CN114609261A - 一种hplc-ms联用检测干血斑中25-羟基维生素d的方法 - Google Patents
一种hplc-ms联用检测干血斑中25-羟基维生素d的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114609261A CN114609261A CN202011451230.1A CN202011451230A CN114609261A CN 114609261 A CN114609261 A CN 114609261A CN 202011451230 A CN202011451230 A CN 202011451230A CN 114609261 A CN114609261 A CN 114609261A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mobile phase
- hydroxyvitamin
- sample
- internal standard
- high performance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 118
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 118
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 104
- JWUBBDSIWDLEOM-XHQRYOPUSA-N (3e)-3-[(2e)-2-[1-(6-hydroxy-6-methylheptan-2-yl)-7a-methyl-2,3,3a,5,6,7-hexahydro-1h-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylidenecyclohexan-1-ol Chemical compound C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2\C1=C\C=C1/CC(O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-XHQRYOPUSA-N 0.000 title claims abstract description 93
- 235000021318 Calcifediol Nutrition 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 title abstract description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 153
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 28
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- JWUBBDSIWDLEOM-UHFFFAOYSA-N 25-Hydroxycholecalciferol Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- JWUBBDSIWDLEOM-DCHLRESJSA-N 25-Hydroxyvitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-DCHLRESJSA-N 0.000 claims description 23
- JWUBBDSIWDLEOM-NQZHSCJISA-N 25-hydroxy-3 epi cholecalciferol Chemical compound C1([C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=CC=C1C[C@H](O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-NQZHSCJISA-N 0.000 claims description 23
- KJKIIUAXZGLUND-ICCVIKJNSA-N 25-hydroxyvitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](\C=C\[C@H](C)C(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C KJKIIUAXZGLUND-ICCVIKJNSA-N 0.000 claims description 23
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 claims description 12
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 claims description 12
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- VBUZIXJFGCVTJL-UHFFFAOYSA-N azanium;methanol;formate Chemical compound [NH4+].OC.[O-]C=O VBUZIXJFGCVTJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 4
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 claims description 3
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 abstract description 15
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 abstract description 13
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 abstract description 13
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 abstract description 13
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 abstract description 13
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 abstract description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 53
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 26
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 20
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 18
- 150000001343 alkyl silanes Chemical group 0.000 description 17
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- ISULLEUFOQSBGY-UHFFFAOYSA-N 4-phenyl-1,2,4-triazole-3,5-dione Chemical compound O=C1N=NC(=O)N1C1=CC=CC=C1 ISULLEUFOQSBGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 10
