CN114910592A - 一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法,以及使用该阴性血清检测脂溶性维生素的方法和试剂盒。该制备脂溶性维生素阴性血清的方法可以包括:在血清中加入萃取试剂,混匀后静置或离心,取下层血清,其中该萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷。通过该方法可以简便得制备脂溶性维生素血清,从而能够提升检测血清中脂溶性维生素的准确性。
Description
技术领域
本申请涉及体外诊断医学检验领域,尤其是一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法,以及检测血清中的脂溶性维生素的试剂盒。
背景技术
脂溶性维生素,包含维生素A、D、E、K,是酶的辅基和酶的组成部分,对生物体的新陈代谢起调节作用,是人体生长和发育不可或缺的重要营养元素之一。脂溶维生素在体内的浓度分布跨度较大,且不同种维生素之间存在协同或拮抗作用,因此同时监测多种脂溶维生素是非常必要的。正常血清中由于存在一定浓度的脂溶维生素,导致无法直接用人或动物血清直接配制准确浓度校准品或质控品。
在现有技术中,对于血清中脂溶维生素的精准检测,一般使用与待测样本基质相同或相近的基质(例如,牛血清白蛋白(BSA))来配制校准品或质控品。脂溶性维生素在水溶液中溶解度极低,其在血液中主要与血浆蛋白结合,如人血液中的25-羟基维生素D(25OHD),仅有0.03%的 25OHD以游离形式存在,在血液中绝大多数与维生素D结合蛋白(Vitamin D-Binding Protein)结合,形成较稳定的维生素蛋白结合物。若使用诸如 BSA的非血清基质配制脂溶维生素,由于缺少能与脂溶性维生素特异性结合的蛋白而导致样本极易降解。
在现有的检测脂溶性维生素的方法中,为了尽可能地使脂溶性维生素从特异性结合蛋白中释放出来,往往采用诸如甲醇的蛋白沉淀剂/蛋白变性剂来破坏蛋白结构,从而尽可能提取到更多的脂溶性维生素。但是,为了制备脂溶性维生素阴性的血清用于配制检测脂溶性维生素的标准品溶液,则需要尽可能保留血清基质中的生物特性。
因而,在现有技术(例如,现有技术文献Lote-OkeR,Pawar J,Kulkarni S,etal.Author Correction:A LC–MS method for 25-hydroxy-vitamin D3 measurementsfrom dried blood spots for an epidemiological survey in India[J]. ScientificReports,2021,11(1),以及现有技术文献Carter G,Card D J. Methods for assessmentof Vitamin D[J].2019.)中,通过吸附剂吸附血清中脂溶性维生素,然后经过离心过滤,将吸附剂去除,来制备保留了血清基质生物特性的脂溶性维生素“阴性”的血清。但经该方法处理的血清中仍然残留一定量的脂溶性维生素,导致干扰检测结果;此外,活性炭会吸附血清中许多脂小分子外还会吸附一些多肽和蛋白(例如,现有技术文献 TuC,Fiandalo M V,Pop E,et al.Proteomic Analysis of Charcoal-Stripped Fetal Bovine SerumReveals Changes in the Insulin-Like Growth Factor Signaling Pathway[J].Journal of Proteome Research,2018,17(9)),例如会吸生长因子结合蛋白,因此该方法会将血清中的其他成分一起去除,破坏血清基质的生物特性。
发明内容
针对现有技术,为实现脂溶维生素的精准精测,亟需开发一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法,以及使用该阴性血清检测脂溶性维生素的方法和试剂盒。
本申请的一个方面是提供一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法,该方法可以包括:在血清中加入萃取试剂,混匀后静置或离心,取下层血清;其中该萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷。
优选地,组分2为正己烷。
优选地,萃取试剂的组分1为二氯甲烷和/或乙酸乙酯,组分2为正己烷;其中组分1与组分2的体积比为1.5:1至9:1;优选为3:1至9:1;优选为5:1至9:1;优选为7:1至9:1;优选为8:1至9:1。
优选地,萃取试剂与血清的体积比为1:5至4:5。
优选地,该方法还包括:将下层血清置于30W-150W紫外灯下照射;优选地,置于100W-150W的紫外灯下照射;优选地,将血清置于紫外灯距离紫外灯10cm-50cm处,照射6h至24h。
本申请的另一方面是提供一种检测脂溶性维生素的方法,该方法可以包括:
a.标准品的配制:向权利要求1至6任一项所述方法获得的脂溶性维生素阴性血清中加入一种或多种待测的脂溶性维生素;
b.将步骤a获得的脂溶性维生素标准品溶液进行浓度梯度稀释,获得多个浓度的稀释液;以及
c.测量所述多个浓度的稀释液中的脂溶性维生素浓度,使用针对所述多个浓度的稀释液的测量结果获得标准曲线,利用标准曲线计算待测样品的脂溶性维生素浓度。
优选地,其中所述待测的脂溶性维生素包含包括以下中的至少一种:维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。
