CN108732285B - 高通量测定血清中25-羟基维生素d的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布一高通量测定血清中25‑羟基维生素D的定量检测方法，包括以下步骤：待测样本的前处理：取样品加入含有25‑羟基维生素D同位素的内标物，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到上清液，氮气吹干所述上清液，并加入复溶液，涡旋震荡后离心得到待测样本；超高效液相色谱‑串联质谱检测所述待测样本，获得所述待测样本的内标峰以及对应内标峰面积；以及代入所述待测样本的峰面积与对应内标峰面积的比值到回归方程，得到待测样本的含量，其中所述回归方程反应标准品峰面积与对应内标峰面积比值和标准品溶液浓度之间的关系。
Description
技术领域
本发明涉及维生素D检测的领域，特别涉及一种高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，所述定量测定方法精准快速地获取25-羟基维生素D的定量数据。
背景技术
维生素D是一类脂溶性维生素，在维持人体内钙的动态平衡方面起着非常重要的作用，其能和钙一起促进儿童骨骼的形成和维持成人骨骼的强度。此外，维生素D还有着广泛的非骨骼效应，与心血管疾病、免疫疾病、糖尿病和肿瘤等疾病密切相关，维生素D的缺乏可导致骨骼发育受损，以及各类慢性疾病的发病风险增加，如类风湿性关节炎、软骨化、冠心病、糖尿病和肿瘤等。
人体内维生素D的来源主要有两个途径，一是通过膳食途径摄入的维生素D2(酵母或真菌)和维生素D3(鱼、鱼肝油或蛋黄)，二是机体经光照将皮肤中的7-脱氢胆甾醇转化为维生素D3。然而这些维生素D在肝脏中可转化为25-羟基维生素D(25-OHD)，从而被机体转运或储藏，另外，25-OHD在体内稳定，半衰期长，其浓度水平与体内维生素D含量直接相关，因此25-OHD可作为一类主要的生物标志物用于体现机体维生素D水平。
目前，25-OHD的检测方法有多种，包括免疫检测、HPLC法和LC-MS/MS方法等。其中，由于25-羟基维生素D在人体内主要与血清结合蛋白DBP结合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此在检测时存在严重的基质干扰，而传统的放射免疫法和竞争蛋白结合法，不能有效祛除基质干扰，对比而言，LC-MS/MS法具有特异性强、准确度高、分析时间短等特点，被认为是评价机体维生素D营养状况的“金标准”。
现有公开专利文献申请号201510530370.0“超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素D的方法”以及2008年10月公布的“THE ANNALYS OF 25-HYDROXYVITAMIN D INSERUM USING UPLC/MS/MS”的文献公开了一种利用超高效液相色谱串联质谱法检测25羟基维生素D的方法，但是其公开的方法存在两大不可避免的缺陷：1.只着重于强调定性检测25羟基维生素D的方法，无法同时准确定量25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量，也无法给出准确的25-羟基维生素D的含量，虽然在文献中稍微待过提及定量检测的可能性，但是其具体方案并无揭露。2.待测样本的前处理步骤过于繁琐，进而导致分析时间长，方法的特异性差，检测通量低。
综上所述，为了更好地高效检测25-羟基维生素D，急需一种在原有检测方法基础上更加优化并且可高通量定量检测25-羟基维生素D的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，所述定量测定方法可被用于高通量地获取25-羟基维生素D的定量数据，且其方法的检测时间短，且有高灵敏度，满足临床检测的需求。
本发明的目的在于提供一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，所述定量测定方法改进现有技术的定性检测方法，待测样本的前处理步骤简单易处理，又便于操作。
本发明的目的在于提供一高通量快速测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法 ，所述定量测定方法可准确分离并且分别获取25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量。
本发明的目的在于提供一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，所述定量测定方法被应用于获取25-羟基维生素D的准确含量数据，从而被应用于评价机体维生素D营养状况。
