生素D2-D3、100μg/mL 25-羟基维生素D3-D3、500μg/mL维生素E-D6和1000ng/mL维生素K1-D7；

所述校准品的溶剂BSA溶液中，BSA的浓度为50g/L；

所述磁珠溶液中的甲醇的体积分数为20％，磁珠的浓度为2mg/mL；所述磁珠为羧基官能团磁珠，实验结果表明羧基键合磁珠对脂溶性维生素提取效率优于其他磁珠，且2mg/mL以上磁珠浓度提取率差异不大。

所述待测全血样品、内标溶液、蛋白沉淀剂与磁珠溶液的体积比为10：1：40：10。

本发明提供了所述的试剂盒在脂溶性维生素检测中的应用，所述脂溶性维生素为维生素A、维生素D、维生素E和维生素K；所述维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。

本发明提供一种精确测定血清中脂溶性维生素的检测方法，此方法操作简单，无需进行复杂的净化提纯步骤就可以获得较纯的含有待测物的处理液，此处理液可直接用于液相色谱串联质谱检测，一次样本处理可同时完成多种维生素的定量和定性分析，提高了检测通量；同时本方法具有较好的除磷脂、除蛋白效果，可降低本底，提高检测的灵敏度，具有较好的利用价值。

附图说明

图1示不同有机溶剂沉淀效果，从左至右依次为沉淀剂：①乙腈：甲醇＝10：0；②乙腈：甲醇＝9：1；③乙腈：甲醇＝8：2；④乙腈：甲醇＝7：3；⑤乙腈：甲醇＝6：4；⑥乙腈：甲醇＝5：5；其中，沉淀效果①号最好，显著优于最右侧；

图2示ADEK色谱图。

具体实施方式

本发明提供了血清中脂溶性维生素的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、中间工作液、校准品溶液、内标工作液、质控品、校准品稀释液、磁珠稀释液的制备

1.1维生素A、D、E、K中间工作液：取维生素A(视黄醇，105μg/mL)190μL，25-羟基维生素D2(50μg/mL)80μL，25-羟基维生素D3(100μg/mL)40μL，维生素E(α-生育酚，1000μg/mL)200μL，维生素K1(500ng/mL)200μL加入到1.5mL离心管中，并加入290μL含0.1％BHT(2,6-二叔丁基对甲酚)的甲醇(v/v)混合均匀，配制成中间工作液的最高浓度，然后依次稀释成不同浓度的A、D、E、K中间工作液(表一)，稀释液为含0.1％BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)的甲醇。

1.2维生素A、D、E、K校准品溶液：取10μL不同浓度的维生素A、D、E、K中间工作液，与90μL校准品稀释液混匀，配制成不同浓度的维生素A、D、E、K校准品溶液(表1)。

表1不同浓度的维生素A/E中间工作液和校准品溶液

1.3内标工作液：40μL维生素A-D6(500μg/mL)、5μL 25-羟基维生素D2-D3(100μg/mL)、5μL 25-羟基维生素D3-D3(100μg/mL)、60μL维生素E-D6(500μg/mL)、25μL维生素K1-D7(1000ng/mL)和865μL甲醇混合均匀，制成维生素混和内标溶液备用。

1.4质控品：移取空白血清9.8mL，添加维生素A标准品溶液(105μg/mL)48μL，25-羟基维生素D2标准品溶液(5μg/mL)30μL，25-羟基维生素D3标准品溶液(5μg/mL)30μL，维生素E标准品溶液(1000μg/mL)85μL，维生素K1标准品溶液(5μg/mL)1μL，混合均匀(2500rpm混合10min)即为低值质控品。移取空白血清9.5mL，添加维生素A标准品溶液(105μg/mL)143μL，25-羟基维生素D2标准品溶液(5μg/mL)80μL，25-羟基维生素D3标准品溶液(5μg/mL)80μL，维生素E标准品溶液(1000μg/mL)150μL，维生素K1标准品溶液(5μg/mL)4μL，混合均匀(2500rpm混合10min)即为高值质控品。质控品浓度如表2所示。

表2维生素ADEK质控品浓度

物质	低值质控品浓度(μg/mL)	高值质控品浓度(μg/mL)
			维生素A	0.5168(0.4134～0.6202)	1.5683(1.2546～1.8820)
25-羟基维生素D2	0.015648(0.012518～0.018778)	0.04924(0.03939～0.05909)
			25-羟基维生素D3	0.015586(0.012469～0.018703)	0.04956(0.03965～0.05947)
维生素E	8.523(6.8184～10.2276)	15.3246(12.2597～18.3895)
			维生素K1	0.0005153(0.0004122～0.0006184)	0.002546(0.002037～0.003055)

