CN118311161A - 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒 - Google Patents
甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118311161A CN118311161A CN202310026303.XA CN202310026303A CN118311161A CN 118311161 A CN118311161 A CN 118311161A CN 202310026303 A CN202310026303 A CN 202310026303A CN 118311161 A CN118311161 A CN 118311161A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- vitamin
- standard
- methanol
- mixed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 title claims abstract description 132
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 title claims abstract description 132
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 title claims abstract description 132
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 title claims abstract description 132
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 88
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 23
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 121
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims abstract description 70
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 69
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims abstract description 69
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 53
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims abstract description 47
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims abstract description 47
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims abstract description 47
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 229930003761 Vitamin B9 Natural products 0.000 claims abstract description 38
- 239000011727 vitamin B9 Substances 0.000 claims abstract description 38
- 235000019159 vitamin B9 Nutrition 0.000 claims abstract description 38
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 244
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 141
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 64
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 43
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 35
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 32
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 30
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 29
- PVNIIMVLHYAWGP-RHQRLBAQSA-N nicotinic-d4 acid Chemical compound [2H]C1=NC([2H])=C(C(O)=O)C([2H])=C1[2H] PVNIIMVLHYAWGP-RHQRLBAQSA-N 0.000 claims description 23
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 20
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 19
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 18
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 17
- SVWLIIFHXFGESG-UHFFFAOYSA-N formic acid;methanol Chemical compound OC.OC=O SVWLIIFHXFGESG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 16
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 12
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 8
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 8
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 claims description 7
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 claims description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 7
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 6
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- -1 divided into low Substances 0.000 claims description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 7
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 5
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 abstract description 5