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 10
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 10
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 10
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 10
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 8
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 8
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 7
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010047626 Vitamin D Deficiency Diseases 0.000 description 2
- MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N Vitamin D2 Natural products C1CCC2(C)C(C(C)C=CC(C)C(C)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229960002061 ergocalciferol Drugs 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000001892 vitamin D2 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011653 vitamin D2 Substances 0.000 description 2
- MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N vitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N 0.000 description 2
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 description 2
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 2
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 1
- 208000005368 osteomalacia Diseases 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000007442 rickets Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/30—Control of physical parameters of the fluid carrier of temperature
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
- G01N2030/324—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed speed, flow rate
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种HPLC‑MS联用检测干血斑中25‑羟基维生素D的方法。具体地，本发明提供一种通过高效液相色谱与质谱联用检测样品中25‑羟基维生素D的方法，所述的方法包括步骤：将样品通过高效液相色谱与质谱联用检测25‑羟基维生素D。本发明所述的方法能够准确、快速、高精度的测定维生素D的方法。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地，本发明涉及一种HPLC-MS联用检测干血斑中25-羟基维生素D的方法。
背景技术
维生素D是一类脂溶性固醇类衍生物，参与维持人体钙磷浓度稳定，能与钙一起促进儿童骨骼的发育，并能维持成人骨骼的强度。缺乏维生素D会导致一系列疾病，包括儿童佝偻病、骨质疏松症、成人软骨病等，也有研究显示，维生素D缺乏还与肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病等慢性疾病相关。
维生素D主要包括维生素D2和D3两种形式，大部分人的体内维生素D来源于阳光照射下合成的维生素D3和来源于食物的维生素D2。两者在肝脏中代谢形成25-羟基维生素D，在肾脏中进一步合成1，25-羟基维生素D。在血液中，25-羟基维生素D是维生素D最主要的存在形式，性质稳定，是国际公认的衡量维生素D水平的最佳标准。
维生素D参与体内钙磷调节，对维持身体健康起重要作用，通过检测体内维生素D的真实含量，了解人体内维生素D的状态，对于是否需要补充或者辅助诊断其他疾病具有重要参考价值。
然而，现有技术中检测维生素D检测方法存在易受到基质干扰、不能区分同分异构体、结果差异大、灵敏度不够高、通量小等缺点，从而限制维生素的准确测定和对人体内维生素D营养状况的准确健康评估。
因此，本领域需要开发一种准确、快速、高精度的测定维生素D的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确、快速、高精度的测定维生素D的方法。
本发明第一方面，提供一种通过高效液相色谱与质谱联用检测样品中25-羟基维生素D的方法，所述的方法包括步骤：
将样品通过高效液相色谱与质谱联用检测25-羟基维生素D；
所述的高效液相色谱条件包括；
色谱柱：反相色谱柱；
流动相：流动相A+流动相B；流动相A为0.1-10mM甲酸铵水溶液，流动相B为0.1-10mM甲酸铵甲醇溶液；
流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：
其中，％A是指流动相A占流动相的体积百分比，％B是指流动相B占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(15-25)：(85-75)匀速渐变至(5-15)：(95-85)；在1.5-1.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(5-15)：(95-85)匀速渐变至(15-25)：(85-75)；在1.6-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为(15-25)：(85-75)。
在另一优选例中，所述的反向色谱柱的填料为C4-C18烷基硅烷键合硅胶，较佳地C12-C18烷基硅烷键合硅胶。
在另一优选例中，所述的反向色谱柱为C4-C18烷基硅烷键合硅胶柱，较佳地C12-C18烷基硅烷键合硅胶。
在另一优选例中，所述的C4-C18烷基硅烷键合硅胶选自下组：C4烷基硅烷键合硅胶、C6烷基硅烷键合硅胶、C8烷基硅烷键合硅胶、C12烷基硅烷键合硅胶、C16烷基硅烷键合硅胶、C18烷基硅烷键合硅胶，或其组合。
在另一优选例中，所述的反相色谱柱为C4烷基硅烷键合硅胶色谱柱、C6烷基硅烷键合硅胶色谱柱、C8烷基硅烷键合硅胶色谱柱、C12烷基硅烷键合硅胶色谱柱色谱柱、C16烷基硅烷键合硅胶色谱柱、C18烷基硅烷键合硅胶色谱柱，或其组合。
在另一优选例中，所述的色谱柱为XBridge BEH C18。
在另一优选例中，流动相A为0.5-10mM甲酸铵水溶液，较佳地0.5-5mM甲酸铵水溶液，更佳地1-3mM甲酸铵水溶液；和/或