1.5校准品稀释液：准确称取5.00g BSA，加入到100mL PBS溶液中超声10分钟即得。

1.6磁珠稀释液：准确量取5mL甲醇、95mL蒸馏水，混合均匀即得。

2、磁珠溶液的制备

2.1不同类型磁珠溶液的制备：分别取羧基键合磁珠溶液(10mg/mL)、氨基键合磁珠溶液(10mg/mL)、生物素键合磁珠、链霉亲和素键合磁珠溶液(10mg/mL)200μL到1.5mL离心管中，磁分离，去除磁珠保存液，加入1mL磁珠稀释液混匀，即制备成2mg/mL的磁珠溶液。

2.2不同浓度磁珠溶液的制备(羧基磁珠溶液)：

0.5mg/mL：取磁珠溶液(10mg/mL)200μL到5mL离心管中，磁分离，去除磁珠保存液，加入4mL磁珠稀释液，混合均匀。

1mg/mL：取磁珠溶液(10mg/mL)400μL到5mL离心管中，磁分离，去除磁珠保存液，加入4mL磁珠稀释液，混合均匀。

2mg/mL：取磁珠溶液(10mg/mL)800μL到5mL离心管中，磁分离，去除磁珠保存液，加入4mL磁珠稀释液，混合均匀。

4mg/mL：取磁珠溶液(10mg/mL)1600μL到5mL离心管中，磁分离，去除磁珠保存液，加入4mL磁珠稀释液，混合均匀。

6mg/mL：取磁珠溶液(10mg/mL)3mL到5mL离心管中，磁分离，去除磁珠保存液，加入5mL磁珠稀释液，混合均匀。

3、不同沉淀剂的制备

将乙腈与甲醇分别按不同体积比例配制，从而制备出不同的沉淀剂：①乙腈：甲醇＝10：0；②乙腈：甲醇＝6：4；③乙腈：甲醇＝5：5；④乙腈：甲醇＝2：8；⑤乙腈：甲醇＝0：10。

4、流动相的制备

流动相A：取400mL蒸馏水，用移液器加入400μL甲酸，混合均匀，超声10分钟即得流动相A。

流动相B：取400mL甲醇，用移液器加入400μL甲酸，混合均匀，超声10分钟即得流动相B。

5、检测条件

5.1仪器：AB SCIEX 4500MD

5.2质谱条件：离子源模式：ESI⁺；数据采集模式：多反应监测(MRM)。维生素ADEK的离子对参数如表3所示。

表3维生素ADEK离子对参数

5.3液相条件：色谱柱：Kinetex C18(2.6μm，2.1×50mm)，柱温：45℃，进样量20μL，进样温度：8℃，流速：0.5mL/min；采用梯度洗脱程序，如表4所示。

表4液相色谱串联质谱梯度洗脱程序

时间(min)	A(V，％)	B(V，％)
			0	20	80
1.8	5	95
			2.6	0	100
3.6	0	100
			3.61	20	80
4.0	20	80
			4.5	20	80

6、样本前处理

6.1校准曲线前处理方法：取100μL各浓度点校准品到1.5mL离心管中，加入10μL内标工作液，混匀，然后加入400μL沉淀剂、100μL磁珠溶液混匀，将离心管放到磁力架上静置1min，吸取上清液至96孔板中，进行上机检测。质控品和临床血清样本的处理方法同校准曲线前处理方法。

6.2数据处理：以校准品浓度为横坐标，校准品面积/内标面积为纵坐标拟合出校准曲线，将待测血清中物质的面积/内标面积代入到校准曲线中(如表8所示)从而得出待检测物中维生素的含量。

7、实验数据

7.1不同类型磁珠溶液对各维生素的提取结果：①平行前处理6个样本上机检测，取均值；②纯溶剂样本连续进6次，取均值，计算提取率。结果如表5所示，从结果可以看出，羧基键合磁珠对脂溶性维生素提取效率最佳。

表5不同类型磁珠提取维生素ADEK结果

7.2不同浓度磁珠溶液(羧基磁珠)对维生素的提取结果：①平行前处理6个样本上机检测，取均值；②纯溶剂样本连续进6次，取均值，计算提取率。结果如表6所示，从结果可以看出，2mg/mL以上磁珠浓度提取率差异不大，最终选择磁珠浓度为2mg/mL。