为了达到以上发明目的，本发明提供一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，包括以下步骤：
S1:待测样本的前处理：
取血清样品加入含有25-羟基维生素D同位素的内标物，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第一上清液，向下层溶液再加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第二上清液，合并所述第一上清液和所述第二上清液得到上清液，氮气吹干所述上清液，并加入复溶液，涡旋震荡后离心得到待测样本；
S2:超高效液相色谱串联质谱完成检测所述待测样本，获得所述待测样本的峰面积和对应内标峰面积；以及
S3:代入所述待测样本的峰面积与对应内标峰面积的比值到回归方程，得到待测样本的含量，其中所述回归方程反应标准品峰面积与对应内标峰面积比值和标准品溶液浓度之间的关系。
在一些实施例中，所述步骤S1当中所述25-羟基维生素D同位素的内标物中25-羟基维生素D同位素选择为d3-25羟基维生素D2和/或d3-25羟基维生素D3。
在一些实施例中，所述涡旋震荡时间均控制在4分钟，在获得所述上清液的时候以及添加所述复溶液后的离心条件为：4℃条件12000rpm下离心5分钟，所述氮气吹干的条件为室温下完成氮气的吹干，所述复溶液选择为80%的甲醇溶液。
在一些实施例中，所述步骤S2当中,所述液相色谱的条件为：
流动相A液:0.1%甲酸水溶液，流动相B液: 2 mM甲酸铵与0.1%甲酸甲醇溶液；流速：0.5 mL/min，柱温为40℃，进样20μL；
所用洗脱梯度：0-0.1 min, 85%；流动相B液在0.1-0.5 min, B液升高到95%；0.5-1 min, B液升至100%； 1-1.5 min, 维持 100%； B液； 1.51 min, B液降到85%，维持0.5min到2 min。
在一些实施例中，所述步骤S2当中，所述串联-质谱参考条件为：
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；
喷雾毛细管电压：1.0-2.5 KV；
脱溶剂气温度：400-600℃；
脱溶剂气流速：800-1000 L/Hr；
离子源温度：130-150℃；
脱溶剂气压力：8 bar；
碰撞气压力：0.7 bar；
扫描模式：多反应监测。
在一些实施例中，包括以下步骤：
A1:制备标准品溶液
以甲醇配制25-羟基维生素D的标准品储备液，然后加入人造血清，制备不同浓度的标准品溶液，2-8 ºC保存备用；
A2:所述标准品溶液作为步骤S1当中的样品，进行步骤S1和步骤S2的操作；
A3：获取不同标准品溶液对应的内标峰面积，以所述标准品溶液的浓度为X轴，所述标准品峰面积和对应的内标峰面积的比值为Y轴，得到标准曲线，对所述标准曲线进行回归分析，经过“1/X”权重因子得到所述回归方程。
在一些实施例中，所述步骤A1当中，所述标准品浓度控制在1-100ng/ml。
在一些实施例中，所述标准储备溶液和所述人造血清的体积比为1:50。
在一些实施例中，所述空白介质为2%甲醇人造血清。
在一些实施例中，所述步骤S2当中，超高效液相色谱串联质谱的检测时间在2分钟内。
附图说明
图1是根据本发明的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中显示的 25-羟基维生素D2的MRM色谱图。
图2是根据本发明的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中显示的 25-羟基维生素D3的MRM色谱图。
图3是根据本发明的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中显示的 25-羟基维生素D2的定量标准工作曲线。
图4是根据本发明的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中显示的 25-羟基维生素D3的定量标准工作曲线。
图5是根据本发明的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中人血清样品中25-羟基维生素D2色谱图。
图6是根据本发明的一实施例的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法在检测过程中人血清样品中25-羟基维生素D3色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底” “内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