优选地,所述的维生素D选自25-羟基维生素D2和25-羟基维生素 D3。
优选地,所述方法还包括:在稀释液中加入针对待测的脂溶性维生素的内标液、沉淀剂、以及萃取试剂,混匀后离心,取上清液;吹干上清液,向吹干后的样品中加入复溶液,离心去除不溶物后使用LC-MS/MS测量一种或多种脂溶性维生素浓度;
优选地,所述萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷。
优选地,在LC-MS/MS测量中,针对所述多个浓度的稀释液中的任意一种待测脂溶性维生素,以待测物的浓度与对应内标脂溶性维生素的浓度比值为横坐标,以待测物与对应内标脂溶性维生素的峰面积的比值为纵坐标,获得标准曲线,计算待测样品的脂溶性维生素浓度。
优选地,在LC-MS/MS测量中,流动相A为甲酸水溶液,流动相B 为甲酸甲醇溶液。
本申请的又一方面是提供一种用于权利要求7所述的检测脂溶性维生素方法的试剂盒,所述试剂盒包括:萃取试剂,其中该萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷;沉淀剂;包含一个或多个浓度的待测脂溶性维生素的标准品。
优选地,其中脂溶性维生素包含以下的至少一种:维生素A、维生素 D、维生素E和维生素K。
优选地,所述试剂盒还包括内标液,该内标液含有同位素标记的待测种类的维生素。
优选地,所述试剂盒还包括复溶液。
优选地,所述试剂盒还包括流动相试剂,所述流动相试剂包含甲酸和 /或甲醇。
本申请的有益效果
本申请各个方面提供了用于制备脂溶性维生素阴性血清的萃取试剂和方法、用于检测脂溶性维生素的方法、以及用于其的试剂盒,这些方面至少可以实现以下有益效果中的至少一者:
1)通过该萃取试剂、阴性血清制备方法,在保护血清基质完整性(特别是血清中与脂溶性维生素相结合的蛋白活性)的情况下,获得脂溶性维生素阴性血清中仅残余痕量的脂溶性维生素,或者基本不含有脂溶性维生素,操作简单,效果显著;
2)在制备脂溶性维生素阴性血清的过程和检测脂溶性维生素的过程中,该萃取试剂及使用该萃取试剂的方法,可以保护血清不发生乳化,增加了萃取效率/检测效率,并且具有消泡的作用,保护了血清基质,并且使得阴性血清的得率较高,降低了成本;和/或
3)利用脂溶性维生素阴性血清,在检测人或动物血清中脂溶性维生素含量时,可以排除内源性维生素的干扰,使得标准曲线的线性相关系数更接近于1,进而使得待测样本的结果更接近真实值。
在详细地描述本申请的各种示例实施例和各种示例实施方式之前,为了使本申请的各方面更加明晰,可以有利地定义以下术语。未定义或为特别说明的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非在本文中另有明确的特别说明,否则本申请中所有的科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非在本文中另有明确的特别说明,本申请涉及通常用于医学检验领域的常规技术。本领域技术人员可以理解的是,具有相同或类似含义的名称或术语可以在本申请中互换地使用。
脂溶性维生素
如本文所使用的,术语“脂溶性维生素”(Fat-solubleVitamin,FSV) 可以指易溶于非极性有机溶剂而不易溶于水的维生素或类维生素,可以包括维生素A类、维生素D类、维生素E类、维生素K类;然而,本领域技术人员可以理解的是,脂溶性维生素还可以包括维生素Q(辅酶Q10)、类胡萝卜素等类维生素物质。
维生素A
如本文所使用的,术语“维生素A”包括不饱和营养有机化合物视黄醇、视黄醛、视黄酸、前维生素A类胡萝卜素、视黄酯、和β胡萝卜素。已知维生素A可以包括维生素A1和维生素A2,具有附接至类异戊二烯链的β-紫罗兰酮环。例如,维生素A或视黄醇都可以表示具有以下结构式或类似结构式的物质:
维生素D
如本文所使用的,术语“维生素D”是指在生理或病理生理上拥有抗佝偻病活性的一组化合物,并且可以包括维生素D2(钙化醇,或25-羟基维生素D2)和维生素D3(胆钙化醇,或25-羟基维生素D3)。例如,25- 羟基维生素D2可以表示具有以下结构式或类似结构式的物质:
例如,25-羟基维生素D3可以表示具有以下结构式或类似结构式的物质:
维生素E
如本文所使用的,术语“维生素E”是指基于生育酚或生育三烯酚的一组化合物,并且包括α-生育酸或α-生育酚。例如,维生素E或α-生育酚可以表示具有以下结构式或类似结构式的物质:
维生素K
如本文所使用的,术语“维生素K”包括亚硫酸氢钠甲萘醌和亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌的形式,可以包括萘醌基的衍生物2-甲萘醌。此外,本领域技术人员可以理解的是,维生素K可以包括维生素K1、叶绿醌或2-甲基-3-叶绿基-1,4-萘醌,例如,维生素K1或叶绿醌可以表示具有以下结构式或类似结构式的物质:
己烷
如本文中所使用的,术语“己烷”可以表示含有6个碳原子的烷类,包括烷烃(C6H14)或环烷烃(C6H12)。本领域技术人员可以理解是的是,己烷可以包括正己烷、异己烷(例如,2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷)、新己烷(例如,2,2-二甲基丁烷)、环己烷。
脂溶性维生素阴性血清
如本文所使用的,术语“脂溶性维生素阴性血清”可以表示从血清中去除一种或多种脂溶性维生素的人或动物的血清,或者表示不含有一种或多种脂溶性维生素的人或动物的血清;特别地,本领域技术人员可以理解的是,“阴性”、“去除”、“去除全部”、“不含有”或类似表述并非专指血清中绝对地不含有脂溶性维生素,而是还可以表示相应的残余物在医学检验或分析化学方面不会影响检测结果的准确性(例如,在百分含量上小于原有物质含量的1%,在假设检验方面导致的p值小于或等于0.05,或者在分析化学方面造成的相对误差小于或等于千分之二)。