表6不同浓度磁珠溶液提取维生素ADEK结果

7.3不同沉淀剂(沉淀剂处理后还包括加入相同的磁悬液处理，变量为沉淀剂)对维生素ADEK的提取结果：①每种沉淀剂平行前处理6个样本上机检测，取均值；②纯溶剂样本连续进6次，取均值，计算提取率。结果如表7所示，从结果可以看出，乙腈与甲醇体积比例大于5：5时，提取率相对较好。

表7不同种类沉淀剂对VA/VE提取率结果

另外从图1可以看出，沉淀剂中甲醇比例越高，沉淀越不紧密，磁吸过后的溶液澄清度越低。最终选择的沉淀剂为乙腈。

7.4线性：利用表1中的7组校准品，经磁珠法(羧基磁珠)进行样本前处理后以校准品浓度为横坐标，校准品面积/内标面积为纵坐标拟合校准曲线如表8所示。

表8维生素ADEK性拟合方程

检测物质	线性范围	校准曲线	<![CDATA[相关系数R<sup>2</sup>]]>
				维生素A	0.02～2μg/ml	Y＝10.4279*X-0.0094	0.9989
25-羟基维生素D2	4～400ng/mL	Y＝0.0180267*X+0.0167696	0.9999
				25-羟基维生素D3	4～400ng/mL	Y＝0.0480881*X+0.00558	0.9995
维生素E	0.2～40μg/mL	y＝0.417086*X+0.0165	0.9976
				维生素K1	0.1～10ng/mL	Y＝0.0055293X+0.01093	0.9943

注：表8中*为乘法。

7.5准确度：采用加标回收的方式实验，向BSA溶液中添加低、中、高三个浓度校准品制成准确度样品，每个样品平行处理6个，经样本前处理后代入校准曲线得浓度值，准确度＝(实测值-本底值)/理论值×100％。准确度实验共进行三批。

表9维生素ADEK准确度结果

7.6精密度：实验方式同准确度，计算每批次6个实测值间的CV。

表10维生素ADEK精密度结果

检测物质	维生素A	25-羟基维生素D2	25-羟基维生素D3	维生素E	维生素K1
						低浓度	1.94％～2.92％	5.24％～6.82％	3.88％～4.65％	1.17％～2.65％	6.04％～6.52％
中浓度	1.59％～2.30％	5.83％～6.32％	3.82％～3.96％	1.77％～4.10％	5.63％～6.46％
						高浓度	1.91％～3.45％	4.98％～5.25％	4.56％～5.38％	2.00％～2.47％	5.84％～6.15％

7.7磁珠法前处理与液液萃取前处理对比

7.7.1液液萃取(LLE)的前处理步骤如下：100μL校准品+200μL内标工作液混匀(2500rpm，1min)，加600μL正己烷混匀(2500rpm，1min)，13000rpm离心5min，取400μL上清氮吹，加100μL 85％甲醇水复溶上机检测。内标工作溶液的配制为：80μL VA-D6(50μg/mL)，100μL VE-D6(100μg/mL)和40mL 75％甲醇水混合均匀。

7.7.2对比方法为：对一套校准曲线分别进行液液萃取前处理及磁珠法前处理，比较峰面积大小，结果如下：①理论上液液萃取法的外标峰面积为磁珠法的6倍，VA磁珠法内标峰面积为液液萃取的0.56倍，VE磁珠法内标峰面积为液液萃取的1.27倍。②实际测得结果为：液液萃取法的外标峰面积为磁珠法峰面积的2-3倍，磁珠法内标峰面积为液液萃取法的2倍左右。从结果可以看出，磁珠法的检测效果不低于液液萃取法。

表11磁珠法与液液萃取法比较(VA)

表12磁珠法与液液萃取法比较(VE)

8.试剂盒

表13试剂盒组成

采用以上最优的条件：浓度为2mg/mL的羧基磁珠，乙腈为蛋白沉淀剂以上述条件纯化样品后液相色谱检测。如图2所示校准品色谱图，横坐标代表时间，纵坐标代表离子丰度，该图表示不同的检测物在特定时间内的出峰情况，通过图2可以看出检测物的峰型呈正态分布曲线图形，且可显区分开来。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.血清中脂溶性维生素的检测方法，其包括对待测血清样品进行前处理后，采用液相色谱串联质谱检测；