本发明旨在解决现有技术存在的问题，在改进25-羟基维生素D的定性检测的同时完成高通量的定量检测，本发明提供一高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，包括以下步骤：
步骤S1:待测样本的前处理：取血清样品加入含有25-羟基维生素D同位素的内标物，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第一上清液，向下层溶液再加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第二上清液，合并所述第一上清液和所述第二上清液得到上清液，氮气吹干所述上清液，并加入复溶液，涡旋震荡后离心得到待测样本。
本发明提供的所述待测样本的前处理步骤改进现有技术的样本前处理步骤，相较现有技术的样本前处理步骤更加简单，快速，并且经过这样前处理处理过的待测样本在后续的高通量液相色谱检测过程中表现出通量高，分析时间短的优势。
比对现有申请号201510530370.0的专利文本“超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素D的方法”中提到的样本前处理步骤，现有技术中提到的样本前处理步骤需要加入硫酸锌溶液和甲醇溶液进行蛋白质沉淀，本发明就不需要该步骤，另外现有技术采用正己烷萃取，而本发明利用特丁基甲醚进行两次萃取的方式，而熟悉该项技术的人应该明白，萃取剂的选择对于后续25-羟基维生素D检测时的通量以及分析时间影响非常重大，本发明在待测样本的前处理步骤对现有技术进行改进，从而使得后续的高通量液相色谱检测过程表现良好。
关于步骤S1当中的具体内容介绍如下：
所述25-羟基维生素D同位素的内标物中25-羟基维生素D同位素选择为d3-25羟基维生素D2和/或d3-25羟基维生素D3，并且所述d3-25羟基维生素D2和/或所述d3-25羟基维生素D3的制备过程为：用甲醇配置d3-25羟基维生素D2和/或d3-25羟基维生素D3至浓度为3-8ug/ml，在本实施例中，优选为5ug/ml，在定容后密封保存在-20℃的环境中，其中所述内标物的浓度适用于本特定实施例，但不作为限制。
由上可知，所述内标物可以只包括d3-25羟基维生素D2也可只包括d3-25羟基维生素D3，或者同时包括d3-25羟基维生素D2和d3-25羟基维生素D3，具体情况视具体实验而定。
在本发明的一实施例中，所述步骤S1当中的涡旋震荡时间均控制在3-5分钟，优选4分钟，在获得所述上清液的时候以及添加所述复溶液后的离心条件为：4℃条件12000rpm下离心5分钟，所述氮气吹干的条件为室温下完成氮气的吹干，所述复溶液选择为75-85%的甲醇溶液，在实施例中，优选为80%。值得注意的是，这些条件的选择均为适用于本实施例的最优选择，但不作为特别的限定。
S2:超高效液相色谱串联质谱完成检测所述待测样本，获得所述待测样本的峰面积和对应内标峰面积：
利用超高效液相色谱以及相应的流动相，在分析柱上从所述上清液中以梯度洗脱的模式分离出25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，通过串联质谱针对性检测所述25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的峰面积以及对应内标峰面积。
具体而言，所述液相色谱的条件为：
色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 (2.1 mm x 50 mm, 1.7 μm)；
流动相A液：0.1%甲酸水溶液，B液: 2 mM 甲酸铵与0.1%甲酸甲醇溶液；流速：0.5mL/min，柱温为35-45℃，进样10-30μL；在本发明的一具体实施例中，所述柱温为40℃，进样20ul。
所用洗脱梯度：0-0.1 min, 85%流动相B液；在0.1-0.5 min, B液升高到95%；0.5-1 min, B液升至100%； 1-1.5 min, 维持 100% B液； 1.51 min, B液降到85%，维持0.5min到2 min；
在一些实施例中，所述步骤S2当中，所述串联-质谱参考条件为：
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；
喷雾毛细管电压：1.0-2.5 KV；
脱溶剂气温度：400-600℃；
脱溶剂气流速：800-1000 L/Hr；
离子源温度：130-150℃；
脱溶剂气压力：8 bar；
碰撞气压力：0.7 bar；
扫描模式：多反应监测。
在一优选实施例中，所述串联-质谱参考条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；
喷雾毛细管电压（Capliary）：1.1 KV；
脱溶剂气温度（Desolvation Temp）：500℃；
脱溶剂气流速（Desolvation）：1000 L/Hr；
离子源温度（Source Temp）：150℃；
脱溶剂气压力（减压表）：8 bar；
碰撞气压力（减压表）：0.7 bar；
扫描模式：多反应监测 。其中下图表1为25-羟基维生素D2和D3 以及内标的MRM检测离子和碰撞能量优化设置，其中MCM：Multiple Reaction Monitor ,指的就是多反应检测离子扫描。目标定量离子对包括25-羟基维生素D2定量离子对和/或25-羟基维生素D3定量离子对，并且数据表明步骤S2可在2分钟内完成维生素D的检测。
表1
对表进行简单的介绍说明：内标定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的条件包括：
d3-25羟基维生素D2定量母离子的母离子的质荷比为416.4，对应的子离子的质荷比为358.3；
d3-25羟基维生素D3定量母离子的母离子的质荷比为404.4，对应的子离子的质荷比为386.4;
目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的条件包括：25羟基维生素D2的母离子的质荷比为413.3，对应的定量离子的质荷比为383.4或365.3；
25羟基维生素D3的母离子的质荷比为401.3，对应的定量离子的质荷比为355.1或337.4；
可以理解的是，所述超高效液相色谱串联质谱仅仅提供一特定的实施情况，如图1和图2，在该条件下，所述 25-羟基维生素D2和所述 25-羟基维生素D3的MRM色谱图被展示，但不作为限制。
值得一提是，经过大量的实验数据表明，本发明提供的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量测定方法可在2分钟内分离25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，以及高通量地测量其峰面积以及相应的内标峰面积。
步骤S3：代入所述待测样本的峰面积与内标峰面积的比值到回归方程，得到待测样本的含量，其中所述回归方程反应标准品峰面积与内标峰面积比值和标准溶液浓度之间的关系。
在步骤S3当中，一旦得回归方程以及待测样本中内标峰的面积与内标峰面积的比值，即可快速比对获取所述待测样本的含量，其中所述待测样本包括25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3，此时所述步骤S2当中的样品为人血清溶液。
如图5和图6所示，人血清样品中25-羟基维生素D2以及25-羟基维生素D的色谱图被展示，从而获取25-羟基维生素D2以及所述25-羟基维生素D3中内标峰的面积，并代入到所述回归方程中得到所述25-羟基维生素D2和/或所述25-羟基维生素D3的含量。
然而在所述步骤S3当中，所述回归方程可以是预先存在的，也可以是重新制备的，所述回归方程的制备步骤如下：
A1：制备标准品溶液：
以甲醇配制25-羟基维生素D的标准品储备液，然后加入人造血清，制备不同浓度的标准品溶液，2-8 ºC保存备用。
其中所述标准品溶液的浓度控制在1-100ng/ml，数据表明当所述标准品溶液的浓度控制在这个范围内时其线性关系表现良好。
A2:所述标准品溶液作为步骤S1当中的样品，进行步骤S1和步骤S2的操作，此时，所述标准品溶液和人血清样品的唯一差别仅仅在于所述标准品溶液的浓度是已知的，而人血清样品中25-羟基维生素D的浓度是未知的。
A3：获取不同标准品溶液对应的内标峰面积，以所述标准品溶液的浓度为X轴，所述标准液峰面积和对应的内标峰面积的比值为Y轴，得到标准曲线，对所述标准曲线进行回归分析，经过“1/X”权重因子得到所述回归方程。
如图3和图4所示，所述 25-羟基维生素D2和所述 25-羟基维生素D3的定量标准工作曲线被展示，如图可见的是，在1-100ng/ml范围内，所述 25-羟基维生素D2和所述 25-羟基维生素D3的定量标准曲线的线性关系良好。
值得注意的是，本发明提供一具体的实施例，实施内容如下所示：
取人血清 200μL 置于洁净离心管中；加入100 μL 的内标溶液，涡旋震荡混匀4min(简单的沉淀蛋白)；然后加入500μL 特丁基甲醚涡旋震荡4 min，4℃条件12000 rpm离心5 min； 吸取上清液400μL置洁净离心管内；向下层溶液再加入500μL 特丁基甲醚，重复以上步骤(两次液液萃取);合并两次上清液室温下氮气吹干；加入100μL 80%甲醇复溶，涡旋震荡4 min，4℃条件12000 rpm离心5 min；转移80μL至96孔板，可进样，随后通过超高效液相色谱-串联质谱检测其内标峰，在2分钟之内25-羟基维生素D2和D3得到了理想的分离和检测 （图5和图6），通过标准工作曲线所测定的含量分别为2.3和17.6 ng/mL, 总的维生素D含量为19.9 ng/mL。接近我们所测的人血清维生素D正常值的低限 （正常值范围为20~50 ng/mL）。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:待测样本的前处理：取血清样品加入含有25-羟基维生素D同位素的内标物，涡旋震荡完成蛋白沉淀，加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第一上清液，向下层溶液再加入特丁基甲醚涡旋震荡萃取，并离心得到第二上清液，合并所述第一上清液和所述第二上清液得到上清液，氮气吹干所述上清液，并加入复溶液涡旋震荡后离心得到待测样本，其中所述涡旋震荡时间均控制在3-5分钟，在获得所述上清液的时候以及添加所述复溶液后的离心条件为：4℃条件12000rpm下离心5分钟，所述氮气吹干的条件为室温下完成氮气的吹干，所述复溶液选择为75-85%的甲醇溶液；
S2:超高效液相色谱串联质谱完成检测所述待测样本，获得所述待测样本的峰面积和对应内标峰面积，
液相色谱的条件为：
流动相A液:0.1%甲酸水溶液，流动相B液: 2 mM甲酸铵与0.1%甲酸甲醇溶液；流速：0.5mL/min，柱温为40℃，进样20μL；
所用洗脱梯度：0-0.1 min, 85%；流动相B液在0.1-0.5 min, B液升高到95%；0.5-1min, B液升至100%； 1-1.5 min, 维持 100%； B液； 1.51 min, B液降到85%，维持0.5 min到2 min；
串联-质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾毛细管电压：1.0-2.5 KV；脱溶剂气温度：400-600℃；脱溶剂气流速：800-1000 L/Hr；离子源温度：130-150℃；脱溶剂气压力：8 bar；碰撞气压力：0.7 bar；扫描模式：多反应监测，在2分钟内分离25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3；
以及
S3:代入所述待测样本的峰面积与对应内标峰面积的比值得到回归方程，得到所述待测样本的含量，其中所述回归方程反应标准品峰面积与对应内标峰面积比值和标准品溶液浓度之间的关系。
2.根据权利要求1所述的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，所述步骤S1当中所述25-羟基维生素D同位素的内标物中25-羟基维生素D同位素选择为d3-25羟基维生素D2和/或d3-25羟基维生素D3。
3.根据权利要求1到2任一所述的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1:制备标准品溶液
以甲醇配制25-羟基维生素D的标准品储备液，然后加入人造血清，制备不同浓度的标准品溶液，2-8 ºC保存备用；
A2:所述标准品溶液作为步骤S1当中的样品，进行步骤S1和步骤S2的操作；
A3：获取不同标准品溶液的峰面积以及对应的内标峰面积，以所述标准品溶液的浓度为X轴，所述标准品峰面积和对应的内标峰面积的比值为Y轴，得到标准曲线，对所述标准曲线进行回归分析，经过“1/X”权重因子得到所述回归方程。
4.根据权利要求3所述的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，所述步骤A1当中，所述标准品溶液的浓度控制在1-100ng/ml。
5.根据权利要求4所述的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，所述标准品储备溶液和所述人造血清的体积比为1:50。
6.根据权利要求5所述的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，以空白介质进行步骤A1-步骤A3,所述空白介质为2%甲醇人造血清。
7.根据权利要求3所述的高通量测定血清中25-羟基维生素D的定量检测方法，其特征在于，所述步骤S2当中，超高效液相色谱串联质谱的检测时间在2分钟内。
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