标准液和标准曲线
如本文所使用的,术语“标准液/溶液”、“标准品”、“校准液/溶液”、“校准品”或类似表述都表示:使用定量的纯度>98%或有证标准物质的维生素A、D、E、K1中的至少一种,配置的标准品,溶剂可选地为脂溶性维生素阴性血清、人工血清/血浆。将标准品经过下述预处理处理和检测步骤后,以一种或多种待测物(例如,维生素A)与对应内标物的浓度比值(Concentration Ratio)为横坐标,该一种或多种待测物与对应内标的质谱峰面积的比值(Area Ratio)为纵坐标,可以绘制标准曲线或得到标准回归函数,用于计算待测样品中该一种或多种待测物的实际含量。本领域技术人员可以根据实际应用需要,对标准曲线或回归函数进行各种改变,例如其他等效函数、查找表等。
质控品
如在本文中使用的,术语“质控品”、“质控样本”、“质控溶液”或其他类似表述,可以指用于检查分析仪器或分析方法的性能的一种或多种脂溶性维生素溶液/混合物。本领域技术人员可以理解的是,针对待测的脂溶性维生素,质控品/质控溶液的组成成分可以与标准品相同,可以根据体外诊断试剂的相关通用标准,确定一种或多种脂溶性维生素的具体含量和浓度。
内标物
如在本文中使用的,术语“内标物”、“内标液”或其他类似表述,可以指针对待检测的一种或多种脂溶性维生素的同位素标记物,用于根据同位素内标法(isotopicallylabeled internal standard)分析待测种类的维生素(例如,采用现有技术文献New LC-MS/MS method with single-step pretreatment analyzes fat-soluble vitamins inplasma and amniotic fluid(J Lipid Res.2018Sep;59(9):1783–1790)中所述的内标方法)。
串联质谱
串联质谱仪是指质谱分析器被串接的质谱仪,例如,一般含有两个或两个以上的质量分析器。在串联质谱仪中,质量分析器之间进行串接。如本发明使用串联质谱仪可以为三重四极杆质谱仪,缩写MS/MS或者QQQ,第一个MS指的是三重四极杆的碰撞池前面的四极杆质量分析器,用来扫描物质的母离子,第二个MS指的是碰撞池后面的四极杆,用来扫描物质的碎片离子。两个四极杆直接为碰撞池,用于化合物碎裂,形成碎片离子。在第一个MS中,在创建一级质谱期间检测并记录了代表一种(和可能多于一种)化学成分的离子。离子所代表的物质要经过第二个MS或者后续多个MS,其中感兴趣的物质会发生碎片化,以使该物质分解为子成分,这些子成分将被检测并记录为二级质谱。
色谱
术语“色谱”或“色谱法”是指一种物理分离方法,其中待分离的组分(即化学成分)分配在两相之间,其中一相为固定的(固定相),而另一相 (流动相)沿确定的方向移动。流动相可以是气体(“气相色谱法”、“GC”) 或液体(“液相色谱法”、“LC”)。本发明中的LC-MS/MS是指液相色谱 -串联质谱法。
脂溶性维生素阴性血清的制备
在本申请的一种实施方式中,可以提供一种用于制备脂溶性维生素阴性血清的试剂,试剂可以是能够利用分子极性和溶解度差异从人或动物血清中萃取至少一种脂溶性维生素的萃取试剂,具体地可以包括:甲基叔丁基醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、或其组合。
通过使用该萃取试剂处理常规生理条件下人或动物的血清,可以将血清中的脂溶性维生素溶解到萃取试剂中,分离上层萃取试剂后可以得到去除脂溶性维生素的血清。相比于现有技术,该萃取试剂既可以去除血清中的脂溶性维生素,又不会导致血清中能够与脂溶性维生素特异性结合蛋白变性失活或沉淀,保留了能与脂溶性维生素结合的多种蛋白质。利用所得到的阴性血清配置标准品和/或质控品时,脂溶性维生素可以充分地溶解在阴性血清中,使得所得到的标准曲线/质控指标更接近于实际的含量,标准曲线的R值更接近于1,提高了检测的准确性。
在一种可选的实施方式中,萃取试剂可以是包括组分1和组分2的混合物:组分1为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、或者二氯甲烷的至少一者;组分2为己烷。在一种优选的实施方式中,组分1为二氯甲烷和/或乙酸乙酯,组分2为正己烷。在一种优选的实施方式中,组分1与组分2的体积比(V:V)可以为1.5:1至9:1;在一个优选的实施方式中,该体积比为7:3 至9:1,或者为3:1至9:1,或者为4:1至9:1,或者为5:1至9:1,或者为 7:1至9:1,或者为8:1至9:1。例如,萃取试剂可以是乙酸乙酯与正己烷的混合物,或者二氯甲烷与正己烷的混合。再例如,乙酸乙酯与正己烷的体积比可以为1.5~9:1。在一种可选的实施方式中,萃取试剂可以包括乙酸乙酯与正己烷的混合物,体积比为9:1。
此外,通过上述萃取试剂,相比于现有技术,可以获得较高的阴性血清得率(处理前血清的体积/处理后获得的血清体积*100%)。例如,通过使用体积比1.5~9:1的组分1与组分2的混合物,阴性血清得率可以至少为60%;通过使用体积比9:1的乙酸乙酯与正己烷混合物,阴性血清得率可以至少为80%。
在本申请的一种实施方式中,可以将上述任一种萃取试剂应用于制备脂溶性维生素阴性血清的方法,该方法可以包括:向血清中加入萃取试剂,混匀后静置或离心,取下层血清。
可选地或可替代地,该方法可以进一步包括:对获得的下层血清,重复执行上述操作2至6次;优选地重复执行上述操作3至6次;其中试剂与血清的体积比可以为1:5至4:5。
根据各种示例的实施方式,通过利用阴性血清的制备方法,可以保留了血清能与脂溶性维生素结合的多种蛋白质、不破坏血清基质的生物特性的情况下,在去除血清中的脂溶性维生素,从而可以提高检测的准确性。相比于现有技术中通过吸附剂吸附内源性物质的方法,阴性血清中残留的痕量脂溶性维生素不影响标准曲线的R值,甚至残余痕量几乎检测不到 (例如,处于色谱仪的机器误差范围内),该方法效果显著,操作简单。
在一种可选的实施方式中,阴性血清的制备方法可以进一步包括:将上述下层血清进行紫外照射,得到阴性血清。例如,可以将下层血清置于 30W-150W紫外灯下距离紫外灯10cm-50cm处照射,照射时长为6h至 24h。进一步,可以选择100W-150W的紫外灯下照射。
根据各种实施方式,通过利用溶液萃取和紫外照射的技术,可以去除了血清中近乎全部脂溶维生素(例如,去除效果可达99%以上),便于临床精确定量检测脂溶性维生素。
检测血清中的脂溶性维生素
结合前述制备脂溶性维生素阴性血清的方法,可以使用该方法制得的脂溶性维生素阴性血清配置标准品和/或质控品,来检测待测血清样品中一种或多种脂溶性维生素的含量,例如,维生素A(视黄醇)、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E(α-生育酚)、维生素K1(叶绿醌)。
具体地,检测脂溶性维生素的方法可以包括:
步骤a.向脂溶性维生素阴性血清中加入维生素A或视黄醇,维生素 D或D组维生素,25-羟基维生素D2,25-羟基维生素D3,维生素E或α- 生育酚,维生素K1或叶绿醌中的至少一种;
步骤b.将步骤a获得的脂溶性维生素溶液进行浓度梯度稀释,获得多个浓度的稀释液;以及
步骤c.测量该多个浓度的稀释液中的脂溶性维生素浓度,使用针对该多个浓度的稀释液的测量结果获得标准曲线,利用标准曲线计算待测样品的脂溶性维生素浓度。
在一种可选的实施方式中,在稀释液中加入内标液、沉淀剂、以及上述萃取试剂,混匀后离心,取上清液;吹干上清液,向吹干后的样品中加入复溶液,离心去除不溶物后使用LC-MS/MS测量一种或多种脂溶性维生素浓度。
沉淀剂可以是甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一者。复溶液可以是30%~80%的甲醇水溶液或30%~80%乙腈水溶液。
其中,在LC-MS/MS测量中,以待测的脂溶性维生素的浓度与对应内标脂溶性维生素的浓度比值为横坐标,以待测物与对应内标脂溶性维生素的峰面积的比值为纵坐标,获得标准曲线,计算待测样品的脂溶性维生素浓度。
其中,在LC-MS/MS测量中,流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相 B为0.1%甲酸甲醇溶液,流速0.6mL/min。
本领域技术人员可以理解的是,在配置脂溶性维生素的标准品和/或质控品时、以及检测脂溶性维生素时,虽然本申请的示例实施方式示出了加入/检测五种脂溶性维生素的具体实验和结果,加入五种脂溶性维生素的具体实验和结果也可以单独地应用于其中一种或多种脂溶性维生素,各种脂溶性维生素对彼此的检测结果不会相互干扰,五种脂溶性维生素的具体实验和结果也可以用于针对其中一种或多种脂溶性维生素进行分析。
根据各种示例的实施方式,通过使用脂溶性微生物阴性血清配置标准品溶液,可以使加入的有证参考物质(例如,25-羟基维生素D)与阴性血清中具有生物活性的基质蛋白(例如,维生素D结合蛋白)结合,使得有证参考物质可以被充分地溶解,进一步,各浓度的标准品的浓度比值、峰面积比值与理论值更为接近,使得标准曲线的线性相关系数R更接近于1。从而,通过该标准曲线计算得到的待测样品中脂溶性维生素含量更接近于实际值。
结合前述的用于制备脂溶性维生素阴性血清的试剂、制备脂溶性维生素阴性血清的方法,所制备的脂溶维生素阴性血清更接近于真实基质,且操作简单,此外,使用该脂溶维生素阴性血清配制的校准品,能够实现脂溶维生素的准确定量,相比于现有技术,可以从实践上减小检测血清中脂溶性维生素的系统误差。
检测血清中脂溶性维生素的试剂盒
结合前述的用于制备脂溶性维生素阴性血清的试剂、制备脂溶性维生素阴性血清的方法、脂溶性维生素检测方法,本申请还可以提供一种用于检测人或动物血清中脂溶性维生素的试剂盒,该试剂盒可以应用于前述的制备脂溶性维生素阴性血清的方法和/或脂溶性维生素检测方法。该试剂盒可以包括:萃取试剂,其中该萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分 1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷;沉淀剂;包含一个或多个浓度的待测脂溶性维生素的标准品。
在可选的实施方式中,该试剂盒还可以包括:内标液,该内标液含有同位素标记的待测种类的维生素。在一个优选的实施方式,该试剂盒还可以包括前述复溶液。在一个优选的实施方式中,该试剂盒还包括流动相试剂,该流动相试剂包含甲酸和/或甲醇
通过该试剂盒,可以简便地实现上述各种有益效果中的至少一种有益效果。
根据本申请各个方面的萃取试剂,乙酸乙酯与正己烷的体积比为1.5:1 至9:1。相比于乙酸乙酯或正己烷或其他萃取剂,或者相比于其他体积比的乙酸乙酯与正己烷的混合物,该体积比范围的萃取试剂,可以保护被处理的血清,使得处理的血清不被乳化,同时能够增加萃取效率;此外,可以在血清处理过程中发挥消泡的作用,使得后续实验简易;此外,还可以去除萃取后下层血清中乙酸乙酯的残余量,防止血清中残余的乙酸乙酯干扰后续检测过程;此外,还可以缩短处理时间,使得能够简易、快速得获得脂溶性维生素阴性血清;此外,还可以显著提高阴性血清的得率,降低了成本。
此外,本申请的制备脂溶性阴性血清的方法中,可以通过萃取试剂和紫外照射的方式获得阴性血清,相比于现有技术,经处理的血清中基本不含有脂溶性维生素,或者仅残余痕量脂溶性维生素,脂溶性维生素去除效果明显,去除效果(特别是维生素K1)可达99%以上。
附图说明
图1为示出了根据本申请的实施例的脂溶性维生素阴性血清制备方法的工艺流程图;
图2是检测普通血清和根据本申请的阴性血清中脂溶性维生素的色谱图;
图3是根据本申请的阴性血清配制标准品的示例标准曲线;
图4是示出了使用不同萃取剂对血清进行萃取的效果的视图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案,下面将结合本申请的各种示例实施例和比较例、以及附图,对本申请的技术方案进行描述。本领域技术人员可以理解的是,本文中的各种示例实施例和比较例仅仅旨在于描述本申请一部分的实施方式,而不是穷举全部的实施方式。基于本文中的各种示例,本领域普通技术人员可以对实施例和比较例进行分离、组合和各种改变。
缩写词意义如下:“h”指小时,“min”指分钟,“s”指秒,“d”指天,“μL”指微升,“ml”指毫升,“L”指升,“mM”指毫摩尔,“μM”指微摩尔,“W”指瓦特。
实施例一
一、脂溶维生素阴性血清制备方法
图1示例性地示出了制备脂溶性维生素阴性血清的整体流程。参考图 1,该制备方法可以包括:
步骤1-1.取一定体积的需处理的血清,加入相当于血清体积20%~60%的萃取剂(二氯甲烷或乙酸乙酯和正己烷混合溶液(V:V=1.5:1~9:1)),置于磁力搅拌器上2600rpm搅拌30min,静置10min或5000rpm离心5min,取下层血清,重复以上操作2-3次;
步骤1-2.向上述血清中加入其体积10%~20%的正己烷或甲基叔丁基醚,置于磁力搅拌器上2600rpm搅拌10min,5000rpm离心5min,取下层血清至透明玻璃瓶中,敞口放置12h~24h;
步骤1-3.将上述装有血清的玻璃瓶置于100-150W紫外灯下,距离紫外灯10cm-50cm处照射过夜,得到脂溶维生素阴性血清。
二、阴性血清制备的校准品性能评估
1.脂溶维生素阴性血清和5%BSA配制校准品
(1)取适量脂溶维生素储备液加入到乙腈中,得到脂溶维生素次级储备液,浓度分别为维生素A(VA)75μg/mL、维生素D2(VD2)3.75μg/mL、维生素D3(VD3)7.5μg/mL、维生素E(VE)1500μg/mL、维生素K1 (VK1)0.15μg/mL;
(2)分别向阴性血清和5%BSA中加入2%乙腈,得到H0溶液;
(3)分别向阴性血清和5%BSA中加入2%次级储备液,得到ULOQ 溶液;
(4)将H0溶液和ULOQ溶液以不同比例混合,得到校准品(C1至 C6)以及低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品 (HQC),浓度如下述表1。
表1标准品溶液和质控品溶液中脂溶性维生素浓度
2.样本前处理方法:
(1)取一定量校准品、待测样品于EP管中;
(2)加入适量20μL内标液(内标液中含有的内标物如表4所示)、沉淀剂(400μL的无水乙醇)、步骤1-1的萃取剂涡旋振荡10min;
(3)13000rpm离心5min;
(4)取上清液至96孔板中,氮气吹干;
(5)向吹干后的样品中加入复溶液(100μL 80%浓度乙腈水溶液),涡旋振荡3min,4000rpm离心5min,进样分析。
3.LC-MS/MS定量分析方法
仪器:AB SCIEX 4500MD;
色谱柱:Xbridge BEH C18 2.5μm,3×50mm;
流动相A:0.1%甲酸水溶液;流动相B:0.1%甲酸甲醇溶液;
流速:0.6mL/min;
柱温:50℃;
样品管理器:10℃。
梯度洗脱如表2所示。
表2梯度洗脱表
t(min) | %A | %B |
0 | 30 | 70 |
0.2 | 30 | 70 |
2 | 0 | 100 |
5 | 0 | 100 |
5.1 | 30 | 70 |
5.5 | 30 | 70 |
质谱(MS)设置参数如下述表3。
表3 MS参数表
离子源:APCI+ | 气帘气CUR:20psi |
碰撞气CAD:10psi | 电晕针电流NC:3.0μA |
离子源温度TEM:350℃ | 脱溶剂气Gas1:60psi |
检测模式:MRM |
离子信息如下述表4所示。表4离子信息表
比较例一
图2示出了普通血清(或称为正常血清,即,未去除脂溶性维生素的血清)与根据实施例一的脂溶性维生素阴性血清中各种脂溶性维生素的含量,其中,该普通血清为人血清,使用80%乙腈溶液配制脂溶性维生素(维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E和维生素K1),作为色谱参比对照。通过前述实施例一的检测方法,利用色谱方式检测普通血清和阴性血清中各种脂溶性维生素的含量。
其中,在根据实施例一的方法制备脂溶性维生素阴性血清时,步骤1- 1中所用的萃取剂为乙酸乙酯和正己烷的混合溶液(V:V=9:1);在步骤1- 2中,向步骤1-1所的血清中加入其体积20%的正己烷,置于磁力搅拌器上2600rpm搅拌10min,5000rpm离心5min,取下层血清至透明玻璃瓶中,敞口放置12h;在步骤1-3中,至于150W的紫外条件下,距离紫外灯10cm-50cm处照射12小时。
其中,在对80%乙腈溶液、正常血清、阴性血清的前处理过程中,加入的内标液体积为20μL;所用的沉淀剂为乙醇,浓度为100%,加入的体积为400μL;所使用的复溶液为乙腈,浓度为80%,加入的体积为100μL。
在图2中,A1、B1、C1、D1、E1分别对应80%乙腈溶液配制的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E和维生素K1的色谱图,A2、B2、C2、D2、E2分别对应普通血清中的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E和维生素K1的色谱图;A3、 B3、C3、D3、E3分别对应根据实施例一的阴性血清中的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E和维生素K1的色谱图。
从图2中可以看出,阴性血清中各种脂溶性维生素的残余痕量均显著低于普通血清,残余痕量是普通血清的1%以下,甚至1‰以下。例如,如图2中的A2和A3所示,普通血清中维生素A对应的峰值大于2.4e4(即, 2.4*104);阴性血清中维生素A对应的峰值低于1000单位,且在系统误差范围内,这说明阴性血清中去除了基本全部的维生素A,已难以准确地检测阴性血清中的残余痕量维生素A。
比较例二
将脂溶维生素阴性血清配制校准品,与5%牛血清白蛋白配制的校准品同时检测脂溶维生素参考物质,用检测结果与有证参考物质的百分偏倚来评估使用脂溶维生素阴性血清配制的校准品的性能。在本比较例中,所用的脂溶维生素阴性血清制备条件、检测方法与比较例一相同。
1.标准曲线的线性相关系数
用脂溶维生素阴性血清配制维生素A、D2、D3、E和K1校准品(浓度参见表1的C1至C6),将校准品经过前处理后,进行LC-MS/MS检测,以待测物与对应内标的浓度比值(Concentration Ratio)为横坐标,待测物与对应内标的峰面积的比值(Area Ratio)为纵坐标,绘制标准曲线,结果见图3,其中线性相关系数R均≥0.99,因此实施例一制备得到的阴性血清基质干净,可用于脂溶性维生素定量校准品配制。
2.准确度
分别使用阴性血清和5%BSA配制有证参考物质NIST SRM 972a和 1950(包含维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E) 的标准品;维生素K1准确度性能通过加标回收实验进行验证,在下述说明中,针对维生素K的准确度验证用的是加标回收方法,将维生素K1准确度验证单独列表,如表8和表9所示。使用与比较例一相同的条件和方法来定量检测,将参考物质作为样本,按照公式(1)计算相对偏差,偏倚 (Bias)应≤±15%。
偏倚=(检测结果实测值-有证参考物质标示值)/有证参考物质标示值×100%(1)
表6.阴性牛血清标准曲线定量有证参考物质
表7. 5%BSA标准曲线定量有证参考物质
表8.阴性牛血清加标回收实验
表9. 5%BSA加标回收实验
由表6和表7可见,使用实施例一的阴性血清配制标准曲线能够准确定量有证参考物质,偏倚均在±5%以内,而使用替代基质5%BSA配制的标准曲线偏倚较大。
比较例三
图4示出了根据比较例三的不同萃取剂的萃取效果。取6支离心管,每支加入20mL普通血清(或称为正常血清,即,未去除脂溶性维生素的血清),分别加入10mL萃取剂(具体萃取剂见表10),混匀后静置20min。
表10比较例三的不同萃取剂
萃取结果 | 萃取剂 |
对应图4的A部分 | 总体积10mL,其中,乙酸乙酯10mL |
对应图4的B部分 | 总体积10mL,其中,乙酸乙酯9mL,正己烷1mL |
对应图4的C部分 | 总体积10mL,其中,乙酸乙酯8mL,正己烷2mL |
对应图4的D部分 | 总体积10mL,其中,乙酸乙酯7mL,正己烷3mL |
对应图4的E部分 | 总体积10mL,其中,乙酸乙酯6mL,正己烷4mL |
对应图4的F部分 | 总体积10mL,其中,乙酸乙酯5mL,正己烷5mL |
根据图4的结果可知,在萃取剂中仅含有乙酸乙酯而不含有正己烷时,萃取后的上清液呈现明显的黄色(参见图4的A部分上清液),说明血清中较多物质(可以呈现特定颜色)被萃取到了上清液中;在乙酸乙酯与正己烷的体积比为1:1时(参见图4的F部分),萃取后的血清发生明显乳化,离心管下部的血清和上部的萃取剂没有明显的分解边界,血清和萃取剂实质上已经混合,无法获得萃取后的脂溶性维生素阴性血清。
在乙酸乙酯与正己烷的体积比为1.5:1至9:1的范围内(例如,参见图4的B~E部分),上清液没有明显的黄色,下层经过萃取的血清基本完整地保留了血清中物质。并且在该体积范围内,经过该范围萃取剂处理的血清至少不发生明显的乳化(例如,图4的B示出了其中乙酸乙酯与正己烷体积比为9:1的萃取剂处理后的血清没有发生乳化;图4的C和D示出了相应萃取剂处理后的血清发生了较为轻微的乳化;图4的E示出了相应萃取剂处理后的血清的乳化程度比图4的F的乳化程度轻,图4的E分经处理后的血清至少可以与上层萃取剂分离,没有实质上混合在一起)相比于乙酸乙酯,或者相比于其他体积比的乙酸乙酯与正己烷的混合物,该体积比范围的萃取试剂,可以保护被处理的血清,使得处理的血清不被乳化,同时能够增加萃取效率。
此外,从图4的结果还可以看出,单纯使用乙酸乙酯作为萃取剂,经过处理的下层血清体积较多(例如,图4的A部分下层残留的血清分别比 B~F部分多),说明下层血清中可能残留溶解了部分乙酸乙酯;在乙酸乙酯与正己烷的体积比为1.5:1至9:1的范围内(例如,参见图4的B~E部分),萃取剂可以去除萃取后下层血清中乙酸乙酯的残余量,从而可以防止血清中残余的乙酸乙酯干扰后续检测过程。
比较例四
设置对照组、组1~组3共四个比较组实验,每组取20mL需要处理的血清。组1和组3分别加入10mL萃取剂(乙酸乙酯与正己烷体积比为 9:1),充分混匀静置20min后保留下层血清。将组2的血清和组3经处理后的下层血清至于150W的紫外条件下,距离紫外灯10cm-50cm处照射12小时。使用实施例一的样品前处理方法和LC-MS/MS定量分析方法,分别检测经上述处理后的对照组、组1~组3血清中的维生素A(视黄醇)、 25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E(α-生育酚)、维生素K1 (叶绿醌)(即,下表中的分析物),以各分析物的峰面积(任意单位,即Arbitrary Unit(AU),表示待分析物的物质的量的相对含量的量纲)来表示各分析物的相对含量。在表11中,“无检测峰”表示未检测到相应分析物在对应洗脱时间(或对应吸收波长)的峰图,可以指示基本没有检测到相应的分析物。
根据表11的结果可知,针对维生素A(视黄醇),相比于对照组,仅进行紫外线照射(组2)不能充分去除血清中的维生素A(视黄醇)。仅进行紫外照射(组2)可以去除较多的25-羟基维生素D2,且相比于溶液萃取(组1),仍残留了较多的25-羟基维生素D2;仅进行溶液萃取(组 1)虽然去除了大部分25-羟基维生素D2、但仍有残余;只有进行萃取并进行紫外照照射(组3)才可以发挥协同效果,完全地去除25-羟基维生素 D2。对于25-羟基维生素D3和维生素E(α-生育酚),单独的溶液萃取 (组1)和单独的紫外照射处理(组2)都不能分别去除这两种维生素,只有进行萃取并进行紫外照照射(组3)才可以发挥协同效果,分别完全地去除25-羟基维生素D3和维生素E(α-生育酚)。对于维生素K1(叶绿醌),仅进行紫外照射(组2)和进行萃取后并进行紫外照射(组3)均可以完全将其去除。
通过该比较例可以说明,通过萃取试剂和紫外照射的方式获得阴性血清,经处理的血清中基本不含有脂溶性维生素,基本去除了脂溶性维生素。此外还可以说明,萃取试剂和紫外照射叠加处理,可以产生协同效果,可以同时去除多种脂溶性维生素(至少可以同时完全地去除维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E和维生素K1)。
表11.不同处理组的各维生素相对含量
虽然本申请的上述实施例和比较例示出了加入/检测五种脂溶性维生素的具体实验和结果,本领域技术人员可以理解的是,在配制脂溶性维生素的标准品和/或质控品时、以及检测脂溶性维生素时,加入五种脂溶性维生素的具体实验和结果也可以单独地应用于其中一种或多种脂溶性维生素,各种脂溶性维生素对彼此的检测结果不会相互干扰,五种脂溶性维生素的具体实验和结果也可以用于针对其中一种或多种脂溶性维生素进行分析。
本申请公开了以下技术方案:
1.一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法,包括:
在血清中加入萃取试剂,混匀后静置或离心,取下层血清;
其中该萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷。
2.技术方案1所述的方法,其中组分2为正己烷。
3.前述任一技术方案所述的方法,其中萃取试剂的组分1为二氯甲烷和/或乙酸乙酯,组分2为正己烷;其中组分1与组分2的体积比为1.5:1 至9:1;优选为7:3至9:1;优选为3:1至9:1;优选为4:1至9:1;优选为 5:1至9:1;优选为7:1至9:1;优选为8:1至9:1。
4.前述任一技术方案所述的方法,其中,所述萃取试剂与血清的体积比为1:5至4:5。
5.前述任一技术方案所述的方法,还包括:将下层血清置于30W- 150W紫外灯下照射;优选地,置于100W-150W的紫外灯下照射。
6.前述任一技术方案所述的方法,其中,将血清置于紫外灯距离紫外灯10cm-50cm处,照射6h至24h。
7.一种检测脂溶性维生素的方法,包括:
a.标准品的配制:向权利要求1至6任一项所述方法获得的脂溶性维生素阴性血清中加入一种或多种待测的脂溶性维生素;
b.将步骤a获得的脂溶性维生素标准品溶液进行浓度梯度稀释,获得多个浓度的稀释液;以及
c.测量所述多个浓度的稀释液中的脂溶性维生素浓度,使用针对所述多个浓度的稀释液的测量结果获得标准曲线,利用标准曲线计算待测样品的脂溶性维生素浓度。
8.前述技术方案7所述的方法,其中所述待测的脂溶性维生素包含包括以下中的至少一种:维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。
9.前述技术方案7或8所述的方法,其中所述的维生素D选自25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。
10.前述技术方案7-9中任一项所述的方法,还包括:在稀释液中加入针对待测的脂溶性维生素的内标液、沉淀剂、以及萃取试剂,混匀后离心,取上清液;吹干上清液,向吹干后的样品中加入复溶液,离心去除不溶物后使用LC-MS/MS测量一种或多种脂溶性维生素浓度;
其中所述的萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷。
11.前述技术方案7-10中任一项所述的方法,其中,在LC-MS/MS测量中,针对所述多个浓度的稀释液中的任意一种待测脂溶性维生素,以待测物的浓度与对应内标脂溶性维生素的浓度比值为横坐标,以待测物与对应内标脂溶性维生素的峰面积的比值为纵坐标,获得标准曲线,计算待测样品的脂溶性维生素浓度。
12.前述技术方案7-11中任一项所述的方法,其中,在LC-MS/MS测量中,流动相A为甲酸水溶液,流动相B为甲酸甲醇溶液。
13.一种用于前述技术方案7所述的检测脂溶性维生素方法的试剂盒,所述试剂盒包括:
萃取试剂,其中该萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷;
沉淀剂;
包含一个或多个浓度的待测脂溶性维生素的标准品。
14.根据前述技术方案13所述的试剂盒,其中脂溶性维生素包含以下的至少一种:维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。
15.根据前述技术方案13或14所述的试剂盒,所述试剂盒还包括内标液,该内标液含有同位素标记的待测种类的维生素。
16.根据前述技术方案13-15中任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括复溶液。
17.根据前述技术方案13-16中任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括流动相试剂,所述流动相试剂包含甲酸和/或甲醇。
Claims (17)
1.一种制备脂溶性维生素阴性血清的方法,包括:
在血清中加入萃取试剂,混匀后静置或离心,取下层血清;
其中该萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷。
2.根据权利要求1所述的方法,其中组分2为正己烷。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中萃取试剂的组分1为二氯甲烷和/或乙酸乙酯,组分2为正己烷;其中组分1与组分2的体积比为1.5:1至9:1;优选为7:3至9:1;优选为3:1至9:1;优选为4:1至9:1;优选为5:1至9:1;优选为7:1至9:1;优选为8:1至9:1。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法,其中,所述萃取试剂与血清的体积比为1:5至4:5。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法,还包括:将下层血清置于30W-150W紫外灯下照射;优选地,置于100W-150W的紫外灯下照射。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,将血清置于紫外灯距离紫外灯10cm-50cm处,照射6h至24h。
7.一种检测脂溶性维生素的方法,包括:
a.标准品的配制:向权利要求1至6任一项所述方法获得的脂溶性维生素阴性血清中加入一种或多种待测的脂溶性维生素;
b.将步骤a获得的脂溶性维生素标准品溶液进行浓度梯度稀释,获得多个浓度的稀释液;以及
c.测量所述多个浓度的稀释液中的脂溶性维生素浓度,使用针对所述多个浓度的稀释液的测量结果获得标准曲线,利用标准曲线计算待测样品的脂溶性维生素浓度。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述待测的脂溶性维生素包含包括以下中的至少一种:维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述的维生素D选自25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。
10.根据权利要求7至9任一项所述的方法,还包括:在稀释液中加入针对待测的脂溶性维生素的内标液、沉淀剂、以及萃取试剂,混匀后离心,取上清液;吹干上清液,向吹干后的样品中加入复溶液,离心去除不溶物后使用LC-MS/MS测量一种或多种脂溶性维生素浓度;
其中所述的萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,在LC-MS/MS测量中,针对所述多个浓度的稀释液中的任意一种待测脂溶性维生素,以待测物的浓度与对应内标脂溶性维生素的浓度比值为横坐标,以待测物与对应内标脂溶性维生素的峰面积的比值为纵坐标,获得标准曲线,计算待测样品的脂溶性维生素浓度。
12.根据权利要求10至11任一项所述的方法,其中,在LC-MS/MS测量中,流动相A为甲酸水溶液,流动相B为甲酸甲醇溶液。
13.一种用于权利要求7所述的检测脂溶性维生素方法的试剂盒,所述试剂盒包括:
萃取试剂,其中该萃取试剂包含组分1和组分2,其中组分1选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种,组分2为己烷;
沉淀剂;
包含一个或多个浓度的待测脂溶性维生素的标准品。
14.根据权利要求13所述的试剂盒,其中脂溶性维生素包含以下的至少一种:维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒,所述试剂盒还包括内标液,该内标液含有同位素标记的待测种类的维生素。
16.根据权利要求13至15任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括复溶液。
17.根据权利要求13至16任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括流动相试剂,所述流动相试剂包含甲酸和/或甲醇。
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2022
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