CN109001329A - 干血片中25-羟基维生素d的高效液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents
干血片中25-羟基维生素d的高效液相色谱串联质谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种干血片中25‑羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：(1)超声萃取，取干血片样品，加入萃取溶剂，超声萃取，随后加入内标工作溶液，涡旋混合，离心，取上层萃取液，氮气吹干；(2)衍生化反应，步骤(1)处理后样品，加入PTAD衍生化工作溶液复溶，恒温反应，然后加入乙醇终止反应，氮气吹干；(3)复溶，采用高效液相色谱串联质谱法进行分析检测。本发明方法效率高，通量高，成本低，操作简便、准确度高、灵敏度高，与其他检测项目无冲突限制，适用于大批量临床样本的快速检测；同时干血片法对受试者的创伤相对较小,取血量少,样品采集运输方便，容易保存,稳定性好,特别适用于静脉采血困难人群(如婴幼儿)的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种高效率，高通量，低成本，简便操作，同时采血量少、准确度高、灵敏度高，与其他检测项目无冲突的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
婴幼儿体内的25-羟基维生素D的含量与佝偻病，骨质疏松，软骨病等一系列疾病密切相关。若不及时检测，将会延误病情耽误治疗。然而现有技术主要存在以下两方面缺陷：
(1)现有方法需采集人体的血清样本，而婴幼儿很难采集足量血清，因此现有方法无法满足婴幼儿等特殊人群的需求。干血片法采集方便，用血量少，保存简单，易于运输，更适合于婴幼儿群体的检测；
(2)现有检测方法大多采用免疫法，免疫法根据抗体可以和待测物的结构类似物结合，无法准确区分25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，因此只能检测总25-羟基维生素D水平，同时检测结果准确度不高，无法准确指导临床医生诊断疾病和用药。高效液相色谱串联质谱检测法由于其优异的准确性及超高的灵敏度被视为检测25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的金标准。
国家知识产权局网站上公开的“干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒”，该方法包含前处理、衍生、复溶工序，同时采用多反应监测MRM扫描方式检测干血片中2种25-羟基维生素的含量。该方法存在以下多个缺陷：(1)在前处理，衍生化和复溶工序中均采用单一离心管和单一样品瓶处理检测样本，样本处理过程繁琐，工作量较大，极其耗时，不适于临床大批量样本的检测分析；(2)衍生化反应采用室温孵化，需要1小时，时间较长；(3)单个样本的仪器分析时间需要5分钟，同时梯度程序中有机溶剂的比例较高，这些因素导致样本的分析耗时长，检测效率低，且有机溶剂甲醇的消耗量较大；(4)该方法采用的大气压化学电离源(APCI)，与常规使用的电喷雾离子源(ESI)方法相比较，APCI源的使用范围较窄，适合分析的化合物较少，因此为设备上其他检测项目的开展造成很大的困难和限制，同时日常清洗维护也较复杂。总之，该方法人工成本、仪器使用维护成本和试剂成本较高，实际应用范围相对较窄，在临床推广中存在明显的缺陷和限制，无法满足临床检验实验室和第三方检验实验室多项目和大样本量检测的需要。
婴幼儿体内25-羟基维生素D的检测方法具有很大的临床需求，因此需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题是提供一种高效率，高通量，低成本，操作简便，与其他检测项目无冲突，同时采血量少、准确度高、灵敏度高，便于临床推广的可用于检测婴幼儿体内25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法
发明内容
本发明的目的是解决现有25-羟基维生素D检测方法中存在的部分问题，提供一种干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，该方法具有高效率，高通量，低成本，简便操作，同时采血量少、准确度高、灵敏度高，等优点，同时该方法与其他检测项目无冲突。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：
(1)超声萃取：用打孔器取2个血斑样本，加入96孔板A中，加入700μL萃取溶剂，超声萃取，加入10μL内标工作溶液，涡旋混匀，离心，取600μL萃取液转移至96孔板B中，氮气吹干；
(2)衍生化反应：将40～100μL PTAD衍生化工作溶液加入到步骤(1)的残渣中，涡旋10s，然后置于40～65℃烘箱恒温反应10～30min，冷却2min，加入20～50μL乙醇终止反应，涡旋10s，氮气吹干；
(3)将步骤(2)得到的残渣，进一步用60～100μL复溶液复溶，涡旋使充分溶解，离心5min，上清液转移至96孔板C中，上高效液相色谱串联质谱系统进样20～40μL分析检测；其中高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪，通过高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：以水-甲醇-甲酸为流动相体系，色谱柱为C18柱，流动相的流速为0.4～1.0mL/min，柱温为30～45℃，采用多反应监测扫描模式(MRM)。
优选地，所述步骤(1)中血斑样本的直径为4.8mm。
优选地，所述步骤(1)、(2)和(3)中96孔板规格为0.1mL～2.5mL。
优选地，所述步骤(1)、(2)和(3)中批量加入和转移样本和试剂的操作采用8道或者12道移液器完成，移液器规格为10～300μL。
优选地，所述步骤(1)中萃取液为甲醇和丙酮的混合物，其体积比为60：40。
优选地，所述步骤(1)中超声萃取的条件包括80Hz超声30min，涡旋的条件包括2500rpm涡旋混匀20min，离心的条件包括15000rpm离心5min。
优选地，所述步骤(1)中内标工作液的配置方法如下：用乙醇配置浓度为1mg/mL的氘代25-羟基维生素D3(d6-25-OHD3)的内标储备液，再用乙醇进一步稀释得到浓度为1μg/mL的内标工作溶液。
优选地，所述步骤(1)和(2)中采用氮气吹干的条件包括通40～60℃氮气直至干燥。
优选地，所述步骤(2)的衍生化工作溶液的配置方法如下：用乙酸乙酯配置浓度为25mg/mL的PTAD的衍生化储备液，再用乙酸乙酯进一步稀释得到浓度为1mg/mL的衍生化次级储备液，随后用乙酸乙酯进一步稀释得到浓度为0.2mg/mL的衍生化工作溶液。
优选地，所述步骤(3)中的复溶液为甲醇-水-甲酸的混合物，其体积比为50：50：0.1。
优选地，所述高效液相色谱串联质谱法测定使用的流动相由流动相A和流动相B组成；其中流动相A为含体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B为体积分数0.1％甲酸甲醇溶液，流动相A和流动相B的体积比为40～5：60～95％。
优选地，所述色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶C18，填料粒径为1.7～5.0μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～100mm。
优选地，所述步骤(3)中，质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)和MRM模式，用于检测的25-OHD2衍生化产物和25-OHD3衍生化产物的母离子/子离子检测对如下所示：25-OHD2衍生化产物，m/z 570.2>m/z 298.2和m/z 570.2>m/z 280.2；25-OHD3衍生化产物，m/z 558.2>m/z 298.2和m/z 558.2>m/z 280.2；内标d6-25-OHD3衍生化产物的检测离子对为m/z564.2>m/z 298.2。
更进一步地，所述25-羟基维生素D3(25-OHD3)衍生化产物和25-羟基维生素D2(25-OHD2)衍生化产物的保留时间分别为2.0min和2.1min。
基于上述的实验条件，经过多次试验验证，本发明的精密度RSD％<10％。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下所示：
本发明在采集过程中采用干血片作为样本，前处理操作结合了超声萃取和衍生化技术，待测化合物从复杂的样本基质中提取并净化后，通过衍生化反应转化为离子化效率更高的产物，最终通过液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测。此种方法优势在于：采用干血片样本，仅需75μL末梢血就可进行检测，因此非常适合采血困难人群如婴幼儿的检测；一次检测就可同时给出准确的25-OHD2和25-OHD3检测结果；采用衍生化方法，在目标化合物上引入了极性基团使得待测化合物极性变大，保留时间更短，大大缩短了单个样本的检测时间；同时采用超声萃取和衍生化反应大大提高了检测的灵敏度，25-OHD2和25-OHD3的最低检测限可低达2ng/mL和5ng/mL；采用干血片作为检测基质，运输和保存更方便；此外，所用试剂均为常规试剂容易购买，且成本低廉便于推广。与现有的干血片检测技术相比，本发明具有以下几个显著的优点：(1)采用96孔板方法处理样本可提高检测的效率和通量，节约人力成本，同时降低操作中人为误差的几率；(2)通过改进衍生化方法，衍生化时间只需要对比文件方法的一半，从而大幅减少了样本前处理的时间。(3)通过改进液相梯度洗脱程序，使单个样本的仪器分析时间从5min缩短到3min，提高了检测的效率和样本数量。每80个样本的总检测时间(包括样本处理时间和仪器检测时间)采用原方法需要16小时，而本专利方法仅需要6个小时。(4)质谱方法中采用适用范围广的ESI离子源进行检测，从而，可以在同一设备上开展其他多个检测项目，提高质谱仪器的使用效率，降低了高昂的仪器成本，同时降低了仪器的日常清洗维护频率。
总之，本方法可快速及时的检测婴幼儿维生素D水平，有效预防佝偻病等的发生，适合于婴幼儿人群，因此该方法可有效满足这一临床需求。此外，与已有干血片检测方法相比较，本发明具有高效率，高通量，低成本，操作简便，采血量少、准确度高、灵敏度高，与其他检测项目无冲突等优势，同时维护清洗要求较低。因此，该方法适于在临床进行推广，具有广泛的临床应用价值。
本发明还提供了一种制备干血片空白基质的方法。任何需要检测人体内源性物质浓度的空白基质都可采用该方法进行制备，因而本发明可以根据临床检测需求进行拓宽。
附图说明：
图1a和图1b分别是检测2ng/mL 25-OHD2和5ng/mL 25-OHD3的定量下限的色谱图；
图2a和图2b分别是25-OHD2和25-OHD3的标准曲线；
图3是25-OHD2和25-OHD3在干血片和血清中检测结果的相关性(169例受试者干血片与血清样本中25-羟基维生素D3的比对结果)。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明用于25-羟基维生素D检测的具体实现过程。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例：一种干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法
一、溶液配置
标准工作溶液配置：准确称量25-OHD2和25-OHD3标准品，加入乙醇溶解并稀释成浓度为1mg/mL的一级储备液。
衍生化工作溶液配置：准确称量5mg PTAD标准品，加入200μL乙酸乙酯溶解并稀成浓度为25mg/mL的PTAD衍生化储备液。取40μL该储备液于2mL离心管中，加入960μL的乙酸乙酯，涡旋混匀，稀释成浓度为1mg/mL的PTAD衍生化次级储备液。取200μL次级储备液于2mL离心管中，加入800μL乙酸乙酯，涡旋混匀，得到浓度为0.2mg/mL的PTAD衍生化工作溶液。
内标工作溶液配置：准确称量d6-25-OHD3标准品，加入乙醇稀释成浓度为1mg/mL的25-OHD3-d6的内标储备液，再用乙醇进一步稀释得到浓度为1μg/mL的内标工作溶液。
空白基质配置：
取健康人群全血，静止分层后除去上层血浆，倒入15mL离心管中混匀。加入等体积生理盐水轻轻摇匀后3000rpm离心10min后去除上层生理盐水。重复清洗三次后加入一定比例的生理盐水(血细胞体积：生理盐水体积为6：4)，摇匀即得用于制备干血片标准曲线和质控品的空白全血。
干血片标准曲线的制备：
从-80℃冰箱中取出25-OHD2与25-OHD3的一级储备液，浓度均为1mg/mL。取25-OHD2一级储备液0.02mL加入到1.5mL离心管中，加入180μL乙醇混匀后得到浓度为100μg/mL的25-OHD2二级储备液。取1mg/mL的25-OHD3溶液0.02mL和100μg/mL的25-OHD2二级储备液0.08mL置于1.5mL离心管中，加入50％甲醇溶液0.9mL，得到8μg/mL的25-OHD2和20μg/mL的25-OHD3溶液作为混合三级储备液，用于制备系列标准曲线溶液。具体浓度见下表1。
表1标准曲线浓度
配制完成后取适量上述已经配制完成的系列标准曲线溶液，滴至每个血斑的虚线框内，自由扩散形成一个血斑，采血后将滤纸片略弯曲避免血液在纸片上渗透时与其他表面接触，自然阴干至少4小时(在潮湿气候下至少24小时)，避免阳光和紫外线直射。血斑充分干燥后，将滤纸片放入密封袋中，避免滤纸之间标本的相互污染，置于-20℃冰箱保存备用。
二、具体操作步骤：
(1)用打孔器取2个直径4.8mm的血斑样本，置于96孔板A中，加入700μL甲醇-丙酮(60：40，v/v)，80Hz超声30min，随后加入10μL内标工作溶液(10ng/mL的d6-25-OHD3)，2500rpm涡旋混匀20min，15000rpm离心5min，取600μL萃取液转移至96孔板B中，40℃氮气吹干；
(2)向(1)中残渣加入60μL衍生化工作溶液，涡旋10s，50℃烘箱衍生化反应30min，冷却2min，随后加入40μL乙醇终止反应，涡旋10sec后，40℃氮气吹干；
(3)残渣用100μL甲醇-水-甲酸(50：50：0.1，v/v/v)复溶，涡旋30s，15000rpm离心5min，上清液转移至96孔板C(型号)中，30μL进液相色谱质谱联用系统分析；
步骤(3)中的复溶液为甲醇-水-甲酸，体积比为50：50：0.1；
步骤(3)所述的质谱为三重四级杆质谱仪；
步骤(3)通过液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18(2.7μm,3.0×50mm，90A)，流速为0.7mL/min，柱温为40℃；
梯度洗脱程序见表1；
流动相A为含体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B为体积分数0.1％甲酸甲醇溶液；A相∶B相体积比为40～5％：60～95％，按表1梯度程序洗脱。流动相的流速为0.7mL/min。
25-OHD3和25-OHD2衍生化产物的保留时间分别为2.0min和2.1min。
质谱条件如表2所示；
表2质谱条件
按以上液相条件分离后，采用电喷雾离子源(ESI)和MRM进行质谱检测，用于检测的25-OHD2衍生化产物和25-OHD3衍生化产物的母离子/子离子检测对如下所示：25-OHD2衍生化产物，m/z 570.2>m/z 298.2和m/z 570.2>m/z 280.2；25-OHD3衍生化产物，m/z 558.2>m/z298.2和m/z 558.2>m/z 280.2；内标d6-25-OHD3衍生化产物的检测离子对为：m/z564.2>m/z298.2。以上检测离子对的MRM质谱参数如表3所示；
表3检测离子对质谱MRM参数
图1a和图1b分别示出了定量下限为2ng/mL的25-OHD2和5ng/mL25-OHD3的色谱图。
采用内标法建立标准曲线。如图2a、图2b、和表4可知，25-OHD2在2～40ng/mL的线性范围内，25-OHD3在5～100ng/mL线性相关性良好，相关系数r分别为0.9981和0.9982，准确度范围分别为97.6％～105.2％和99.4％～103.8％。
表4：标准曲线结果
本发明已用于临床批量样本的检验测定，结果表明该方法线性范围能够满足临床检验的需要。此外本方法进一步进行干血片和血清样本检测结果的相关性分析(见图3)，通过研究169例健康受试者的血清和末梢血样本，得出两组样本结果之间的相关性，因考虑不同人体之间的个体差异，采用0.65的Ratio值乘以血清的参考范围(≤14岁：20-100ng/mL；＞14岁：30-100ng/mL)，得到25-羟基维生素D干血片的参考范围为≤14岁：13.1-65.0ng/mL；＞14岁：19.6-65.0ng/mL。结果表明，该方法可通过检测干血片样本的浓度可对个体循环系统的维生素D水平进行非常准确的预测。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (14)
1.干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)超声萃取：用打孔器取2个血斑样本，加入96孔板A中，加入700μL萃取溶剂，超声萃取，加入10μL内标工作溶液，涡旋混匀，离心，取600μL萃取液转移至96孔板B中，氮气吹干；
(2)衍生化反应：将40～100μL PTAD衍生化工作溶液加入到步骤(1)的残渣中，涡旋10s，随后置于40～65℃烘箱恒温反应10～30min，冷却2min，加入20～50μL乙醇终止反应，涡旋10s，氮气吹干；
(3)将步骤(2)得到的残渣，进一步用60～100μL复溶液复溶，涡旋使充分溶解，离心5min，上清液转移至96孔板C中，上高效液相色谱串联质谱系统进样20～40μL分析检测；其中高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪，通过高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：以水-甲醇-甲酸为流动相体系，色谱柱为C18柱，流动相的流速为0.4～1.0mL/min，柱温为30～45℃，采用多反应监测扫描模式(MRM)。
2.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中血斑样本的直径为4.8mm。
3.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)、(2)和(3)中96孔板规格为0.1～2.5mL。
4.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)、(2)和(3)中批量加入和转移样本和试剂的操作采用8道或者12道移液器完成，移液器规格为10～300微升。
5.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中萃取液为甲醇和丙酮的混合物，其体积比为60：40。
6.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中超声萃取的条件包括80Hz超声30min，涡旋的条件包括2500rpm涡旋混匀20min，离心的条件包括15000rpm离心5min。
7.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中内标工作液的配置方法如下：用乙醇配置浓度为1mg/mL的氘代25-羟基维生素D3(d6-25-OHD3)的内标储备液，再用乙醇进一步稀释得到浓度为1μg/mL的内标工作溶液。
8.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中采用氮气吹干的条件包括通40～60℃氮气直至干燥。
9.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的衍生化工作溶液的配置方法如下：用乙酸乙酯配置浓度为25mg/mL的PTAD的衍生化储备液，再用乙酸乙酯进一步稀释得到浓度为1mg/mL的衍生化次级储备液，随后用乙酸乙酯进一步稀释得到浓度为0.2mg/mL的衍生化工作溶液。
10.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的复溶液为甲醇-水-甲酸的混合物，其体积比为50：50：0.1。
11.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱法测定使用的流动相由流动相A和流动相B组成；其中流动相A为含体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B为体积分数0.1％甲酸甲醇溶液，流动相A和流动相B的体积比为40～5：60～95％。
12.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶C18，填料粒径为1.7～5.0μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～100mm。
13.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)和MRM模式，用于检测的25-OHD2衍生化产物和25-OHD3衍生化产物的母离子/子离子检测对如下所示：25-OHD2衍生化产物，m/z 570.2>m/z 298.2和m/z 570.2>m/z 280.2；25-OHD3衍生化产物，m/z 558.2>m/z 298.2和m/z 558.2>m/z 280.2；内标d6-25-OHD3衍生化产物的检测离子对为m/z564.2>m/z 298.2。
14.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维生素D的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中25-羟基维生素D3(25-OHD3)衍生化产物和25-羟基维生素D2(25-OHD2)衍生化产物的保留时间分别为2.0min和2.1min。
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