所述待测血清样品前处理包括：将待测血清样品与内标溶液混匀后依次加入沉淀剂、磁珠溶液，磁分离后取上清；

所述内标溶液的溶剂为甲醇，所述内标溶液包括：490～510μg/mL维生素A-D6、90～110μg/mL 25-羟基维生素D2-D3、90～110μg/mL 25-羟基维生素D3-D3、490～510μg/mL维生素E-D6和990～1010ng/mL维生素K1-D7；

所述沉淀剂为乙腈；

所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～6mg/mL。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，

所述内标溶液为：500μg/mL维生素A-D6、100μg/mL 25-羟基维生素D2-D3、100μg/mL25-羟基维生素D3-D3、500μg/mL维生素E-D6和1000ng/mL维生素K1-D7；

所述磁珠溶液中，甲醇的体积分数为20％，磁珠的浓度为2mg/mL；所述磁珠溶液中的磁珠类型为羧基官能团磁珠。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测血清样品、内标溶液、沉淀剂和磁珠溶液的体积比为10：1：40：10。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，

所述脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K；所述维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3；

所述液相色谱串联质谱的色谱条件包括：

流动相A为甲酸水溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；

流动相B为甲酸甲醇溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；

洗脱程序为：

第0～1.80min，流动相A的体积分数为20％至5％；

第1.80～2.60min，流动相A的体积分数由5％至0％；

第2.60～3.60min，流动相A的体积分数为0％；

第3.60～3.61min，流动相A的体积分数由0％至20％；

第3.61～4.0min，流动相A的体积分数为20％；

第4.00～4.50min，流动相A的体积分数为20％。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的色谱条件还包括：色谱柱：Kinetex C18(2.6μm，2.1×50mm)，柱温：45℃，进样量20μL，进样温度：8℃，流速：0.5mL/min。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描；所述正离子MRM扫描具体参数为：离子化电压5500(V)、温度550℃、气帘气35psi、碰撞气7psi、喷雾气50psi、辅助加热气50psi。

7.检测血清中脂溶性维生素的试剂盒，其包括质控品、校准品、内标溶液、稀释液、沉淀剂、磁珠溶液、流动相A和流动相B；

所述质控品包括低值质控品和高值质控品；

所述低值质控品为：0.4134～0.6202μg/mL维生素A、0.012518～0.018778μg/mL 25-羟基维生素D2、0.012469～0.018703μg/mL 25-羟基维生素D3、6.8184～10.2276μg/mL维生素E和0.0004122～0.0006184μg/mL维生素K1；

所述高值质控品为：1.2546～1.8820μg/mL维生素A、0.03939～0.05909μg/mL 25-羟基维生素D2、0.03965～0.05947μg/mL 25-羟基维生素D3、12.2597～18.3895μg/mL维生素E和0.002037～0.003055维生素K1；

所述校准品的溶剂为BSA溶液；所述校准品为：0.02～2μg/mL维生素A、4～400μg/mL25-羟基维生素D2、4～400μg/mL 25-羟基维生素D3、0.2～20μg/mL维生素E和0.1～10μg/mL维生素K1；

所述内标溶液为：490～510μg/mL维生素A-D6、90～110μg/mL 25-羟基维生素D2-D3、90～110μg/mL 25-羟基维生素D3-D3、490～510μg/mL维生素E-D6和990～1010ng/mL维生素K1-D7；

所述沉淀剂为乙腈；

流动相A为甲酸水溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；

流动相B为甲酸甲醇溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；

所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～6mg/mL。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，

所述低值质控品为：0.5168μg/mL维生素A、0.015648μg/mL 25-羟基维生素D2、0.015586μg/mL 25-羟基维生素D3、8.523μg/mL维生素E和0.0005153μg/mL维生素K1；

所述高值质控品为：1.5683μg/mL维生素A、0.04924μg/mL 25-羟基维生素D2、0.04956μg/mL 25-羟基维生素D3、15.3246μg/mL维生素E和0.002546μg/mL维生素K1；

所述内标溶液为：500μg/mL维生素A-D6、100μg/mL 25-羟基维生素D2-D3、100μg/mL25-羟基维生素D3-D3、500μg/mL维生素E-D6和1000ng/mL维生素K1-D7；

所述校准品的溶剂BSA溶液中，BSA的浓度为50g/L；

所述磁珠溶液中，甲醇的体积分数为20％，磁珠的浓度为2mg/mL；所述磁珠为羧基官能团磁珠。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，待测血清样品、内标溶液、蛋白沉淀剂与磁珠溶液的体积比为10：1：40：10。

10.权利要求8或9所述的试剂盒在脂溶性维生素检测中的应用，所述脂溶性维生素为维生素A、维生素D、维生素E和维生素K；所述维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。

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