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 36
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 21
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 6
- 229930003471 Vitamin B2 Natural products 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 6
- 235000019164 vitamin B2 Nutrition 0.000 description 6
- 239000011716 vitamin B2 Substances 0.000 description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 5
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 4
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- FRBUNLLUASHNDJ-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl)hydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O FRBUNLLUASHNDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 206010004906 Biotin deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010006326 Breath odour Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000463291 Elga Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000032139 Halitosis Diseases 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 229930003537 Vitamin B3 Natural products 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 1
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N formic acid;hydrate Chemical compound O.OC=O HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007160 gastrointestinal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N nicotinic acid amide Natural products NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 235000019160 vitamin B3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011708 vitamin B3 Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种甲基衍生化‑高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，包括维生素B7、维生素B9和烟酸，将血清样本与所有待测物的混合内标溶液混合，仅仅采用蛋白沉淀和衍生化前处理的方法，衍生化反应简单，灵敏度高，样本用量小，特异性强，5分钟之内可同时检测3种水溶性维生素，可用于临床上血清水溶性维生素的诊断及健康评估。
Description
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒。
背景技术
水溶性维生素是能在水中溶解的一组维生素，常是辅酶或辅基的组成部分，其中包括在酶的催化中起着重要作用的B族维生素。例如，维生素包括维生素B7(Biotin，VB7)、维生素B9(folic acid，VB9)和烟酸(Nicotinic acid，NA)。
维生素B7又名维生素H、生物素或辅酶R，是一种水溶性维生素，属于B族维生素，它是多种羟化酶的辅基，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，也是维持正常成长、发育及健康必要的营养素。生物素缺乏的主要表现多以皮肤症状为主，可见皮炎、湿疹，厌食和轻度贫血、脱发。糖尿病患者可以通过生物素改善血糖的调节。
烟酸又称为维生素B3，有助于促进消化系统健康，改善肠胃功能障碍和腹泻；有助于降低血液中胆固醇和甘油三酯水平；医学上还用于改善口腔炎，防止口臭。
维生素B9又叫叶酸，是一种重要的维生素，它与B12一起有利于血红细胞形成，减少贫血。孕妇缺乏叶酸会导致胎儿的脊柱裂和无脑畸形。此外，叶酸还有助于保持血液正常的同型半胱氨酸水平(衡量心脏病的重要指标)，减少心脏病的发生。
目前，有关水溶性维生素的检测方法有很多种，除了传统的微生物检测法、ELISA、放射免疫分析方法，液相色谱紫外检测法(LC-UV)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)也越来越多地应用于维生素的检测中。但在生物样本检测中，一些含羧酸基团的水溶性维生素，常因基质效应和高背景噪音导致灵敏度差而不能满足临床的检测需求。通过前期的技术尝试，ESI电离条件下，羧酸基团一般易于去质子化而带负电荷，但维生素B7无论是在正离子还是在负离子检测模式下灵敏度都较差。
也有文献使用2-硝基苯肼对VB7进行衍生反应进而提高其检测灵敏度(Journalof Chromatography A,1142(2007)231-235)，但该衍生反应比较复杂，用到的试剂种类较多，而大量试剂的加入必然会稀释待测物的检测浓度，对痕量检测不利。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒。
本发明的另一目的是提供上述试剂盒在利用甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，
所述水溶性维生素分别为：维生素B7(VB7)、维生素B9(VB9)和烟酸(NA)；
上述水溶性维生素对应的同位素内标物分别为：维生素B7-d4(VB7-d4)、维生素B9-d4(VB9-d4)和烟酸-d4(NA-d4)；
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)电解质浓缩液A：40～60％甲酸水溶液；
(2)混合标准S0溶液：
包含有50ng/mL维生素B7、200ng/mL维生素B9和2000ng/mL烟酸的甲醇水溶液；
(3)内标SI溶液：
包含有5ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B9-d4和200ng/mL烟酸-d4的甲醇水溶液；
(4)衍生化试剂：盐酸与甲醇的混合溶液；
(5)中和液：氨水溶液；
(6)质控品：含有3种水溶性维生素的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)和QC(H)，其中：
QC(L)中包含：0.025ng/mL维生素B7(VB7)、0.1ng/mL维生素B2(VB7)和1ng/mL烟酸(NA)；
QC(M)中包含：0.25ng/mL维生素B7(VB7)、1ng/mL维生素B2(VB7)和10ng/mL烟酸(NA)；
QC(H)中包含：2.5ng/mL维生素B7(VB7)、10ng/mL维生素B2(VB7)和100ng/mL烟酸(NA)。
在一种优选方案中，电解质浓缩液A为50％甲酸水溶液。试剂盒在使用时将高体积浓度的甲酸水溶液稀释成较低体积浓度的洗脱液A，例如，稀释成0.01～0.5％甲酸水溶液作为洗脱液A；优选地，稀释成0.05～0.15％甲酸水溶液作为洗脱液A；更优选地，稀释成0.1％甲酸水溶液作为洗脱液A。
在一种优选方案中，本发明提及的衍生化试剂为体积比为1:4～10的盐酸与甲醇的混合溶液，优选为体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液。
在一种优选方案中，本发明提及的中和液为40～80％氨水溶液，优选为50％氨水溶液。
在一种优选方案中，本发明提及的空白血清基质为0.05～0.2％甲酸-甲醇溶液；优选为0.1％甲酸-甲醇溶液。
本发明提及的混合标准S0溶液按照如下方法制备：称取各待测物标准品，包括维生素B7、维生素B9和烟酸，分别加入甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为25μg/mL维生素B7、100μg/mL维生素B9和100μg/mL烟酸的标准品储备液；
上述各标准品储备液再以甲醇水溶液配制成包含有50ng/mL维生素B7、200ng/mL维生素B9和2000ng/mL烟酸的混合标准S0溶液。
本发明提及的内标SI溶液按照如下方法制备：称取各同位素内标物，维生素B7-d4、维生素B9-d4和烟酸-d4，分别加入甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为1μg/mL维生素B7-d4、10μg/mL维生素B9-d4和10μg/mL烟酸-d4的同位素储备液；
上述各同位素内标储备液再以甲醇水溶液配制成包含有5ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B9-d4和200ng/mL烟酸-d4的同位素混合内标SI溶液。
在配制混合标准S0溶液和内标SI溶液时，所述甲醇水溶液为60～90％甲醇水溶液，优选为80％甲醇水溶液。
对于本发明而言，甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒中，血清为人或动物血清。
在一种优选方案中，甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，包含如下试剂：
(1)电解质浓缩液A：50％甲酸水溶液；
(2)混合标准S0溶液：
称取各待测物标准品，包括维生素B7、维生素B9和烟酸，分别加入60～90％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为25μg/mL维生素B7、100μg/mL维生素B9和100μg/mL烟酸的标准品储备液；
上述各标准品储备液再以60～90％甲醇水溶液配制成包含有50ng/mL维生素B7、200ng/mL维生素B9和2000ng/mL烟酸的混合标准S0溶液；
(3)内标SI溶液：
称取各同位素内标物，维生素B7-d4、维生素B9-d4和烟酸-d4，分别加入60～90％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为1μg/mL维生素B7-d4、10μg/mL维生素B9-d4和10μg/mL烟酸-d4的同位素储备液；
上述各同位素内标储备液再以60～90％甲醇水溶液配制成包含有5ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B9-d4和200ng/mL烟酸-d4的同位素混合内标SI溶液；
(4)衍生化试剂：体积比为1:4～10的盐酸与甲醇的混合溶液；
(5)中和液：40～80％氨水溶液
(6)质控品：取上述混合标准S0溶液以0.05～0.2％甲酸-甲醇溶液作为空白血清基质配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中：
QC(L)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至2000倍(1:1999)；
QC(M)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至200倍(1:199)；
QC(H)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至20倍(1:19)。
在一种更优选方案中，甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，包含如下试剂：
(1)电解质浓缩液A：50％甲酸水溶液；
(2)混合标准S0溶液：
称取各待测物标准品，包括维生素B7、维生素B9和烟酸，分别加入80％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为25μg/mL维生素B7、100μg/mL维生素B9和100μg/mL烟酸的标准品储备液；
上述各标准品储备液再以80％甲醇水溶液配制成包含有50ng/mL维生素B7、200ng/mL维生素B9和2000ng/mL烟酸的混合标准S0溶液；
(3)内标SI溶液：
称取各同位素内标物，维生素B7-d4、维生素B9-d4和烟酸-d4，分别加入80％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为1μg/mL维生素B7-d4、10μg/mL维生素B9-d4和10μg/mL烟酸-d4的同位素储备液；
上述各同位素内标储备液再以80％甲醇水溶液配制成包含有5ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B9-d4和200ng/mL烟酸-d4的同位素混合内标SI溶液；
(4)衍生化试剂：体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液；
(5)中和液：50％氨水溶液；
(6)质控品：取上述混合标准S0溶液以0.1％甲酸-甲醇溶液作为空白血清基质配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中：
QC(L)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至2000倍；
QC(M)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至200倍；
QC(H)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至20倍。
具体地，质控品中3种水溶性维生素对应的QC(L)、QC(M)、QC(H)浓度见表1；
表1质控品对应浓度(单位ng/mL)
| 化合物 | QC(L) | QC(M) | QC(H) |
| VB7 | 0.025 | 0.25 | 2.5 |
| VB9 | 0.1 | 1 | 10 |
| NA | 1 | 10 | 100 |
在一种优选方案中，混合标准S0溶液按照如下方法制备：
准确称量3-5mg左右各标准品粉末于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用80％甲醇水溶液配制成下表中标准品储备液，再将各浓度的储备液用80％甲醇水溶液配制成混合标准S0溶液(详见表2)，混合均匀备用。
表2混合标准液S0的配制
本发明的试剂盒在使用时，将混合标准S0溶液以空白血清基质溶液配制成八个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的八个浓度点为：
维生素B7的浓度依次为0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.25ng/mL和2.5ng/mL；
维生素B9的浓度依次为0.04ng/mL、0.08ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL；
烟酸的浓度依次为0.4ng/mL、0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL。
其中，空白血清基质为0.05～0.2％甲酸-甲醇溶液；优选为0.1％甲酸-甲醇溶液。
在一种优选方案中，校准品溶液的配制过程如下：
取20μL混合标准液S0至1.5mL离心管中，加入380μL 0.1％甲酸-甲醇溶液得到第一个高值浓度点S8，再逐级稀释至S1(详见表3)，各标曲点的浓度如表3中所列。
表3标曲的配制及浓度
(注：浓度单位均为ng/mL)
在一种优选方案中，内标SI溶液按照如下方法制备：
准确称量3-5mg左右各同位素内标物5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用80％甲醇水溶液配制成下表中同位素储备液，再将各浓度的储备液用80％甲醇水溶液配制成同位素混合内标SI溶液(详见表4)。
表4混合内标SI溶液的配制
本发明的试剂盒在使用时，将内标SI溶液加入甲醇稀释成混合内标工作溶液，具体配制方法如下：取100μL内标SI溶液，加入900μL甲醇，混合均匀即为混合内标工作液。其中，混合内标工作液中包含有0.5ng/mL维生素B7-d4、2ng/mL维生素B9-d4和20ng/mL烟酸-d4。
本发明提及的甲醇水溶液或甲酸-甲醇水溶液的浓度一般指体积浓度。
上述试剂盒在利用甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，采用高效液相色谱串联质谱检测经过预处理的血清中的水溶性维生素，利用高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物与其对应同位素内标的质荷比的响应，使用同位素内标法定量，分别计算出3种水溶性维生素的含量，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：0.01～0.5％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱为：Agilent EC C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至30:70；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-3.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至80:20；在3.1-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离模式下，采用多反应监测进行正负切换扫描；毛细管电压为3.5kV，喷嘴电压为100V；干燥气温度为300℃，鞘气温度为325℃，干燥气流速为7L/min，鞘气流速为11L/min，雾化气压力30psi；同时监测3种水溶性维生素及其对应同位素内标。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.01～0.5％甲酸水溶液-甲醇作为流动相，色谱柱为Agilent EC C18，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低，5.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。在一种优选方案中，色谱柱的长度为50mm，直径为3.0mm，填料粒径为2.7μm。例如，色谱柱为Agilent EC C18(2.7μm,3.0mm*50mm)。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测水溶性维生素的方法，仅仅采用蛋白沉淀和衍生化前处理的方法，衍生化反应简单，灵敏度更高，样本用量小，特异性强、成本低，5分钟之内可同时检测3种水溶性维生素。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.05～0.15％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用维生素B7(VB7)、维生素B9(VB9)和烟酸(NA)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中水溶性维生素时的重现性、准确度均较好。
在一种优选方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.4mL/min。
进一步地，柱温为35～45℃，优选为40℃。
进一步地，进样体积为1～10μL，优选为2μL。
在一种优选方案中，采用甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱为：Agilent EC C18(2.7μm，3.0mm*50mm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至30:70；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-3.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至80:20；在3.1-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20；具体梯度洗脱方式，见表5，流速为0.4mL/min，柱温为40℃，进样体积为2μL。
表5流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负切换扫描；毛细管电压为3.5kV，喷嘴电压为100V；干燥气温度为300℃，鞘气温度为325℃，干燥气流速为7L/min，鞘气流速为11L/min，雾化气压力30psi；同时监测3种水溶性维生素及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表6。
表6水溶性维生素质谱参数
对于本发明而言，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：向血清加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，振荡离心后取上清液经氮气吹干，向其中加入衍生化试剂，在避光的条件下于40-80℃进行衍生反应10-60min，所得反应液冷却至室温，加入氨水溶液进行中和，再次振荡离心后，取上清液待进样。
其中，蛋白质沉淀剂为甲醇或乙腈，优选为甲醇。
进一步地，衍生化试剂为盐酸与甲醇的混合溶液，优选地，在混合溶液中盐酸与甲醇的体积比为1:4～10；更优选地，在混合溶液中盐酸与甲醇的体积比为1:9。
进一步地，氨水溶液为40～80％氨水溶液，优选为50％氨水溶液。
在一种优选方案中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后，加入180μL甲醇，振荡后，在转速为1400～15000r/min，4℃的条件下离心4～10min；取150μL上清液在37℃氮气下吹干，向其中加入100μL体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液，涡旋混匀后，在避光的条件下于50℃进行衍生反应20min，所得反应液冷却至室温，加入20μL 50％氨水进行复溶，再次振荡后，在转速为1400～15000r/min，4℃的条件下离心1～5min，取上清液待进样。
在一种更优选方案中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后5s，加入180μL甲醇，振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心5min；取150μL上清液在37℃氮气下吹干，向其中加入100μL体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液，涡旋混匀5s后，在避光的条件下于50℃进行衍生反应20min，所得反应液冷却至室温，加入20μL 50％氨水进行中和，再次振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心3min，取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量2μL。
本发明建立了一种简单、高效且可靠的血清中水溶性维生素的检测方法，相比现有技术，更能满足临床应用的需求。
在一种方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：
称取各同位素内标物，维生素B7-d4、维生素B9-d4和烟酸-d4，分别加入80％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为1μg/mL维生素B7-d4、10μg/mL维生素B9-d4和10μg/mL烟酸-d4的同位素储备液；
上述各同位素内标储备液再以80％甲醇水溶液配制成包含有5ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B9-d4和200ng/mL烟酸-d4的同位素混合内标SI溶液；
取100μL SI溶液，加入900μL甲醇，混合均匀得混合内标工作液。
在一种方案中，校准品溶液按照如下方法制备：
称取各待测物标准品，包括维生素B7、维生素B9和烟酸，分别加入80％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为25μg/mL维生素B7、100μg/mL维生素B9和100μg/mL烟酸的标准品储备液；
上述各标准品储备液再以80％甲醇水溶液配制成包含有50ng/mL维生素B7、200ng/mL维生素B9和2000ng/mL烟酸的混合标准S0溶液；
将上述混合标准S0溶液以0.1％甲酸-甲醇溶液配制成八个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的八个浓度点为：
维生素B7的浓度依次为0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.25ng/mL和2.5ng/mL；
维生素B9的浓度依次为0.04ng/mL、0.08ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL；
烟酸的浓度依次为0.4ng/mL、0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL。
每个浓度点样品取50μL，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后5s，加入180μL甲醇，振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心5min；取150μL上清液在37℃氮气下吹干，向其中加入100μL体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液，涡旋混匀5s后，在避光的条件下于50℃进行衍生反应20min，所得反应液冷却至室温，加入20μL 50％氨水进行中和，再次振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心3min，取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量2μL。
本发明还包括制备质控品，所述质控品为含有3种水溶性维生素的空白血清基质溶液(0.1％甲酸-甲醇溶液)，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。其中，
QC(L)中包含：0.025ng/mL维生素B7(VB7)、0.1ng/mL维生素B2(VB2)和1ng/mL烟酸(NA)；
QC(M)中包含：0.25ng/mL维生素B7(VB7)、1ng/mL维生素B2(VB2)和10ng/mL烟酸(NA)；
QC(H)中包含：2.5ng/mL维生素B7(VB7)、10ng/mL维生素B2(VB2)和100ng/mL烟酸(NA)。
采用本发明的技术方案，优势如下:
采用本发明试剂盒检测血清中的3种水溶性维生素，包括维生素B7、维生素B9和烟酸，将血清样本与所有待测物的混合内标溶液混合，仅仅采用蛋白沉淀和衍生化前处理的方法，衍生化反应简单，灵敏度高，样本用量小，特异性强，5分钟之内可同时检测3种水溶性维生素，可用于临床上血清水溶性维生素的诊断及健康评估。
附图说明
图1为3种水溶性维生素标准品的选择离子流色谱图；
图2为血清样本中3种水溶性维生素的选择离子流色谱图。
具体实施方式
为了能更清楚地理解本发明的技术方案，通过以下实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
分析试剂盒中各组分见表7。
表7水溶性维生素分析试剂盒组分(100人份)
实施例2：
一、实验材料与仪器
1.材料
方法学研究实验的样本来自于武汉亚洲心脏病医院2022年6月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Qlife Lab 9000plus三重四极杆质谱仪(品生医疗)；Qlife Lab 9000超高效液相色谱系统(配G7167A自动进样器，品生医疗)；系统工作软件为MS quantitativeanalysis 10.0；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；AR级盐酸(36.0～38.0％，国药)；痕量级氨水(Fisher，美国)；色谱柱Agilent EC C18,2.7μm，3.0mm*50mm(美国安捷伦公司)。
(3)标准品：VB7、VB9和NA标准品均购自Sigma公司，对应的同位素内标购自TRC公司。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：甲醇。色谱柱为Agilent ECC18，2.7μm，3.0mm*50mm，采用梯度洗脱的方式，具体梯度过程详见表5。流速为0.4mL/min，柱温为40℃，进样体积为2μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正离子模式扫描；毛细管电压为3.5kV，喷嘴电压为100V；干燥气温度为300℃，鞘气温度为325℃，干燥气流速为7L/min，鞘气流速为11L/min，雾化气压力30psi；同时监测3种水溶性维生素及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表6。
三、实验过程
(1)混合标准S0溶液配制：
准确称量3-5mg左右各标准品粉末于5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用80％甲醇水溶液配制成下表中标准品储备液，再将各浓度的储备液用80％甲醇水溶液配制成混合标准S0溶液(详见表2)，混合均匀备用。
本发明的试剂盒在使用时，将混合标准S0溶液以空白血清基质溶液配制成八个不同浓度点的校准品溶液，校准品溶液的配制过程如下：取20μL混合标准液S0至1.5mL离心管中，加入380μL 0.1％甲酸-甲醇溶液得到第一个高值浓度点S8，再逐级稀释至S1(详见表3)，各标曲点的浓度如表5中所列。
(2)内标SI溶液配制：
准确称量3-5mg左右各同位素内标物5mL离心管中(3mg以下规格的标准品无需称量，全部溶解)，用80％甲醇水溶液配制成下表中同位素储备液，再将各浓度的储备液用80％甲醇水溶液配制成同位素混合内标SI溶液(详见表4)。
本发明的试剂盒在使用时，将内标SI溶液加入甲醇稀释成混合内标工作溶液，具体配制方法如下：取100μL SI溶液，加入900μL甲醇，混合均匀即为混合内标工作液。其中，混合内标工作液中包含有0.5ng/mL维生素B7-d4、2ng/mL维生素B9-d4和20ng/mL烟酸-d4。
(3)质控品配制：
取上述混合标准S0溶液以0.1％甲酸-甲醇水溶液配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。
QC(L)中包含：0.025ng/mL维生素B7(VB7)、0.1ng/mL维生素B9(VB9)和1ng/mL烟酸(NA)。
QC(M)中包含：0.25ng/mL维生素B7(VB7)、1ng/mL维生素B9(VB9)和10ng/mL烟酸(NA)。
QC(H)中包含：2.5ng/mL维生素B7(VB7)、10ng/mL维生素B9(VB9)和100ng/mL烟酸(NA)。
(4)样品处理
1)标准品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后5s，加入180μL甲醇，振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心5min；取150μL上清液在37℃氮气下吹干，向其中加入100μL体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液，涡旋混匀5s后，在避光的条件下于50℃进行衍生反应20min，所得反应液冷却至室温，加入20μL 50％氨水进行中和，再次振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心3min，取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量2μL。
2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后5s，加入180μL甲醇，振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心5min；取150μL上清液在37℃氮气下吹干，向其中加入100μL体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液，涡旋混匀5s后，在避光的条件下于50℃进行衍生反应20min，所得反应液冷却至室温，加入20μL 50％氨水进行中和，再次振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心3min，取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量2μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
本发明的检测方法中，3种水溶性维生素的标准品与血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为3种水溶性维生素标准品的选择离子流色谱图；图2为血清样本中3种水溶性维生素的选择离子流色谱图。需要说明的是，本领域人员知晓，在图2中，对血清样本中各维生素进行分析时，通过质谱提取选择离子流色谱图，输入259.1(VB7的母离子质谱参数)时，谱图中出现两个峰，即2.6min(1峰)和3.18min(VB7峰)出现的峰，通过比对色谱出峰时间，可以判定1峰为VB7的干扰峰，这是由于血清样本中基质复杂，也存在分子量为259.1的干扰物质，因此调取259.1的质谱图时，出现两个峰。本申请是通过质谱信号强度进行定量，因此，即使1峰部分与NA峰有交叠，对NA定量完全没有影响，同时1峰与VB7分离很好，对VB7定量也没有影响。
1.衍生化前后的结果对比
本发明对衍生化前后的色谱行为进行了比较(详见表6)，采用10ng/mL的VB7标准品、10ng/mL的VB9标准品和10ng/mL的NA标准品进行实验。
其中，VB7标准品衍生化前的预处理过程如下：取50μL浓度为10ng/mL的VB7标准品于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后5s，加入180μL甲醇，振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心5min；取150μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量2μL。
其他2种样品(10ng/mL的VB9标准品和10ng/mL的NA标准品)衍生化前的预处理过程与VB7标准品相同。
VB7标准品衍生化后的预处理过程如下：取50μL浓度为10ng/mL的VB7标准品于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后5s，加入180μL甲醇，振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心5min；取150μL上清液在37℃氮气下吹干，向其中加入100μL体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液，涡旋混匀5s后，在避光的条件下于50℃进行衍生反应20min，所得反应液冷却至室温，加入20μL 50％氨水进行中和，再次振荡后，在转速为14500r/min，4℃的条件下离心3min，取70μL上清液装入含内插管的进样瓶中待检测，进样量2μL。
其他2种样品(10ng/mL的VB9标准品和10ng/mL的NA标准品)衍生化后的预处理过程与VB7标准品相同。
对衍生化前后的VB7标准品、VB9标准品和NA标准品，按照上述液质条件中公开的色谱条件和质谱条件进行检测，结果发现：3种水溶性维生素及其内标的衍生后的保留时间均有延后，VB7和VB9的峰面积响应有较大提高，而NA的峰面积并未提高，但NA的峰型有改善且抗干扰能力也有所增强。
表8 3种水溶性维生素衍生化前后的色谱行为对比结果
2.血清样本检测
随机选取12例健康人血清样本，按照本发明所述的样本前处理方法进行处理并上机检测，测得的结果见下表9所示，从结果可得知，个别样本中VB7和VB9含量极低，因此，提高灵敏度对临床检测意义重大。
表9 3种水溶性维生素在实际血清样本中的浓度(单位：ng/mL)
3.标准曲线
采用同位素内标定量法，利用MS quantitative analysis 10.0软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出待测物的浓度。下列3种水溶性维生素在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.995以上，详见表10。
表10 3种水溶性维生素的保留时间及线性范围
4.最低定量限
最低定量限(LLOQ)作为标曲线性范围的最低点，也反映方法的灵敏度。水溶性维生素在人体含量低，对方法的灵敏度和特异性要求较高，本发明对方法进行优化和考察，目前最低定量限(LLOQ)基本满足3种水溶性维生素同时检测的灵敏度要求，LLOQ的浓度具体见表11。
表11方法定量下限数据表
5.加标回收率考察
在混合血清中加入已知浓度的混合标准S0溶液，配制成低中高三个浓度，平行处理5次，计算回收率结果，见表12。结果显示，血清中3种水溶性维生素的加标回收率结果在85％-115％之间，均满足要求。
表12血清中3种水溶性维生素的加标回收率结果(单位ng/mL)
6.精密度试验
取血清质控样本一天内重复处理6批，处理3天，以同位素内标法定量测定3种水溶性维生素的浓度，连续三日统计每天的批内精密度，计算结果见表11；三日内分3批处理，计算批间精密度结果见表13。结果显示，血清中3种水溶性维生素的批内、批间精密度试验结果均在15％以下，满足要求。
表13批内、批间精密度试验结果(单位ng/mL)
五、讨论
本发明提供的试剂盒，采用HPLC-MS/MS和甲基衍生化法对VB7，VB9和NA的羧基进行修饰，通过对比未衍生法各化合物的色谱行为，甲基衍生法提高了离子化效率，从而有效提高了VB7和VB9的灵敏度，虽然NA灵敏度未提高，但是峰型和抗干扰能力均有改善。实验结果表明，甲基衍生化能有效提高待测物的灵敏度，衍生反应完全而且高效。与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
本发明考察了衍生后3种水溶性维生素在血清中加标回收率，均在85％-115％，符合满足美国临床实验室标准协会CLSI C62-A的相关要求；方法的重现性结果表明，衍生后血清中3种水溶性维生素的批内、批间精密度均在15％以内，方法的重现性良好。
本方法较其他LC-MS/MS方法灵敏度和特异性更高，衍生化反应简单，5分钟之内可同时检测3种水溶性维生素，可满足临床上血清水溶性维生素的诊断需求及健康评估。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，所述水溶性维生素分别为：维生素B7、维生素B9和烟酸；
上述水溶性维生素对应的同位素内标物分别为：维生素B7-d4、维生素B9-d4和烟酸-d4；
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)电解质浓缩液A：40～60％甲酸水溶液；
(2)混合标准S0溶液：
包含有50ng/mL维生素B7、200ng/mL维生素B9和2000ng/mL烟酸的甲醇水溶液；
(3)内标SI溶液：
包含有5ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B9-d4和200ng/mL烟酸-d4的甲醇水溶液；
(4)衍生化试剂：盐酸与甲醇的混合溶液；
(5)中和液：氨水溶液；
(6)质控品：含有3种水溶性维生素的空白血清基质溶液，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)和QC(H)，其中：
QC(L)中包含：0.025ng/mL维生素B7、0.1ng/mL维生素B9和1ng/mL烟酸；
QC(M)中包含：0.25ng/mL维生素B7、1ng/mL维生素B9和10ng/mL烟酸；
QC(H)中包含：2.5ng/mL维生素B7、10ng/mL维生素B9和100ng/mL烟酸。
2.根据权利要求1所述的甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，其特征在于，所述电解质浓缩液A为50％甲酸水溶液；所述衍生化试剂为体积比为1:4～10的盐酸与甲醇的混合溶液，优选为体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液；所述中和液为40～80％氨水溶液，优选为50％氨水溶液；所述空白血清基质为0.05～0.2％甲酸-甲醇溶液；优选为0.1％甲酸-甲醇溶液。
3.根据权利要求2所述的甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，其特征在于，所述混合标准S0溶液按照如下方法制备：
称取各待测物标准品，包括维生素B7、维生素B9和烟酸，分别加入甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为25μg/mL维生素B7、100μg/mL维生素B9和100μg/mL烟酸的标准品储备液；
上述各标准品储备液再以甲醇水溶液配制成包含有50ng/mL维生素B7、200ng/mL维生素B9和2000ng/mL烟酸的混合标准S0溶液。
4.根据权利要求3所述的甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，其特征在于，所述内标SI溶液按照如下方法制备：
称取各同位素内标物，维生素B7-d4、维生素B9-d4和烟酸-d4，分别加入甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为1μg/mL维生素B7-d4、10μg/mL维生素B9-d4和10μg/mL烟酸-d4的同位素储备液；
上述各同位素内标储备液再以甲醇水溶液配制成包含有5ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B9-d4和200ng/mL烟酸-d4的同位素混合内标SI溶液。
5.根据权利要求4所述的甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，其特征在于，在配制混合标准S0溶液和内标SI溶液时，所述甲醇水溶液为60～90％甲醇水溶液，优选为80％甲醇水溶液。
6.根据权利要求5所述的甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，其特征在于，所述血清为人或动物血清。
7.根据权利要求6所述的甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)电解质浓缩液A：50％甲酸水溶液；
(2)混合标准S0溶液：
称取各待测物标准品，包括维生素B7、维生素B9和烟酸，分别加入60～90％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为25μg/mL维生素B7、100μg/mL维生素B9和100μg/mL烟酸的标准品储备液；
上述各标准品储备液再以60～90％甲醇水溶液配制成包含有50ng/mL维生素B7、200ng/mL维生素B9和2000ng/mL烟酸的混合标准S0溶液；
(3)内标SI溶液：
称取各同位素内标物，维生素B7-d4、维生素B9-d4和烟酸-d4，分别加入60～90％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为1μg/mL维生素B7-d4、10μg/mL维生素B9-d4和10μg/mL烟酸-d4的同位素储备液；
上述各同位素内标储备液再以60～90％甲醇水溶液配制成包含有5ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B9-d4和200ng/mL烟酸-d4的同位素混合内标SI溶液；
(4)衍生化试剂：体积比为1:4～10的盐酸与甲醇的混合溶液；
(5)中和液：40～80％氨水溶液
(6)质控品：取上述混合标准S0溶液以0.05～0.2％甲酸-甲醇溶液作为空白血清基质配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中：
QC(L)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至2000倍；
QC(M)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至200倍；
QC(H)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至20倍。
8.根据权利要求7所述的甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒，所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)电解质浓缩液A：50％甲酸水溶液；
(2)混合标准S0溶液：
称取各待测物标准品，包括维生素B7、维生素B9和烟酸，分别加入80％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为25μg/mL维生素B7、100μg/mL维生素B9和100μg/mL烟酸的标准品储备液；
上述各标准品储备液再以80％甲醇水溶液配制成包含有50ng/mL维生素B7、200ng/mL维生素B9和2000ng/mL烟酸的混合标准S0溶液；
(3)内标SI溶液：
称取各同位素内标物，维生素B7-d4、维生素B9-d4和烟酸-d4，分别加入80％甲醇水溶液完全溶解，配制成浓度为1μg/mL维生素B7-d4、10μg/mL维生素B9-d4和10μg/mL烟酸-d4的同位素储备液；
上述各同位素内标储备液再以80％甲醇水溶液配制成包含有5ng/mL维生素B7-d4、20ng/mL维生素B9-d4和200ng/mL烟酸-d4的同位素混合内标SI溶液；
(4)衍生化试剂：体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液；
(5)中和液：50％氨水溶液；
(6)质控品：取上述混合标准S0溶液以0.1％甲酸-甲醇溶液作为空白血清基质配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中：
QC(L)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至2000倍；
QC(M)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至200倍；
QC(H)为所述混合标准S0溶液以空白血清基质溶液稀释至20倍。
9.权利要求1～8中任一项所述的试剂盒在利用甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，采用高效液相色谱串联质谱检测经过预处理的血清中的水溶性维生素，利用高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物与其对应同位素内标的质荷比的响应，使用同位素内标法定量，分别计算出3种水溶性维生素的含量，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱为：Agilent EC C18，2.7μm，3.0mm*50mm；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至30:70；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0-3.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至80:20；在3.1-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离模式下，采用多反应监测进行正负切换扫描；毛细管电压为3.5kV，喷嘴电压为100V；干燥气温度为300℃，鞘气温度为325℃，干燥气流速为7L/min，鞘气流速为11L/min，雾化气压力30psi；同时监测3种水溶性维生素及其对应同位素内标；
其中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后，加入180μL甲醇，振荡后，在转速为1400～15000r/min，4℃的条件下离心4～10min；取150μL上清液在37℃氮气下吹干，向其中加入100μL体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液，涡旋混匀后，在避光的条件下于50℃进行衍生反应20min，所得反应液冷却至室温，加入20μL 50％氨水进行复溶，再次振荡后，在转速为1400～15000r/min，4℃的条件下离心1～5min，取上清液待进样。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310026303.XA CN118311161A (zh) | 2023-01-09 | 2023-01-09 | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310026303.XA CN118311161A (zh) | 2023-01-09 | 2023-01-09 | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118311161A true CN118311161A (zh) | 2024-07-09 |
Family
ID=91721186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310026303.XA Pending CN118311161A (zh) | 2023-01-09 | 2023-01-09 | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118311161A (zh) |
-
2023
- 2023-01-09 CN CN202310026303.XA patent/CN118311161A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111175394A (zh) | 一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法 | |
| CN111812218B (zh) | 一种同时检测血清中多种抗精神病药物浓度的方法 | |
| CN113588804B (zh) | 一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒 | |
| CN115902048A (zh) | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法 | |
| CN111579685A (zh) | 一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用 | |
| CN111579681A (zh) | 一种同时检测血清中多种抗精神病药物的试剂盒 | |
| CN111766311A (zh) | 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗结核病药物的方法 | |
| CN112730706A (zh) | 一种液相色谱串联质谱检测生物小分子标志物的方法 | |
| CN111812220A (zh) | 一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法 | |
| CN113607854B (zh) | 同时检测多种维生素的方法和检测试剂盒 | |
| CN116223693B (zh) | 高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的方法 | |
| CN111812219A (zh) | 一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法 | |
| CN116297993A (zh) | 高效液相色谱串联质谱测定红细胞中叶酸及其代谢物的试剂盒 | |
| CN111812224A (zh) | 一种检测血清中抗痴呆药物浓度的方法 | |
| CN111812222A (zh) | 超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法 | |
| CN118311161A (zh) | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的试剂盒 | |
| CN114609265A (zh) | 一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法 | |
| CN114577950A (zh) | 一种化妆品内抗感染类药物的测定方法 | |
| CN111665305A (zh) | 超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物的试剂盒 | |
| CN113607829B (zh) | 一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的方法 | |
| CN118348170B (zh) | 一种hplc-ms/ms法检测血浆中米洛巴林的方法 | |
| CN111665307A (zh) | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的试剂盒 | |
| CN111830162A (zh) | 一种检测血清中核苷类抗病毒药物浓度的方法 | |
| CN111665302A (zh) | 一种检测血清中抗病毒药物的试剂盒 | |
| CN117723669A (zh) | 一种高效液相色谱串联质谱测定人粪便中维生素b类化合物的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |