CN115184482A - 一种lc-ms/ms检测脂溶性维生素的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学检测技术领域，公开了一种LC‑MS/MS检测脂溶性维生素的试剂盒。该试剂盒包括：内标准品、校准品、质控品、洗脱液A、洗脱液B；所述内标准品含有脂溶性维生素的同位素标记物；所述校准品含有BSA和脂溶性维生素；所述质控品含有空白基质和脂溶性维生素；所述洗脱液A为氨水溶液；所述洗脱液B为甲醇。该试剂盒可用于同时检测人血清中的多种脂溶性维生素，并体现出良好的检测准确性。

Description

一种LC-MS/MS检测脂溶性维生素的试剂盒
技术领域
本发明属于化学检测技术领域，尤其涉及一种LC-MS/MS检测脂溶性维生素的试剂盒。
背景技术
维生素A、维生素D、维生素E和维生素K1均属于脂溶性维生素(Fat-solublevitamins，FSVs)。其中，维生素A又称视黄醇，其主要生理作用为促进细胞的增殖和生长，保护器官上皮组织结构的完整和健康，缺乏可引发全身性病变，视觉功能障碍等。维生素D又称钙化醇，在人体内主要以维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)两种形式存在。维生素D对维持钙的代谢和骨骼的正常发育有极其重要的作用，在肝脏可转化为相应的25羟基维生素D(25-OH-VD2和25-OH-VD3)，因此体内25-OH-VD2、25-OH-VD3可作为检测维生素D水平的生物标志物。维生素E又称生育酚，其中α-生育酚的活性最高，主要参与脂肪代谢，维持内分泌的正常机能，使性细胞正常发育，提高繁殖性能。维生素K1又称为叶绿醌，在食物和人体中广泛存在。维生素K1是肝脏合成凝血因子II、VII、IX、X不可缺少的物质，缺乏时会引起低凝血酶原血症，出现凝血障碍。由此可见，此类脂溶性维生素会影响到人体的营养状态起到了重要作用，因而可对人体血清中上述脂溶性维生素的含量进行检测。
随着液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)在化学检测中的应用，越来越多的相应商品化试剂盒被开发出来，但也存在重复性较差，灵敏度不高，定性定量准确性差等问题。针对此问题，本发明希望提出一种基于液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，并用于脂溶性维生素高效检测的试剂盒。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种LC-MS/MS检测脂溶性维生素的试剂盒。该试剂盒可用于同时检测人血清中包括维生素A(VA)、25羟基维生素D2(25-OH-VD2)、25羟基维生素D3(25-OH-VD3)、维生素E(VE)、维生素K1(VK1)在内的多种脂溶性维生素，并体现出良好的检测准确性。
本发明提供了一种LC-MS/MS检测脂溶性维生素的试剂盒，包括：内标准品、校准品、洗脱液A、洗脱液B；
所述内标准品含有脂溶性维生素的同位素标记物；
所述校准品含有BSA(牛血清白蛋白-磷酸盐)和脂溶性维生素；
所述质控品含有空白基质和脂溶性维生素；
所述洗脱液A为氨水溶液；所述洗脱液B为甲醇。
优选地，所述内标准品中脂溶性维生素的同位素标记物包括VA-IS、25-OH-VD2-IS、25-OH-VD3-IS、VE-IS、VK1-IS中的至少一种。
优选地，所述校准品中脂溶性维生素包括VA、25-OH-VD2、25-OH-VD3、VE、VK1中的至少一种。
优选地，所述质控品中脂溶性维生素包括VA、25-OH-VD2、25-OH-VD3、VE、VK1中的至少一种。
更优选地，所述内标准品、校准品、质控品中至少一种的剂型为冻干粉。
进一步优选地，所述内标准品由含VA-IS、25-OH-VD2-IS、25-OH-VD3-IS、VE-IS和VK1-IS的乙腈溶液经浓缩制得。
进一步优选地，所述校准品由含VA、25-OH-VD2、25-OH-VD3、VE和VK1的BSA溶液经冻干制得。
进一步优选地，所述质控品由含VA、25-OH-VD2、25-OH-VD3、VE和VK1的空白基质溶液经冻干制得。
优选地，所述洗脱液A为0.08-0.12％的氨水溶液。
更优选地，所述洗脱液A为0.1％的氨水溶液。
优选地，所述试剂盒还包括蛋白沉淀剂、萃取剂、复溶剂中的至少一种。
更优选地，所述蛋白沉淀剂为乙腈、硫酸锌水溶液中的至少一种。
更优选地，所述萃取剂为正己烷。
更优选地，所述复溶剂为甲醇水溶液。
本发明还提供了一种LC-MS/MS检测脂溶性维生素的方法，采用上述试剂盒进行检测，包括以下步骤：
(1)标准曲线建立：将校准品配置为系列浓度并加入内标准品，经LC-MS/MS检测，以校准品中目标脂溶性维生素与其对应同位素标记物的浓度比为X轴，校准品中目标脂溶性维生素与其对应同位素标记物的峰面积比为Y轴，得到标准工作曲线；
(2)样品的测定：在待测样品中加入内标准品，采用与步骤(1)相同的LC-MS/MS检测，并根据所述标准工作曲线得到待测样品中脂溶性维生素的含量；
所述LC-MS/MS检测的条件为：
液相条件：流动相A为洗脱液A，流动相B为洗脱液B；
质谱条件：离子化方式为电喷雾离子化正模式(ESI+)；多反应监测模式(MRM)；喷雾电压：2.0kV；去溶剂温度：500℃；雾化器流速：800L/h；离子源温度：150℃；锥孔气流速：65L/hr。
优选的，所述校准品使用水进行溶解，所述内标准品使用乙腈进行溶解。
优选地，所述脂溶性维生素的种类包括维生素A(VA)、25羟基维生素D2(25-OH-VD2)、25羟基维生素D3(25-OH-VD3)、维生素E(VE)、维生素K1(VK1)中的至少一种。
优选地，步骤(1)和/或步骤(2)中，在进行LC-MS/MS检测前，对待测溶液进行以下前处理操作：依次加入蛋白沉淀剂和萃取剂，离心取上清液后，再加入复溶剂进行处理。
优选地，所述液相条件还包括梯度洗脱，所述梯度洗脱的条件为：
0-1.5min：流动相A的体积分数为30％，流动相B的体积分数为70％；
1.5-2min：流动相A的体积分数由30％变化至15％，流动相B的体积分数由70％变化至85％；
2-4.5min：流动相A的体积分数为15％，流动相B的体积分数为85％；
4.5-4.51min：流动相A的体积分数由15％变化至30％，流动相B的体积分数由85％变化至70％；
4.51-5.51min：流动相A的体积分数为30％，流动相B的体积分数为70％。
更优选地，所述梯度洗脱的流速为0.4-0.6mL/min。
优选地，所述液相条件还包括：色谱柱为UPLC ACQUITYTM BEH Phenyl column(2.1mm×50mm×1.7μm，Waters，Milford，USA)。
更优选地，所述色谱柱的柱温为38-42℃。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明所述试剂盒将氨水溶液和甲醇作为洗脱液，可同时检测人血清中包括维生素A(VA)、25羟基维生素D2(25-OH-VD2)、25羟基维生素D3(25-OH-VD3)、维生素E(VE)、维生素K1(VK1)在内的多种脂溶性维生素，并体现出良好的检测准确性和灵敏度。此外，本发明采用BSA(牛血清白蛋白-磷酸盐)作为基质替代物，可有效减少与人血清样本基质的差异，从而提高定量的准确度。
附图说明
图1为校准品中脂溶性维生素的提取离子流色谱图；
图2为血清样品中脂溶性维生素的提取离子流色谱图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种LC-MS/MS检测脂溶性维生素的试剂盒，包括：
内标准品(浓缩物)：包含脂溶性维生素的同位素标记物VA-IS、25-OH-VD2-IS、25-OH-VD3-IS、VE-IS和VK1-IS，经浓缩后制得。其中，25-OH-VD2-IS购自IsoSciences，VA-IS、25-OH-VD3-IS、VE-IS和VK1-IS购自IsoReag；
校准品(冻干粉)：包含VA、25-OH-VD2、25-OH-VD3、VE和VK1，5％BSA(牛血清白蛋白-磷酸盐)，PBS缓冲液，防腐剂，抗氧化剂(BHT)，经冻干后制得；
质控品(冻干粉)：包含VA、25-OH-VD2、25-OH-VD3、VE和VK1，空白基质，防腐剂，抗氧化剂，经冻干后制得；
蛋白沉淀剂：乙腈、硫酸锌水溶液；
萃取剂：正己烷；
复溶剂：80％甲醇；
洗脱液A：0.1％氨水溶液；
洗脱液B：甲醇。
实施例2
本实施例提供一种LC-MS/MS检测脂溶性维生素的方法，采用实施例1中试剂盒进行检测，包括以下步骤：
(1)标准曲线建立：
以乙腈为溶剂，将内标准品配置为6000ng/mL VA-IS、400ng/mL 25-OH-VD2-IS、400ng/mL 25-OH-VD3-IS、6000ng/mL VE-IS、60ng/mL VK1-IS的内标准品储备液；再以内标准品储备液与乙腈以1:99的体积比配置为内标准品工作液；
以去离子水为溶剂，按照表1将校准品配置得到6个浓度(各脂溶性维生素的浓度单位均为ng/mL)的校准品溶液(命名为S1-S6)：
表1校准品溶液浓度
VA 25-OH-VD2 25-OH-VD3 VE VK1
S1 20 2 2 200 0.1
S2 50 5 5 500 0.25
S3 200 20 20 2000 1
S4 500 50 50 5000 2.5
S5 1000 100 100 10000 5
S6 2000 200 200 20000 10
以去离子水为溶剂，按照表2将质控品配置得到3个浓度(各脂溶性维生素的浓度单位均为ng/mL)的质控品溶液(命名为QC(Low)、QC(Med)、QC(High))：
表2质控品溶液浓度
VA 25-OH-VD2 25-OH-VD3 VE VK1
QC(Low) 40 4 4 400 0.2
QC(Med) 400 40 40 4000 2
QC(High) 1200 120 120 12000 6
分别移取100μL待测血清样品、校准品溶液、质控品溶液至对应的2mL离心管内，各加入500μL内标准品工作液，涡旋30s；再加入100μL硫酸锌水溶液(称取0.69g硫酸锌，溶于12mL去离子水中)，涡旋30s；加入800μL正己烷，涡旋5min；4℃下离心5min，取650μL上清液至1.0mL 96孔板中，用氮气吹干；加入120μL 80％甲醇，盖上封板铝膜，涡旋5min，4℃下离心5min；取100μL上清液至350μL 96孔板中，盖上硅胶盖垫，待LC-MS/MS检测。
LC-MS/MS检测的条件为：
超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)仪器为Waters UPLC Xevo TQ-S MicroIVD。
液相条件：色谱柱为UPLC ACQUITYTM BEH Phenyl column(2.1mm×50mm×1.7μm,Waters,Milford,USA)；柱温40℃；进样体积5μL。
采用梯度洗脱，流动相A为洗脱液A，流动相B为洗脱液B：
0-1.5min：流动相A的体积分数为30％，流动相B的体积分数为70％；
1.5-2min：流动相A的体积分数由30％变化至15％，流动相B的体积分数由70％变化至85％；
2-4.5min：流动相A的体积分数为15％，流动相B的体积分数为85％；
4.5-4.51min：流动相A的体积分数由15％变化至30％，流动相B的体积分数由85％变化至70％；
4.51-5.51min：流动相A的体积分数为30％，流动相B的体积分数为70％。
洗脱流速为0.45mL/min。
质谱条件：离子化方式为电喷雾离子化正模式(ESI+)；多反应监测模式(MRM)；喷雾电压：2.0kV；去溶剂温度：500℃；雾化器流速：800L/h；离子源温度：150℃；锥孔气流速：65L/hr。母离子Q1、子离子Q3、去簇电压CV和碰撞能电压CE等质谱检测参数如表3所示。
表3质谱检测参数
目标分析物 Q1(Da) Q3(Da) CV(V) CE(V)
VA 269.2 93.1 20 19
25-OH-VD2 413.3 113.1 20 10
25-OH-VD3 383.3 257.2 20 15
VE 431.4 165.1 20 60
VK1 451.4 187.1 20 22
VA-IS 272.3 94.1 20 19
25-OH-VD2-IS 416.4 113.1 20 10
25-OH-VD3-IS 386.3 257.2 20 15
VE-IS 437.4 171.1 20 22
VK1-IS 457.4 193.3 20 22
使用MassLynx V4.2软件进行质谱采集和分析。
以校准品溶液中目标脂溶性维生素与其对应同位素标记物的浓度比为X轴，校准品溶液中目标脂溶性维生素与其对应同位素标记物的峰面积比为Y轴，绘制得到标准工作曲线；根据标准工作曲线以及待测血清样本的LC-MS/MS检测结果，计算得到待测血清样品中VA、25-OH-VD2、25-OH-VD3、VE、VK1的浓度。
图1-2分别为校准品、血清样本中脂溶性维生素的提取离子流色谱图。
实施例3：流动相比较
实验组：洗脱液A：0.1％氨水溶液；洗脱液B：甲醇。
对照组1：流动相A为水，流动相B为甲醇。
对照组2：流动相A为含0.1％甲酸和1mmo/L甲酸铵的水溶液，流动相B为甲醇。
采用实施例2的检测方法，分别使用以上三种流动相体系对人血清样品进行检测，表4所示为各流动相体系下脂溶性维生素的响应程度(峰面积)。
表4脂溶性维生素的响应程度
VA 25-OH-VD2 25-OH-VD3 VE VK1
对照组1 29630 611 1129 7051 2298
对照组2 42516 1209 2905 22235 8711
实验组 40760 2405 5976 41776 19441
由表4可得，实验组中脂溶性维生素的响应程度普遍要高于对照组1-2，表明选用含0.1％氨的水溶液作为流动相能有效提高脂溶性维生素的响应。
实施例4
将实施例1校准品中的基质由5％牛血清白蛋白-磷酸盐(BSA)替换为30％乙醇，并以此作为对照组。
分别以实施例1中校准品和上述对照组为实验材料，采用实施例2的方法绘制得到两条标准工作曲线。用这两种标准曲线对SRM968f(美国NIST)冷冻人血清level中的脂溶性维生素进行定量，并与靶值进行比较，比较结果分别如表5-6所示：
表5 5％BSA标准曲线对NIST样本的定量结果
Figure BDA0003679078260000071
Figure BDA0003679078260000081
表6 30％乙醇标准曲线对NIST样本的定量结果
30％乙醇标准曲线定量结果 靶值 相对偏移 评价结果
VA 285 327 -12.8 通过
VD3 11.4 12.8 -10.9 通过
VE 3455 5150 -32.9 不通过
VK1 0.198 0.227 -12.8 通过
注：SRM968f中VD2含量为0.83ng/mL，低于本方法定量下限，因此无参考意义，故不予展示。
由表5-6可知，5％BSA标准曲线定量结果均通过，而30％乙醇标准曲线定量结果中VE定量结果不通过，可见以5％BSA为基质绘制标准曲线能更准确的定量测定血清样本中的脂溶性维生素。
实施例5
采用实施例3中的两种标准曲线对正常人血清低、中、高三个水平的加标回收率进行评价，评价结果如表7-8所示。
表7 5％BSA标准曲线定量正常人血清加标回收率
Figure BDA0003679078260000082
表8 30％乙醇标准曲线定量正常人血清加标回收率
Figure BDA0003679078260000083
Figure BDA0003679078260000091
由表7-8可知，5％BSA标准曲线定量正常人血清的加标回收率在88.7％-110％之间，满足定量要求；而30％乙醇标准曲线定量正常人血清的加标回收率在53.5％-110％之间，无法满足定量要求，因此采用5％BSA作为基质，检测准确度更高。
实施例6
以5％牛血清白蛋白-磷酸盐(BSA)为基底，采用同位素内标法进行定量，以校准品溶液中目标脂溶性维生素与其对应同位素标记物的浓度比为X轴，校准品溶液中目标脂溶性维生素与其对应同位素标记物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线。对5种脂溶性维生素的线性方程进行拟合，相应结果如表9所示。
表9线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0003679078260000092
由表9可知，上述线性方程的线性良好，相关系数在0.99以上，可满足定量需求。
实施例7
取正常人血清分别进行低、中、高三个浓度的加标后，每组各设置6个平行，连续处理三天，测定5种脂溶性维生素的浓度，计算批内精密度和批间精密度，测试结果见表10。
表10精密度测试结果
Figure BDA0003679078260000101
由表10可知，批间和批内精密度分别在1.60％-7.70％和2.39％-7.31％之间，重现性良好
实施例8
采用实施例1中校准品溶液S1作为检测样品，进行最低定量限试验，测试结果如表11所示。
表11最低定量限
平行样本编号 VA 25-OH-VD2 25-OH-VD3 VE VK1
1 19.1 2.15 2.11 209 0.116
2 19.8 1.84 1.91 205 0.101
3 23.1 2.23 2.17 195 0.110
4 21.0 1.87 2.03 203 0.098
5 22.9 2.17 2.23 199 0.102
6 21.6 2.24 1.93 193 0.106
平均值(ng/mL) 21.3 2.08 2.06 201 0.105
标准偏差 1.62 0.18 0.13 6.12 0.01
CV(％) 7.60 8.66 6.27 3.05 6.39
定量下限(ng/mL) 20 2.0 2.0 200 0.10
由表11可知，本发明所提出的检测脂溶性维生素的方法检测灵敏度高，可满足临床检测的需求。
上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种LC-MS/MS检测脂溶性维生素的试剂盒，其特征在于，包括：内标准品、校准品、质控品、洗脱液A、洗脱液B；
所述内标准品含有脂溶性维生素的同位素标记物；
所述校准品含有BSA和脂溶性维生素；
所述质控品含有空白基质和脂溶性维生素；
所述洗脱液A为氨水溶液；所述洗脱液B为甲醇。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标准品中脂溶性维生素的同位素标记物包括VA-IS、25-OH-VD2-IS、25-OH-VD3-IS、VE-IS、VK1-IS中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述内标准品、校准品、质控品中至少一种的剂型为冻干粉。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述内标准品由含VA-IS、25-OH-VD2-IS、25-OH-VD3-IS、VE-IS和VK1-IS的乙腈溶液经浓缩制得。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品由含VA、25-OH-VD2、25-OH-VD3、VE和VK1的BSA溶液经冻干制得。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品由含VA、25-OH-VD2、25-OH-VD3、VE和VK1的空白基质溶液经冻干制得。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液A为0.08-0.12％的氨水溶液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液A为0.1％的氨水溶液。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括蛋白沉淀剂、萃取剂、复溶剂中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白沉淀剂为乙腈、硫酸锌水溶液中的至少一种；所述萃取剂为正己烷；所述复溶剂为甲醇水溶液。
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