流动相B为0.5-10mM甲酸铵甲醇溶液，较佳地0.5-5mM甲酸铵甲醇溶液，更佳地1-3mM甲酸铵甲醇溶液。
在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：
其中，％A是指流动相A占流动相的体积百分比，％B是指流动相B占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(18-22)：(82-78)匀速渐变至(8-12)：(92-88)；在1.5-1.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(8-12)：(92-88)匀速渐变至(18-22)：(82-78)；在1.6-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为(18-22)：(82-78)。
在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：
其中，％A是指流动相A占流动相的体积百分比，％B是指流动相B占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由20:80匀速渐变至10:90；在1.5-1.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至20:80；在1.6-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为20:80。
在另一优选例中，所述的方法为定量、定性和/或杂质检测方法。
在另一优选例中，所述的方法为体外和/或辅助性方法。
在另一优选例中，所述的方法为非诊断性方法。
在另一优选例中，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：
流动相流速：0.1-1.2mL/min，较佳地0.2-1.0mL/min，更佳地0.2-0.8mL/min，更佳地0.3-0.6mL/min；
柱温：35-45℃，较佳地40℃；
进样体积：5～40μL，更佳地5-20μL；
运行时间：1-3min，更佳地2-3min，更佳地2-2.5min；和/或
所述色谱柱的规格为(2.1×50mm，2.5μm)。
在另一优选例中，所述的样品为血样。
在另一优选例中，所述的血样为全血、血清、血浆或干血斑。
在另一优选例中，所述的血样为人或非人哺乳动物(如猪、狗、猫、羊或牛)血样。
在另一优选例中，所述的样品为全血、血清、血浆或干血斑。
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素D选自下组：25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3，或其组合。
在另一优选例中，依次通过高效液相色谱和质谱联用检测样品中的25-羟基维生素D。
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素D依次经过HPLC和MS后进行检测。
在另一优选例中，所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D的荷质比，测定得到25-羟基维生素D的含量；或
所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D与其对应内标的荷质比，根据内标法定量分析，得到25-羟基维生素D的含量。
在另一优选例中，所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与干血斑中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D的荷质比，测定得到25-羟基维生素D的含量。
在另一优选例中，所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与干血斑中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D与其对应内标的荷质比，根据内标法定量分析，得到25-羟基维生素D的含量。
在另一优选例中，所述的内标包括同位素内标。
在另一优选例中，所述的同位素内标选自下组：25-羟基维生素D2-2H3、25-羟基维生素D3-2H3，或其组合。
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素D2的同位素内标为25-羟基维生素D2-2H3。
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素D3的同位素内标为25-羟基维生素D3-2H3。
在另一优选例中，通过标准曲线法或内标对比法测定样品中25-羟基维生素D的含量。
在另一优选例中，所述的干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径>10mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥4-12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
在另一优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥4-12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
在另一优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
在另一优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去。将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于-20℃条件下保存。
在另一优选例中，所述的干血斑经过处理后进样，所述的处理包括步骤：
向干血斑加入提取剂进行提取后，加入萃取液萃取，离心取上清液，吹干，加入衍生化试剂衍生后，加入终止反应试剂，吹干，复溶剂复溶。
在另一优选例中，所述提取剂包括含内标甲醇溶液。
在另一优选例中，所述萃取液包括正己烷。
在另一优选例中，所述衍生化试剂包括4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)。
在另一优选例中，所述终止反应试剂包括乙醇。
在另一优选例中，所述复溶剂包括甲醇水溶液。
在另一优选例中，所述复溶剂包括30-80％甲醇水溶液。
在另一优选例中，所述的干血斑经过处理后进样，所述的处理包括步骤：
用打孔器取干血斑样本至96孔深孔样品板，向干血斑加入含内标混合液的提取剂，超声提取，样本中加入萃取液，涡旋离心后取上清液，氮气吹干，加入衍生化试剂，室温条件下衍生，加入终止反应试剂，氮气吹干，复溶剂复溶。
在另一优选例中，所述经过预处理的干血斑按照如下方法制备：用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔样品板，向干血斑加入200μL含内标甲醇溶液，超声30min提取，样本中加入1mL正己烷，涡旋5min后，在14000～15000r/min，4～20℃离心5～10min后取上清液，氮气吹干，加入50μL衍生化试剂PTAD，室温条件下衍生1小时，加入100μL乙醇终止反应，氮气吹干，50％甲醇复溶。
在另一优选例中，所述含内标甲醇溶液按照如下方法制备：
称取各同位素内标物25-羟基维生素D2-2H3和25-羟基维生素D3-2H3，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为0.1mg/mL、0.1mg/mL的同位素内标母液；
上述各同位素内标母液再以纯甲醇溶液配制成包含2μg/mL 25-羟基维生素D2-2H3和2μg/mL 25-羟基维生素D3-2H3有同位素内标IS溶液；
取200μL同位素内标IS溶液，加入甲醇6mL，混合均匀即得含内标甲醇溶液。
在另一优选例中，所述衍生化试剂PTAD如下方法制备：
称取PTAD2mg至容量瓶中，加入5mL乙腈完全溶解，用乙腈稀释至10mL，即得衍生化试剂PTAD。
在另一优选例中，所述标准品按照如下方法制备：
称取各待测物标准品，包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3；
上述各标准品母液再以用甲醇溶液配制成包含有2μg/mL25-羟基维生素D2和4μg/mL25-羟基维生素D3混合标准WS07溶液；
将上述混合标液WS07溶液以空白替代基质配制成七个不同浓度点的校准品干血斑，所述校准品干血斑的7个浓度点为：
25-羟基维生素D2的浓度依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL；
25-羟基维生素D3的浓度依次为4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL。
在另一优选例中，空白替代基质干血斑为牛全血。
在另一优选例中，在所述的方法中，通过内标法测定样品中的25-羟基维生素D的含量。
在另一优选例中，在所述的方法中，先建立25-羟基维生素D(优选为标准品)峰面积与内标峰面积的比值和25-羟基维生素D的浓度的标准曲线，再通过内标法测定样品中的25-羟基维生素D的含量。
在另一优选例中，25-羟基维生素D(优选为标准品)峰面积与内标峰信号的比值为纵坐标，25-羟基维生素D的浓度为横坐标。
在另一优选例中，对于25-羟基维生素D2，标准曲线的线性范围为2-200ng/mL。
在另一优选例中，对于25-羟基维生素D3，标准曲线的线性范围为4-200ng/mL。
在另一优选例中，所述的质谱的条件为：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正离子模式扫描；喷雾电压为1.5kV(ESI+)；离子源温度为150℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为900L/h，锥孔气流速为200L/h。
在另一优选例中，所述的质谱同时检测25-羟基维生素D和任选地25-羟基维生素D相对应的内标。
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素D和任选地25-羟基维生素D相对应内标的质谱采集参数如下所示：
其中：25-OHVD2为25-羟基维生素D2；
25-OHVD3为25-羟基维生素D3；
25-OHVD2-IS为25-OHVD2的同位素内标25-羟基维生素D2-2H3；
25-OHVD3-IS为25-OHVD3的同位素内标25-羟基维生素D3-2H3。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选地技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为干血斑样本中的25-羟基维生素D2的HPLC色谱图，其中保留时间1.40min为25-羟基维生素D2峰。
图2为干血斑样本中的25-羟基维生素D3的HPLC色谱图，其中保留时间1.34min为25-羟基维生素D3峰。
具体实施方式
本发明人经过广泛而又深入的研究，开发了一种通过HPLC-MS联用检测干血斑25羟基维生素D的方法。在本发明所述的方法中，可采用干血斑样品，不受地域和时间限制，样本便于储存，且本发明所述的方法具有检测灵敏度和精密度高、重复性和稳定性好、特异性强、能区分其它体内物质产生的干扰和降低了假阳性率和假阴性率、样本用量低、且样品如干血斑经简单预处理即可进样检测、分析时间短和速度快、分析成本低，可用于快速大批量化和大通量检测。基于以上发现，发明人完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“25-OHVD”是指25-羟基维生素D。
如本文所用，术语“25-OHVD2”是指25-羟基维生素D2。
如本文所用，术语“25-OHVD3”是指25-羟基维生素D3。
如本文所用，术语“PTAD”是指4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮。
如本文所用，术语“高效液相色谱”简称HPLC。
如本文所用，术语“质谱”简称MS。
方法
本发明提供一种通过高效液相色谱与质谱联用检测样品中25-羟基维生素D的方法，所述的方法包括步骤：
将样品通过高效液相色谱与质谱联用检测25-羟基维生素D；
所述的高效液相色谱条件包括；
色谱柱：反相色谱柱；
流动相：流动相A+流动相B；流动相A为0.1-10mM甲酸铵水溶液，流动相B为0.1-10mM甲酸铵甲醇溶液；
流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：
其中，％A是指流动相A占流动相的体积百分比，％B是指流动相B占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(15-25)：(85-75)匀速渐变至(5-15)：(95-85)；在1.5-1.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(5-15)：(95-85)匀速渐变至(15-25)：(85-75)；在1.6-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为(15-25)：(85-75)。
本发明所述的方法可以为定量、定性、杂质检测方法。优选地，所述的方法为体外和/或辅助性方法。优选地，所述的方法为非诊断性方法。
在本发明所述的方法中，所述的反向色谱柱的填料优选为为C4-C18烷基硅烷键合硅胶，较佳地C12-C18烷基硅烷键合硅胶。
代表性地，所述的C4-C18烷基硅烷键合硅胶包括(但不限于)：C4烷基硅烷键合硅胶、C6烷基硅烷键合硅胶、C8烷基硅烷键合硅胶、C12烷基硅烷键合硅胶、C16烷基硅烷键合硅胶、C18烷基硅烷键合硅胶，或其组合。
典型地，所述的色谱柱为XBridge BEH C18。
在本发明的一个优选例中，流动相A为0.5-10mM甲酸铵水溶液，较佳地0.5-5mM甲酸铵水溶液，更佳地1-3mM甲酸铵水溶液。
在本发明的一个优选例中，流动相B为0.5-10mM甲酸铵甲醇溶液，较佳地0.5-5mM甲酸铵甲醇溶液，更佳地1-3mM甲酸铵甲醇溶液。
如本文所用，当甲酸铵水溶液含有浓度(如mM)限定时，指的是甲酸铵的浓度，例如在0.5-10mM甲酸铵水溶液中，甲酸铵的浓度为0.5-10mM。
如本文所用，当甲酸铵甲醇溶液含有浓度(如mM)限定时，指的是甲酸铵的浓度，例如在0.5-10mM甲酸铵甲醇溶液中，甲酸铵的浓度为0.5-10mM。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的pH。本发明在流动相A添加了甲酸铵，可以提高某些目标化合物的离子化效率的同时，使不同化合物的分离效果更好，较现有技术中采用LC-MS/MS方法相比，所检测25羟基维生素D的灵敏度高，样品前处理方法简易，无需蛋白沉淀处理，萃取吹干衍生化，样本用量小，分析时间短，2分钟检测完成。
在本发明的一个优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：
其中，％A是指流动相A占流动相的体积百分比，％B是指流动相B占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(18-22)：(82-78)匀速渐变至(8-12)：(92-88)；在1.5-1.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(8-12)：(92-88)匀速渐变至(18-22)：(82-78)；在1.6-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为(18-22)：(82-78)。
代表性地，所述的梯度洗脱的顺序为：
其中，％A是指流动相A占流动相的体积百分比，％B是指流动相B占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由20:80匀速渐变至10:90；在1.5-1.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至20:80；在1.6-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为20:80。
在另一优选例中，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：
流动相流速：0.1-1.2mL/min，较佳地0.2-1.0mL/min，更佳地0.2-0.8mL/min，更佳地0.3-0.6mL/min；
柱温：35-45℃，较佳地40℃；
进样体积：5～40μL，更佳地5-20μL；
运行时间：1-3min，更佳地2-3min，更佳地2-2.5min；和/或
所述色谱柱的规格为(2.1×50mm，2.5μm)。
在本发明所述的方法中，样品并没有特别的限定，优选所述的样品为血样。
代表性地，所述的血样为全血、血清、血浆或干血斑。
代表性地，所述的血样为人或非人哺乳动物(如猪、狗、猫、羊或牛)血样。
在另一优选例中，所述的样品为全血、血清、血浆或干血斑。
在本发明的一个优选例中，所述的25-羟基维生素D包括(但不限于)：25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3，或其组合。
在本发明的一个优选例中，依次通过高效液相色谱和质谱联用检测样品中的25-羟基维生素D。
优选地，所述的25-羟基维生素D依次经过HPLC和MS后进行检测。
在本发明的一个优选例中，所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D的荷质比，测定得到25-羟基维生素D的含量。
在本发明的一个优选例中，所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D与其对应内标的荷质比，根据内标法定量分析，得到25-羟基维生素D的含量。
在本发明的一个优选例中，所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与干血斑中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D的荷质比，测定得到25-羟基维生素D的含量。
在本发明的一个优选例中，所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与干血斑中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D与其对应内标的荷质比，根据内标法定量分析，得到25-羟基维生素D的含量。
在本发明的一个优选例中，所述的内标包括同位素内标。优选地，所述的内标为同位素内标。
代表性地，所述的同位素内标包括(但不限于)：25-羟基维生素D2-2H3、25-羟基维生素D3-2H3，或其组合。
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素D2的同位素内标为25-羟基维生素D2-2H3。
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素D3的同位素内标为25-羟基维生素D3-2H3。
在另一优选例中，通过标准曲线法或内标对比法测定样品中25-羟基维生素D的含量。
在本发明的一个优选例中，所述的干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径>10mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥4-12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
在本发明的一个优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥4-12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
在本发明的一个优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
在本发明的一个优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去。将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于-20℃条件下保存。
在本发明的一个优选例中，所述的干血斑经过处理后进样，所述的处理包括步骤：
向干血斑加入提取剂进行提取后，加入萃取液萃取，离心取上清液，吹干，加入衍生化试剂衍生后，加入终止反应试剂，吹干，复溶剂复溶。
在另一优选例中，所述提取剂包括含内标甲醇溶液。
在另一优选例中，所述萃取液包括正己烷。
在另一优选例中，所述衍生化试剂包括4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)。
在另一优选例中，所述终止反应试剂包括乙醇。
在另一优选例中，所述复溶剂包括甲醇水溶液。
在另一优选例中，所述复溶剂包括30-80％甲醇水溶液。
在另一优选例中，所述的干血斑经过处理后进样，所述的处理包括步骤：
用打孔器取干血斑样本至96孔深孔样品板，向干血斑加入含内标混合液的提取剂，超声提取，样本中加入萃取液，涡旋离心后取上清液，氮气吹干，加入衍生化试剂，室温条件下衍生，加入终止反应试剂，氮气吹干，复溶剂复溶。
在另一优选例中，所述经过预处理的干血斑按照如下方法制备：用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔样品板，向干血斑加入200μL含内标甲醇溶液，超声30min提取，样本中加入1mL正己烷，涡旋5min后，在14000～15000r/min，4～20℃离心5～10min后取上清液，氮气吹干，加入50μL衍生化试剂PTAD，室温条件下衍生1小时，加入100μL乙醇终止反应，氮气吹干，50％甲醇复溶。
在另一优选例中，所述含内标甲醇溶液按照如下方法制备：
称取各同位素内标物25-羟基维生素D2-2H3和25-羟基维生素D3-2H3，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为0.1mg/mL、0.1mg/mL的同位素内标母液；
上述各同位素内标母液再以纯甲醇溶液配制成包含2μg/mL 25-羟基维生素D2-2H3和2μg/mL 25-羟基维生素D3-2H3有同位素内标IS溶液；
取200μL同位素内标IS溶液，加入甲醇6mL，混合均匀即得含内标甲醇溶液。
在另一优选例中，所述衍生化试剂PTAD如下方法制备：
称取PTAD2mg至容量瓶中，加入5mL乙腈完全溶解，用乙腈稀释至10mL，即得衍生化试剂PTAD。
在另一优选例中，所述标准品按照如下方法制备：
称取各待测物标准品，包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3；
上述各标准品母液再以用甲醇溶液配制成包含有2μg/mL25-羟基维生素D2和4μg/mL25-羟基维生素D3混合标准WS07溶液；
将上述混合标液WS07溶液以空白替代基质配制成七个不同浓度点的校准品干血斑，所述校准品干血斑的7个浓度点为：
25-羟基维生素D2的浓度依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL；
25-羟基维生素D3的浓度依次为4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL。
在另一优选例中，空白替代基质干血斑为牛全血。
在本发明的一个优选例中，在所述的方法中，通过内标法测定样品中的25-羟基维生素D的含量。
在另一优选例中，在所述的方法中，先建立25-羟基维生素D(优选为标准品)峰面积与内标峰面积的比值和25-羟基维生素D的浓度的标准曲线，再通过内标法测定样品中的25-羟基维生素D的含量。
在另一优选例中，25-羟基维生素D(优选为标准品)峰面积与内标峰信号的比值为纵坐标，25-羟基维生素D的浓度为横坐标。
在另一优选例中，对于25-羟基维生素D2，标准曲线的线性范围为2-200ng/mL。
在另一优选例中，对于25-羟基维生素D3，标准曲线的线性范围为4-200ng/mL。
在本发明的一个优选例中，所述的质谱的条件为：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正离子模式扫描；喷雾电压为1.5kV(ESI+)；离子源温度为150℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为900L/h，锥孔气流速为200L/h。
在另一优选例中，所述的质谱同时检测25-羟基维生素D和任选地25-羟基维生素D相对应的内标。
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素D和任选地25-羟基维生素D相对应内标的质谱采集参数如下所示：
其中：25-OHVD2为25-羟基维生素D2；
25-OHVD3为25-羟基维生素D3；
25-OHVD2-IS为25-OHVD2的同位素内标25-羟基维生素D2-2H3；
25-OHVD3-IS为25-OHVD3的同位素内标25-羟基维生素D3-2H3。
本发明的主要优点包括：
1.本发明提供一种通过HPLC-MS联用检测干血斑25羟基维生素D的方法，采用干血斑采样方法，不受地域和时间限制，样本便于储存，且拥有很好的生物安全性。
2.本发明所述的HPLC-MS联用检测25羟基维生素D的方法具有检测灵敏度和精密度高、重复性和稳定性好、特异性强、能区分其它体内物质产生的干扰和降低了假阳性率和假阴性率、样本用量低、且样品如干血斑经简单预处理即可进样检测、分析时间短和速度快、分析成本低，可用于快速大批量化和大通量检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
实施例1
1.实验材料与仪器
1.1材料
样本：人全血样本。
(1)仪器：Xevo TQ-D三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；HPLC I-Class高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；H1850R高速台式离心机(湖南湘仪)；多管涡旋混合仪(MTV-100，杭州奥盛)；氮吹浓缩仪(Arica V96，上海析维)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：HPLC级甲醇(Fisher，美国)；蒸馏水(屈臣氏，中国)；HPLC级乙腈(默克，美国)；PTAD(麦克林，中国)；正己烷(国药，中国)；色谱柱：XBridge BEH C18，2.1×50mm，2.5μm((Waters)。
(3)标准品：25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3及对应的同位素内标25-羟基维生素D2-2H3和25-羟基维生素D3-2H3购自甄准生物公司。
(4)质控品：含有25-羟基维生素D的空白干血斑，分别为QC(LLOQ)、QC(LQC)、QC(MQC)、QC(HQC)。
2.液质方法
2.1高效液相色谱方法：
流动相：流动相A+流动相B；流动相A为2mM甲酸铵水溶液，流动相B为2mM甲酸铵甲醇溶液；
梯度洗脱：流动相梯度洗脱见表1；
色谱柱：C18烷基硅烷键合硅胶柱(XBridge BEH C18，2.1×50mm，2.5μm(Waters))
流速：0.45mL/min；
柱温：40℃；
进样体积：10μL；
表1：高效液相色谱梯度洗脱条件
备注：％A是指流动相A占流动相的体积百分比，％B是指流动相B占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由20:80匀速渐变至10:90；在1.5-1.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至20:80；在1.6-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为20:80。
2.2质谱方法：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正离子模式扫描；喷雾电压为1.5kV(ESI+)；离子源温度为150℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为900L/h，锥孔气流速为200L/h；同时监测25-羟基维生素D及其相对应同位素内标化合物，各目标待测物的质谱采集参数见表2。
表2：质谱参数
其中：25-OHVD2-1为25-羟基维生素D2；
25-OHVD3-1为25-羟基维生素D3；
25-OHVD2-IS为25-OHVD2的同位素内标25-羟基维生素D2-2H3；
25-OHVD3-IS为25-OHVD3的同位素内标25-羟基维生素D3-2H3；
3.实施操作
步骤101：标准品配制：各称取1～2mg 25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3标准品至容量瓶，分别加入纯甲醇至完全溶解，分别制成浓度为100μg/mL和100μg/mL的标准品母液；再将各标准品母液用纯甲醇配制成混合标准WS07溶液(详见表3)，混合均匀备用。
表3混合标准液WS07的配制
步骤102：以WS07作为第一个高浓度点，再用甲醇逐级稀释至WS01(详见表4)，各标曲点的浓度如表4中所列。
表4：标曲的配制及浓度
步骤103：将上述混合标液标曲溶液以空白替代基质配制成7个不同浓度点的校准品样品,将校准品样品用玻璃毛细管点样法收集于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内(血斑直径＝12mm)，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于-20℃条件下保存，制备成干血斑样品，各校准品浓度如表5所示。
表5校准曲线的配制及浓度
步骤104：QC的制备：各称取1～2mg 25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3标准品至容量瓶，分别加入纯甲醇至完全溶解，100μg/mL和100μg/mL的标准品母液；再将各标准品母液用纯甲醇配制成混合标准WS07溶液(详见表6)，混合均匀备用。
表6混合标准液WS07的配制
步骤107：用纯甲醇按照表7，将WS07稀释配制成QC(LLOQ)、QC(LQC)、QC(MQC)、QC(HQC)。
表7 QC溶液的配制及浓度
步骤108；将上述混合标液QC溶液以空白替代基质配制成4个不同浓度点的QC样品,将QC样品用玻璃毛细管点样法收集于Whatman 903号滤纸片的采样圆圈内(血斑直径＝12mm)，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于-20℃条件下保存，制备成干血斑样品，各分析物的QC浓度如表8所示。
表8 QC样品的配制及浓度
步骤109：混合内标溶液按照如下方法制备：称取1～2mg各同位素内标物25-羟基维生素D2-2H3和25-羟基维生素D3-2H3于10mL棕色容量瓶中，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为0.1mg/mL和0.1mg/mL的同位素内标母液。上述各同位素内标母液再以纯甲醇溶液配制成包含有2μg/mL25-羟基维生素D2-2H3和2μg/mL 25-羟基维生素D3-2H3同位素内标IS溶液；
步骤110：含内标甲醇溶液的配制，取上述200μL同位素内标IS溶液，加入6mL甲醇，混合均匀，即得含内标甲醇溶液。
步骤111：PTAD衍生化试剂的配制：称取PTAD2mg至容量瓶加入5mL乙腈完全溶解，用乙腈稀释至10mL,混匀，即得衍生化试PTAD。
步骤112：校准曲线样品处理：取校准曲线干血斑样本，用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔板板，向干血斑加入200μL含内标甲醇溶液，室温超声30min提取，样本中加入1mL正己烷，涡旋5min，4℃12000rpm离心5min后取上清液，氮气吹干，加入50μL0.2mg/mLPTAD衍生化试剂，室温条件下衍生1小时，加入100μL乙醇终止反应，氮气吹干，100μL60％甲醇复溶，10μL进样。
步骤113：QC样品处理：取QC干血斑样本，用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔板板，向干血斑加入200μL含内标甲醇溶液，室温超声30min提取，样本中加入1mL正己烷，涡旋5min，4℃12000rpm离心5min后取上清液，氮气吹干，加入50μL0.2mg/mLPTAD衍生化试剂，室温条件下衍生1小时，加入100μL乙醇终止反应，氮气吹干，100μL60％甲醇复溶，10μL进样。
步骤114：干血斑样品处理：取干血斑样本，用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔板板，向干血斑加入200μL含内标甲醇溶液，室温超声30min提取，样本中加入1mL正己烷，涡旋5min，4℃12000rpm离心5min后取上清液，氮气吹干，加入50μL0.2mg/mLPTAD衍生化试剂，室温条件下衍生1小时，加入100μL乙醇终止反应，氮气吹干，100μL60％甲醇复溶，10μL进样。
步骤115：计算结果：采用MassLynx进行数据处理，用线性回归加权1/x或1/x2生成标准曲线，其中x为维生素的加标浓度，y为维生素峰面积与内标峰信号的比值。
4.方法验证：
图1为干血斑样本中的25-羟基维生素D2的HPLC色谱图；图2为干血斑样本中的25-羟基维生素D3的HPLC色谱图。从图1和图2中可以看出，在检测方法中，25-羟基维生素D的标准品与干血斑样品的峰形对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测。
4.1校准曲线
采用同位素内标定量法，采用MassLynx进行数据处理，用线性回归加权1/x或1/x2生成标准曲线，其中x为维生素的加标浓度，y为维生素峰面积与内标峰面积的比值，建立校准曲线，并计算出干血斑中25-羟基维生素D待测物的浓度。25-羟基维生素D在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.997以上，详见表9。
表9 25-羟基维生素D的线性范围
4.2加标回收率考察：随机选取一例干血斑样品，其中1个不加标准品，其它2个分别加入两个浓度的QC标准品，以相同步骤重复处理并测定6次，以同位素内标法定量测定25-羟基维生素D的浓度，计算回收率结果，重复三个批次，见表10。结果显示，干血斑25-羟基维生素D的加标回收率结果85％-115％之间，均满足要求。
表10干血斑25-羟基维生素D的加标回收率结果(单位ng/mL)
4.3准确度精密度试验：取干血斑质控样本一天内重复处理6批，处理3天，以同位素内标法定量测定9种25-羟基维生素D的浓度，连续三日统计批内和批间精密度和准确度，计算结果见表11，表12。结果显示：批内/间准确度结果在85％-115％之间，RSD值小于15％，符合要求。
表11：批内精密度和准确度(n＝6)
表12：批间精密度和准确度(n＝18)
5.结论
本实施例采用HPLC-MS方法测定了人干血斑中的25-羟基维生素D，所述的方法具有灵敏度高，特异性强等特点。采用同位素内标法定量能极大的消除基质效应和其他组分的干扰，不受样品处理过程影响，能够达到准确定量。同时采用液液萃取和衍生化的方法能够用较少的血液样本，快速高效的进行样品检测，处理方便。
考察了25-羟基维生素D在干血斑中三日的加标回收率，均在85％-115％之间，符合要求。同时考察了准确度和精密度，方法的重现性结果表明，干血斑中的25-羟基维生素D的日内精密度，日间精密度，RSD小于15％，准确度在85％-115％之间，方法的重现性良好。
本发明的方法与其它LC-MS/MS方法相比，灵敏度较高，样本用量小，2分钟之内可完成检测25-羟基维生素D，可用于临床上干血斑25-羟基维生素D的检测。
应当理解的是，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种通过高效液相色谱与质谱联用检测样品中25-羟基维生素D的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
将样品通过高效液相色谱与质谱联用检测25-羟基维生素D；
所述的高效液相色谱条件包括；
色谱柱：反相色谱柱；
流动相：流动相A+流动相B；流动相A为0.1-10mM甲酸铵水溶液，流动相B为0.1-10mM甲酸铵甲醇溶液；
流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：
其中，％A是指流动相A占流动相的体积百分比，％B是指流动相B占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(15-25)：(85-75)匀速渐变至(5-15)：(95-85)；在1.5-1.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由(5-15)：(95-85)匀速渐变至(15-25)：(85-75)；在1.6-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为(15-25)：(85-75)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相A为0.5-10mM甲酸铵水溶液，较佳地0.5-5mM甲酸铵水溶液，更佳地1-3mM甲酸铵水溶液；和/或
流动相B为0.5-10mM甲酸铵甲醇溶液，较佳地0.5-5mM甲酸铵甲醇溶液，更佳地1-3mM甲酸铵甲醇溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脱的顺序为：
其中，％A是指流动相A占流动相的体积百分比，％B是指流动相B占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由20:80匀速渐变至10:90；在1.5-1.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至20:80；在1.6-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为20:80。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：
流动相流速：0.1-1.2mL/min，较佳地0.2-1.0mL/min，更佳地0.2-0.8mL/min，更佳地0.3-0.6mL/min；
柱温：35-45℃，较佳地40℃；
进样体积：5～40μL，更佳地5-20μL；
运行时间：1-3min，更佳地2-3min，更佳地2-2.5min；和/或
所述色谱柱的规格为(2.1×50mm，2.5μm)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品为全血、血清、血浆或干血斑。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的25-羟基维生素D选自下组：25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3，或其组合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D的荷质比，测定得到25-羟基维生素D的含量；或
所述的方法包括：
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素D与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素D与其对应内标的荷质比，根据内标法定量分析，得到25-羟基维生素D的含量。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的内标包括同位素内标。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的同位素内标选自下组：25-羟基维生素D2-2H3、25-羟基维生素D3-2H3，或其组合。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的质谱的条件为：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正离子模式扫描；喷雾电压为1.5kV(ESI+)；离子源温度为150℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为900L/h，锥孔气流速为200L/h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011451230.1A CN114609261A (zh) | 2020-12-09 | 2020-12-09 | 一种hplc-ms联用检测干血斑中25-羟基维生素d的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011451230.1A CN114609261A (zh) | 2020-12-09 | 2020-12-09 | 一种hplc-ms联用检测干血斑中25-羟基维生素d的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114609261A true CN114609261A (zh) | 2022-06-10 |
Family
ID=81855934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011451230.1A Pending CN114609261A (zh) | 2020-12-09 | 2020-12-09 | 一种hplc-ms联用检测干血斑中25-羟基维生素d的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114609261A (zh) |
-
2020
- 2020-12-09 CN CN202011451230.1A patent/CN114609261A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111366671A (zh) | 同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法 | |
| CN112611827B (zh) | 测3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法 | |
| CN113588804B (zh) | 一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒 | |
| CN113917015A (zh) | 一种同时检测人血清中多种维生素的检测方法 | |
| CN111812218A (zh) | 一种同时检测血清中多种抗精神病药物浓度的方法 | |
| CN111175405A (zh) | 一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法及其应用 | |
| CN109900821A (zh) | 一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的方法和试剂盒 | |
| CN113049719A (zh) | 一种检测游离睾酮的方法及试剂盒 | |
| CN115902048A (zh) | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法 | |
| CN114414696B (zh) | 一种测定干血片中多种雌激素的试剂盒及方法 | |
| CN113341027A (zh) | 高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法及试剂盒 | |
| CN113009036A (zh) | 一种检测性激素的试剂盒、性激素样品前处理方法及同时检测多种性激素的方法 | |
| CN111912920A (zh) | 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中霉酚酸及其代谢物的方法 | |
| CN114609261A (zh) | 一种hplc-ms联用检测干血斑中25-羟基维生素d的方法 | |
| CN114755321A (zh) | 血清中脂溶性维生素的检测方法 | |
| CN114624361A (zh) | 同时测定人血浆中别嘌醇和氧别嘌醇浓度的方法 | |
| CN112213417A (zh) | 一种检测干血斑中霉酚酸药物浓度的试剂盒及检测方法 | |
| CN111579690A (zh) | 一种利用霉酚酸-d3作为内标物测定生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其使用方法 | |
| CN112485340A (zh) | 一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法 | |
| CN116026971B (zh) | 一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒及检测方法 | |
| CN113671064B (zh) | 一种定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法 | |
| CN115219616B (zh) | 基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质包括辅酶q10浓度的方法 | |
| CN114563504B (zh) | 一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法及试剂盒 | |
| CN118311161A (zh) | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒 | |
| CN109946408B (zh) | 测定人血浆中连翘苷及代谢物苷元葡萄糖醛酸结合物、苷元硫酸结合物的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |