CN117347506A - 检测血液中多种维生素的含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种检测血液中多种维生素含量的方法，多种维生素为维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E，检测方法包括：分别提供待测血清样本和标准样本；向待测血清样本和标准样本加入内标溶液；加入第一沉淀剂，进行混合，其中第一沉淀剂为浓度7.8g/mL至10g/mL的硫酸锌溶液；加入第二沉淀剂，进行混合，其中第二沉淀剂包括乙腈和甲醇；加入萃取剂，进行萃取；加入复溶液，进行复溶；采用液相色谱串联质谱法对待测溶液和标准溶液进行检测；根据标准溶液的检测结果得到标准曲线，根据待测溶液的检测结果，得到待测血清样本中多种维生素的含量。根据本发明，能够提供一种准确性高的检测血液中多种维生素含量的方法。
Description
技术领域
本发明大体涉及化学检测领域，具体涉及一种检测血液中多种维生素的含量的方法。
背景技术
维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素，维生素A、维生素D和维生素E属于常见的脂溶性维生素，是人体所必需的微量营养成分，对新陈代谢起调节作用。维生素A(vitamin A)又称视黄醇，孕妇缺乏或过量可造成胎儿先天畸形，如唇腭裂、先天性心脏病等，妊娠期间补充维生素A可提高血红蛋白水平、降低贫血的发生率。维生素D(vitamin D)的缺乏可能会导致佝偻病、骨密度降低、骨折、产后妇女骨质疏松。维生素E(vitamin E)水解产物为生育酚，生育酚能够促进性激素分泌，具有提高生育能力、预防流产的作用，缺乏维生素E可能会导致胎盘老化、胎膜早破等。因而，对人体中的多种维生素的含量进行检测具有重要的临床意义。
目前，通常是对人体血液中的维生素的含量进行检测，常规的检测方法有液相色谱法以及液相色谱-串联质谱联用法。现有的检测方法，通常是在样本前处理过程将血浆和有机试剂进行震荡混合以使蛋白沉淀，再加入萃取剂萃取，然后用复溶液进行复溶，用液质联用仪分析。然而，在样本前处理过程和萃取过程中，往往需要剧烈振荡、充分混合后才能将水相中的脂溶性维生素萃取到有机相溶剂中，此过程易导致溶液发生乳化现象，与此同时，有机溶剂与水相溶剂会互相发生微量溶解，导致溶液分层不明显、转移有机相溶液不方便，造成待测维生素的损耗，从而导致产生实验间偏差，影响检测结果准确性。特别地，人血液中的维生素A和维生素E的含量不高，通常为微克级，而维生素D的含量极低，为纳克级，检测时应尽量减少维生素的损耗。
因此，需要提供一种高准确性的人体血液中多种维生素含量的检测方法。
发明内容
本发明是有鉴于上述现有技术的状况而提出的，其目的在于提供一种准确性高的检测血液中多种维生素的含量的方法。
为此，本发明提供了一种检测血液中多种维生素的含量的方法，包括分别提供待测血清样本和标准样本；向所述待测血清样本和所述标准样本加入内标溶液；加入第一沉淀剂，进行混合，其中所述第一沉淀剂为浓度7.8g/mL至10g/mL的硫酸锌溶液；加入第二沉淀剂，进行混合，其中所述第二沉淀剂包括乙腈和甲醇；加入萃取剂，进行萃取；加入复溶液，进行复溶，得到待测溶液和标准溶液；采用液相色谱串联质谱法对所述待测溶液和所述标准溶液进行检测；根据所述标准溶液的检测结果得到标准曲线，根据所述待测溶液的检测结果和所述标准曲线，得到所述待测血清样本中所述多种维生素的含量；其中，所述多种维生素为维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E，所述标准样本为具有特定浓度的维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E的溶液，所述内标溶液为具有特定浓度的带有同位素标记的维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E的溶液。
在本发明中，在样本前处理过程中，加入第一沉淀剂(浓度7.8g/mL至10g/mL的硫酸锌溶液)，高浓度的硫酸锌溶液能够与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜，且能够中和蛋白质颗粒上的电荷，使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出，改变样本中蛋白质在水溶液中的溶解性，促进蛋白质沉淀、分离，从而能够有利于减少对后续检测的影响；另外，高浓度的硫酸锌溶液还能够改变水相溶剂中的极性，减少有机溶剂与水溶液发生相互溶解或者产生乳化现象，有利于减少后续样本处理中的维生素的损耗，由此，能够有利于提高对血液中的维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E检测的准确性。加入第二沉淀剂(乙腈和甲醇)，能够增加水的极性，促进两相分离，从而能够进一步促进样本中蛋白的沉淀。此外，加入第一沉淀剂(硫酸锌的水溶液)还能够对样本进行稀释，从而使样本中蛋白的浓度降低，从而减少蛋白之间的相互作用和干扰，再加入第二沉淀剂，能够有利于进一步促进样本中蛋白的沉淀。
在本发明所涉及的方法中，可选地，所述第二沉淀剂包括还包括稳定剂，所述稳定剂为丁基羟基茴香醚，所述稳定剂溶于甲醇中，质量分数为0.1％。在这种情况下，由于维生素A和维生素E置于空气中均容易发生氧化反应，在沉淀剂中加入丁基羟基茴香醚，能够有利于维持维生素A和维生素E在沉淀步骤的稳定性，减少维生素A和维生素E的损耗，从而提高检测准确性。
在本发明所涉及的方法中，可选地，所述第二沉淀剂中，乙腈和丁基羟基茴香醚质量分数为0.1％的甲醇的体积比为1:1。由此，能够有利于提高检测结果的准确性。
在本发明所涉及的方法中，可选地，所述萃取剂为正己烷。由此，能够有利于维生素的回收，提高检测的准确性。
在本发明所涉及的方法中，可选地，所述复溶液包括水和具有所述稳定剂的甲醇。在这种情况下，在复溶时加入稳定剂，能够有利于维持维生素A和维生素E在复溶步骤的稳定性，减少维生素A和维生素E的损耗，从而提高检测准确性。
在本发明所涉及的方法中，可选地，所述复溶液中，水和具有所述稳定剂的甲醇的体积比为3:7。由此，能够有利于维生素的回收，提高检测的准确性。
在本发明所涉及的方法中，可选地，进行液相色谱时，色谱柱为C18色谱柱，柱温为40℃，进样量为10μL。在这种情况下，选用C18色谱柱，能够根据待测物分子极性大小进行选择性分离，能够对水相更加耐受，从而延长色谱柱的使用寿命；并通过选择合适的柱温和流动相，能够有利于获得良好的分离效果和提高检测的准确度。
在本发明所涉及的方法中，可选地，进行液相色谱时，流动相A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸的甲醇溶液。在这种情况下，通过选择合适的流动相的组成，能够有利于获得良好的分离效果和提高检测的准确度。
在本发明所涉及的方法中，可选地，进行液相色谱时，为梯度洗脱，洗脱程序为：
在本发明所涉及的方法中，可选地，用于检测所述多种维生素及所述带有同位素标记的多种维生素的母离子和子离子对质荷比为：
| 分析物 | 母离子 | 子离子 |
| 维生素A | 269.300 | 93.100 |
| 维生素E | 431.300 | 165.300 |
| 带有同位素标记的的维生素A | 275.200 | 171.300 |
| 带有同位素标记的的维生素E | 437.300 | 171.300 |
| 维生素D2 | 413.300 | 355.300 |
| 维生素D3 | 401.300 | 365.300 |
| 带有同位素标记的的维生素D3 | 404.300 | 386.300 |
| 带有同位素标记的的维生素D2 | 419.300 | 401.300 |
。
根据本发明，能够提供一种准确性高的检测血液中多种维生素含量的方法。
附图说明
图1是示出了本发明的实施方式所涉及的检测血液中多种维生素含量的方法的流程图。
图2是示出了本发明的实施方式所涉及的步骤S300的流程图。
图3是示出了本发明的实施例1所涉及的维生素A的标准曲线图。
图4是示出了本发明的实施例1所涉及的维生素E的标准曲线图。
图5是示出了本发明的实施例1所涉及的维生素D2的标准曲线图。
图6是示出了本发明的实施例1所涉及的维生素D3的标准曲线图。
图7是示出了本发明的实施例2所涉及的维生素A的检测结果图。
图8是示出了本发明的实施例2所涉及的维生素E的检测结果图。
图9是示出了本发明的实施例2所涉及的维生素D2的检测结果图。
图10是示出了本发明的实施例2所涉及的维生素D3的检测结果图。
具体实施方式
以下，参考附图，详细地说明本发明的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。
需要说明的是，本发明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，例如所包括或所具有的一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可以包括或具有没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
另外，在本发明的下面描述中涉及的小标题等并不是为了限制本发明的内容或范围，其仅仅是作为阅读的提示作用。这样的小标题既不能理解为用于分割文章的内容，也不应将小标题下的内容仅仅限制在小标题的范围内。
本发明所涉及的检测血液中多种维生素含量的方法为液相色谱串联质谱法。多种维生素为脂溶性维生素，可以包括维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E。本发明所涉及的检测血液中多种维生素含量的方法可以简称为检测方法。本发明所涉及的检测方法可以应用于人血液中的维生素含量的检测，检测的准确性高。
以下结合附图进行详细描述本发明。图1是示出了本实施方式所涉及的检测血液中多种维生素含量的方法的流程图。
在一些示例中，如图1所示，检测血液中多种维生素含量的方法可以包括：分别提供待测血清样本和标准样本(步骤S100)；加入内标溶液(步骤S200)；进行样本前处理，得到待测溶液和标准溶液(步骤S300)；对待测溶液和标准溶液进行检测(步骤S400)；根据标准溶液的检测结果和待测溶液的检测结果，得到待测血清样本中多种维生素的含量(步骤S500)。
在本实施方式中，检测血液中多种维生素含量的方法可以包括分别提供待测血清样本和标准样本(步骤S100)。
在一些示例中，在步骤S100中，待测的血清样本可以抽取受检者的外周血而获得。在一些示例中，待测血清样本的制备方法可以为：使用不含抗凝剂的采血管采血，于4℃静置2h(避免震动防止溶血)，离心取上清，可以在4℃的条件下离心，转速为3000g，离心20分钟，可以离心两次。在这种情况下，使用血清样本能够减少血细胞、纤维蛋白原等的干扰。
在一些示例中，标准样本可以为具有特定浓度的多种维生素的溶液。换言之，标准样本中具有特定浓度的维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E。
在一些示例中，标准样本可以有多个，且多种维生素的浓度呈梯度设置。由此，能够便于根据标准样本中不同的维生素浓度来获得不同的检测信号，从而能够生成标准曲线。
在一些示例中，标准样本中，维生素A可以从0.1μg/mL至2μg/mL的浓度范围内进行梯度设置共4至8组。标准样本中维生素E可以从1μg/mL至100μg/mL的浓度范围内进行梯度设置共4至8组。多个标准样本中维生素D2可以从1ng/mL至20ng/mL的浓度范围内进行梯度设置共4至8组。多个标准样本中维生素D3可以从5ng/mL至100ng/mL的浓度范围内进行梯度设置共4至8组。由此，能够提供合适的线性范围。
在本实施方式中，检测血液中多种维生素含量的方法可以包括加入内标溶液(步骤S200)。
在一些示例中，在步骤S200中，可以分别向待测血清样本和标准样本加入内标溶液。在一些示例中，可以向待测血清样本和标准样本加入相同体积的内标溶液。在一些示例中，内标溶液可以为具有特定浓度的带有同位素标记的维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E的溶液。例如，内标溶液可以具有特定浓度的氘代维生素A、氘代维生素D2、氘代维生素D3和氘代维生素E。由此，采用同位素标记的多种维生素作为内标，能够便于对样本中的维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E进行定量检测。
在一些示例中，内标溶液中同位素标记的维生素A的浓度可以为20至25μg/mL。内标溶液中同位素标记的维生素D2的浓度可以为0.5至2μg/mL。内标溶液中同位素标记的维生素D3的浓度可以为0.5至2μg/mL。内标溶液中同位素标记的维生素E的浓度可以为60至65μg/mL。
在一些示例中，加入内标溶液后可以进行混合，例如通过震荡使样本混合。
在本实施方式中，检测血液中多种维生素含量的方法可以包括进行样本前处理，得到待测溶液和标准溶液(步骤S300)。图2是示出了本发明的实施方式所涉及的步骤S300的流程图。如图2所示，步骤S300可以包括：加入第一沉淀剂(步骤S310)、加入第二沉淀剂(步骤S320)、加入萃取剂(步骤S330)以及加入复溶液，得到待测溶液和标准溶液(步骤S340)。
在一些示例中，在步骤S310中，可以分别向加有内标溶液的待测血清样本和加有内标溶液的标准样本加入第一沉淀剂。
在一些示例中，第一沉淀剂可以为高浓度的硫酸锌溶液。在一些示例中，硫酸锌溶液的浓度可以为7.8g/mL至10g/mL。例如，硫酸锌溶液的浓度可以为7.8g/mL、8g/mL、8.5g/mL、9g/mL、9.5g/mL或10g/mL。在这种情况下，硫酸锌溶液能够与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜，且能够中和蛋白质颗粒上的电荷，从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出，从而可以改变样本中蛋白质在水溶液中的溶解性，促进蛋白质沉淀、分离；另外，还能够改变水相溶剂中的极性，减少有机溶剂与水溶液发生相互溶解或者产生乳化现象，有利于减少后续样本处理中的维生素的损耗，由此，能够有利于对血液中的维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E进行检测。
在一些示例中，加入第一沉淀剂后可以进行混合，例如通过震荡使样本混合。由此，有利于使样本中的蛋白沉淀。
在一些示例中，在步骤S320中，第二沉淀剂可以包括乙腈和甲醇。由此，能够进一步促进样本中蛋白的沉淀。
在一些示例中，加入第一沉淀剂后，可以再加入第二沉淀剂。在这种情况下，第二沉淀剂能够增加水的极性，促进两相分离，从而能够进一步促进样本中蛋白的沉淀。此外，加入第一沉淀剂还能够对样本进行稀释，从而使样本中蛋白的浓度降低，从而减少蛋白之间的相互作用和干扰，再加入第二沉淀剂，能够有利于进一步促进样本中蛋白的沉淀。
在一些示例中，第二沉淀剂还可以包括稳定剂。在一些示例中，稳定剂可以为抗氧化剂。在一些示例中，稳定剂可以为丁基羟基茴香醚。稳定剂可以溶于甲醇中，质量分数为0.1％。换言之，第二沉淀剂可以包括乙腈、丁基羟基茴香醚质量分数为0.1％的甲醇溶液。维生素A和维生素E置于空气中均容易发生氧化反应，在这种情况下，在沉淀剂中加入丁基羟基茴香醚，能够有利于维持维生素A和维生素E在沉淀步骤的稳定性，减少维生素A和维生素E的损耗，从而提高检测准确性。
在一些示例中，第二沉淀剂中，乙腈和丁基羟基茴香醚质量分数为0.1％的甲醇的体积比可以为1:1。由此，能够有利于提高检测结果的准确性。
在一些示例中，加入第二沉淀剂后可以进行混合，例如通过震荡使样本混合。由此，有利于使样本中的蛋白沉淀。
在一些示例中，在步骤S330中，萃取剂为正己烷。
在一些示例中，加入萃取剂后可以进行混合，例如通过震荡使样本混合。由此，有利于使维生素被萃取至有机相。在一些示例中，加入萃取剂混合后，可以再进行离心。由此，有利于减少蛋白等的干扰。
在一些示例中，可以吸取有机层。待检测的维生素主要被萃取至有机层中，可以吸取有机层，弃去其他层，在这种情况下，可以减少其他杂质对检测的影响。
在一些示例中，可以对获得的有机层进行氮气吹干。由此，能够尽量去除有机溶剂，减少有机溶剂对后续色谱检测的影响。
在一些示例中，在步骤S340中，可以加入复溶液进行复溶。在一些示例中，复溶液可以为与色谱检测的流动相系统相匹配的溶液。在一些示例中，复溶液可以包括水和甲醇。在一些示例中，复溶液还可以包括稳定剂。在这种情况下，在复溶时加入稳定剂，能够有利于维持维生素A和维生素E在复溶步骤的稳定性，减少维生素A和维生素E的损耗，从而提高检测准确性。
在一些示例中，复溶液可以由水和丁基羟基茴香醚质量分数为0.1％的甲醇溶液组成。在一些示例中，水和丁基羟基茴香醚质量分数为0.1％的甲醇溶液的体积比可以为3:7。由此，能够有利于维生素的回收，提高检测的准确性。
在一些示例中，复溶操作后，可以分别得到待测溶液和标准溶液。
在本实施方式中，检测血液中多种维生素含量的方法可以包括对待测溶液和标准溶液进行检测(步骤S400)。
在一些示例中，在步骤S400中，可以采用高效液相色谱串联质谱法对待测溶液和标准溶液进行检测。
在一些示例中，在步骤S400中，色谱参数可以包括选择使用的色谱柱为ODS色谱柱(C18色谱柱)。在这种情况下，选用C18色谱柱，能够根据待测物分子极性大小进行选择性分离，能够对水相更加耐受，从而延长色谱柱的使用寿命。在另一些示例中，也可以选用与C18色谱柱检测效果相当的其他色谱柱。
在一些示例中，色谱参数可以包括选择柱温为40℃。色谱参数可以包括进样量为10μL。色谱参数可以包括流速为0.55ml/min。色谱参数可以包括使用甲酸水的混合液作为流动相A，使用甲酸和甲醇的混合液作为流动相B。优选地，在流动相A中，甲酸的体积分数为0.1％，在流动相B中，甲酸的体积分数为0.1％。在这种情况下，通过选择合适的柱温、进样量、流速、流动相，能够有利于获得良好的分离效果和提高检测的准确度。
在一些示例中，进行高效液相色谱时，可以为梯度洗脱，洗脱程序可以为：
| 时间(min) | 流动相A％ | 流动相B％ | 流速(ml/min) |
| 0 | 95 | 5 | 0.55 |
| 0.5 | 17 | 83 | 0.55 |
| 4 | 1 | 99 | 0.55 |
| 4.5 | 1 | 99 | 0.55 |
| 4.7 | 95 | 5 | 0.55 |
| 5.5 | 95 | 5 | 0.55 |
。
在一些示例中，在质谱时，可以采用电喷雾离子源(ESI)和正离子模式多反应监测扫描模式(MRM)进行采集数据。
在一些示例中，离子源电压和气流参数可以如下所示：
在一些示例中，用于检测的维生素及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)可以如下表所示：
下面通过实施例对本发明进行详细描述。但下述实施例只是为了具体说明本发明而提供的例子，并不限定或限制本申请中公开的发明的范围。
实施例1：获得标准曲线
配制标准样本：将维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E标准品配制成混合溶液，4种维生素在标准品中具有6个系列浓度(S1～S6)，如下表所示：
配制内标溶液，浓度如下表所示
| 原材料名称 | 浓度 |
| VA-d6 | 20ug/mL |
| VE-d6 | 60ug/mL |
| 25(OH)D2-d6 | 0.5ug/mL |
| 25(OH)D3-d6 | 0.5ug/mL |
前处理：
①移取标准样本100uL，加入10uL内标溶液，混合震荡1min；
②充分混合均匀后加入200uL硫酸锌溶液(浓度为8g/mL)，混合震荡1min；
③移取400uL 0.1％BHA甲醇：乙腈(1：1)溶液加入于②处理后的样本中，混合震荡1min，混合均匀；
④移取600uL正己烷加入于③处理后的样本中，混合震荡1min，以10000g转速离心5min；可见样本分为三层，取上层有机层500uL于另一离心管中(注意不要触及中间水层)，室温下于96微孔板/深孔板氮吹仪吹干；
⑤移取60uL的0.1％BHA甲醇：水(7：3)对④处理后的样本进行复溶，充分混合均匀后转移至96孔V型微孔板，盖上铝箔封套，以备进行液相色谱串联质谱分析。
液相色谱串联质谱检测：
三重四极杆质谱仪LC/MS/MS System(型号：API 3200MDTM)；色谱柱：厂商为沃特世，型号规格为XBridge C18，3.5μm；2.1×5.0mm；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸甲醇；流速：0.55mL/min；柱温：40℃；进样器温度：15℃；进样量：10μL。
高效液相色谱串联质谱检测，采用梯度洗脱和电喷雾离子源(ESI)和正离子模式多反应监测扫描模式(MRM)进行采集数据。
离子源电压和气流参数：
用于检测的4种脂溶性维生素及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)如下表所示：
梯度洗脱时间需5.5min，梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流动相A％ | 流动相B％ | 流速(ml/min) |
| 0 | 95 | 5 | 0.55 |
| 0.5 | 17 | 83 | 0.55 |
| 4 | 1 | 99 | 0.55 |
| 4.5 | 1 | 99 | 0.55 |
| 4.7 | 95 | 5 | 0.55 |
| 5.5 | 95 | 5 | 0.55 |
根据液相色谱串联质谱的检测数据得到标准曲线，具体而言，以6个标准样本的浓度与检测信号值作为X轴与Y轴作图，得到维生素A线性回归方程：y＝9.46x-0.0428，r＝0.9984；维生素E线性回归方程：y＝0.223x+0.00036，r＝0.9978；维生素D2线性回归方程：y＝0.000494x+0.00312，r＝0.9990；维生素D3线性回归方程：y＝0.0012x-0.000429，r＝0.9986；均呈现良好的线性关系。见图3至图6，图3是示出了本发明的实施例1所涉及的维生素A的标准曲线图，图4是示出了本发明的实施例1所涉及的维生素E的标准曲线图，图5是示出了本发明的实施例1所涉及的维生素D2的标准曲线图，图6是示出了本发明的实施例1所涉及的维生素D3的标准曲线图。
实施例2：血清样本检测
提供临床血清样本，采用与实施例1相同的前处理操作和液相色谱串联质谱检测操作，检测结果见图7至图10。图7是示出了本发明的实施例2所涉及的维生素A的检测结果图，图8是示出了本发明的实施例2所涉及的维生素E的检测结果图，图9是示出了本发明的实施例2所涉及的维生素D2的检测结果图，图10是示出了本发明的实施例2所涉及的维生素D3的检测结果图。根据图7至图10的检测结果，再结合实施例1得到的标准曲线，可以得出该临床血清样本中，维生素A的含量为0.356μg/mL；维生素E的含量为9.39μg/mL；维生素D2的含量为1.56ng/mL；维生素D3的含量为19.3ng/mL。
实施例3：沉淀剂对检测结果的影响分析
将维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E标准品配制成混合溶液，作为质控工作液的中间液，配制得到质控样品。4种维生素在质控样品中具有低(L)、高(H)二个系列浓度，如下表所示：
前处理过程分别采用不同的第二沉淀剂，实验设置见下表：
其余的前处理步骤以及液相色谱串联质谱检测操作与实施例相同，结果见下列各表(其中维生素A和维生素E的浓度单位μg/mL；25羟基维生素D2和25羟基维生素D3的浓度单位ng/mL)：
实验1检测结果：
实验2检测结果：
实验3检测结果：
实验4检测结果：
综合上述实验1至实验的检测结果，对回收率和精密度进行分析，结果见下表：
根据实验结果显示，实验1的沉淀剂组合对比其他沉淀剂组合的在多种维生素检测结果中的准确度最高(回收率最高，相对偏差最小)和精密度最好(CV值最小)。故选择硫酸锌+0.1％BHA甲醇：乙腈(1：1)作为脂溶性维生素检测过程中的蛋白沉淀剂效果最佳。
虽然以上结合附图和实施例对本发明进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本发明。本领域技术人员在不偏离本发明的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本发明进行变形和变化，这些变形和变化均落入本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种检测血液中多种维生素的含量的方法，其特征在于，包括：
分别提供待测血清样本和标准样本；
向所述待测血清样本和所述标准样本加入内标溶液；
加入第一沉淀剂，进行混合，其中所述第一沉淀剂为浓度7.8g/mL至10g/mL的硫酸锌溶液；
加入第二沉淀剂，进行混合，其中所述第二沉淀剂包括乙腈和甲醇；
加入萃取剂，进行萃取；
加入复溶液，进行复溶，得到待测溶液和标准溶液；
采用液相色谱串联质谱法对所述待测溶液和所述标准溶液进行检测；
根据所述标准溶液的检测结果得到标准曲线，根据所述待测溶液的检测结果和所述标准曲线，得到所述待测血清样本中所述多种维生素的含量；
其中，所述多种维生素为维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E，所述标准样本为具有特定浓度的维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E的溶液，所述内标溶液为具有特定浓度的带有同位素标记的维生素A、维生素D2、维生素D3和维生素E的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二沉淀剂包括还包括稳定剂，所述稳定剂为丁基羟基茴香醚，所述稳定剂溶于甲醇中，质量分数为0.1％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二沉淀剂中，乙腈和丁基羟基茴香醚质量分数为0.1％的甲醇的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取剂为正己烷。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述复溶液包括水和具有所述稳定剂的甲醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述复溶液中，水和具有所述稳定剂的甲醇的体积比为3:7。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行液相色谱时，色谱柱为C18色谱柱，柱温为40℃，进样量为10μL。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，进行液相色谱时，流动相A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸的甲醇溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进行
液相色谱时，为梯度洗脱，洗脱程序为：
。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行质谱时，用于检测所述多种维生素及所述带有同位素标记的多种维生素的母离子和子离子对质荷比为：
。
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| CN (1) | CN117347506A (zh) |
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2023
- 2023-07-27 CN CN202310940120.9A patent/CN117347506A/zh active Pending
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