CN113552229B

CN113552229B - 血清中维生素k1的高效液相色谱串联质谱检测方法

Info

Publication number: CN113552229B
Application number: CN202010332661.XA
Authority: CN
Inventors: 佘旭辉; 蔡国杰; 蔡娇; 赵蓓蓓; 余木俊; 董衡; 程雅婷
Original assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2040-04-24
Also published as: CN113552229A

Abstract

本发明涉及一种血清中维生素K₁的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤样品前处理：在待测血清样本中加入沉淀剂进行沉淀；再加入萃取剂进行萃取，离心；将所得上清液干燥后用复溶液进行复溶，离心；取所得上清液作为待测样品溶液；所述沉淀剂包括2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚、雌三醇、内标和乙醇；所述萃取剂包括2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚、雌三醇和正己烷；所述复溶液包括2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚、雌三醇和甲醇；液相色谱分离：将所述待测样品溶液使用高效液相色谱进行色谱分离；质谱检测：将高效液相色谱分离后的样品进行质谱检测。本发明方法步骤简单，且特异性强、灵敏度高、抗干扰能力好。

Description

血清中维生素K1的高效液相色谱串联质谱检测方法

技术领域

本发明涉及生物医药检测技术领域，特别是涉及一种血清中维生素K₁的高效液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

维生素K₁(VK₁)，又称甲萘醌，是一种脂溶性维生素，其化学性质较稳定，能耐酸、耐热，但对光敏感，也易被碱和紫外线分解。VK₁是肝脏合成凝血因子过程中所必需物质，当其缺乏时会影响凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的合成，造成凝血酶原复合物生成减少并出现自发性出血，具有潜在致命风险。VK₁状态可以用于评估新生儿出血性疾病，乳糜泻，克罗恩病，溃疡性结肠炎和慢性胰腺炎(囊性纤维化)等吸收不良疾病，亦有报道表明其与骨质密度或阿尔茨海默病亦存在关联。因此，建立有效的VK₁检测方法十分重要。

由于人体内存在多种脂溶性维生素，包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等，且血液样本本身具有复杂多样性，采用色谱质谱分析的方法进行脂溶性维生素分析测定时，干扰因素特别多，基质干扰特别严重。对于如何能够充分提取、纯化目标化合物，并尽可能少的引入不必要的基质干扰，以满足项目检测高灵敏度、高特异性的要求是一个非常重要和复杂的关键过程。同时体内不同脂溶性维生素含量不同(维生素A、维生素E浓度相对较高)、极性差异大，若要准确的测定VK₁，还要尽可能的实现色谱分离，以免其他维生素对VK₁的检测造成干扰。特别是VK₁在血液中的含量低至pmol/L，并在体内常与蛋白紧密结合，因此，对方法的检测灵敏度要求极高。此外血清样本十分复杂，除了具有大量的蛋白质、盐以及磷脂外，人体产生的代谢产物也可能会对目标物的检测造成干扰。另外VK₁在有光的条件下不稳定的性质也需要予以考虑。

目前对于VK₁常用的检测方法有高效液相-紫外检测法、高效液相-荧光检测法、气相色谱串联质谱法等。但仍存在前处理过程复杂、基质干扰严重，灵敏度低等问题。因此，为了更好的指导维生素K₁的补充治疗，亟待开发可以准确定性和定量、除杂效果好、灵敏度更高的VK₁检测方法。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种步骤简单，且特异性强、灵敏度高、抗干扰能力好的血清中维生素K₁的高效液相色谱串联质谱检测方法。

具体技术方案如下：

一种血清中维生素K₁的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：

样品前处理：在待测血清样本中加入沉淀剂进行沉淀；再加入萃取剂进行萃取，离心；将所得上清液干燥后用复溶液进行复溶，离心；再取所得上清液作为待测样品溶液；其中，所述沉淀剂包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、雌三醇、内标D₇-VK₁和乙醇；所述萃取剂包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、雌三醇和正己烷；所述复溶液包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、雌三醇和甲醇；

液相色谱分离：将所述待测样品溶液使用高效液相色谱进行色谱分离；

质谱检测：将高效液相色谱分离后的样品进行质谱检测。

在其中一些实施例中，所述液相色谱分离的色谱条件包括：

流动相：有机相为2.5±0.3mM甲酸铵甲醇溶液，水相为含0.1±0.02v/v％甲酸的2.5±0.3mM甲酸铵水溶液；采用梯度洗脱，流速为0.5±0.1mL/min。

在其中一些实施例中，所述梯度洗脱包括：

0～0.5min：有机相70％～75％，水相25％～30％；

0.5～4min：有机相70％～75％→84～87％，水相25％～30％→13％～16％；

4～4.01min：有机相84～87％→88～90％，水相13％～16％→10～12％；

4.01～9min：有机相88～90％→98～100％，水相10～12％→0～2％；

9～10.5min：有机相98～100％，水相0～2％；

10.5～10.6min：有机相98～100％→70％～75％，水相0～2％→25％～30％；

10.6～12min：有机相70％～75％，水相25％～30％。

在其中一些实施例中，所述液相色谱分离的色谱条件包括：

色谱柱：Asentis Express C18；

洗针液：体积分数40～60％的甲醇水溶液；

柱温：40～50℃；

进样量：20±5μL。

在其中一些实施例中，所述色谱柱的长度为2～10cm，内径为2.1～4.6mm，粒径为2.7μm。

在其中一些实施例中，所述质谱检测采用AB Sciex API 5500三重四极杆质谱仪。

在其中一些实施例中，所述质谱检测的条件包括：离子源：大气压化学电离源，正离子扫描模式，多反应监测模式；气帘气为40.0±5psi；碰撞气为5.0±0.5psi；雾化电流为3.0±0.5μA；雾化气为30.0±5psi；离子源温度为450.0±20℃。

在其中一些实施例中，维生素K₁的定性离子对为：451.4/199.2；维生素K₁的定量离子对为：451.4/187.2；D7-VK₁内标离子对为458.5/194.1。

在其中一些实施例中，所述沉淀剂中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.2～1.0mg/mL，雌三醇的浓度为0.8～1.6μg/mL，所述内标D₇-VK₁的浓度为0.8～1.6ng/mL；

所述萃取剂中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.2～1.0mg/mL，雌三醇的浓度为0.8～1.6μg/mL；

所述复溶液中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.2～1.0mg/mL，雌三醇的浓度为0.8～1.6μg/mL。

在其中一些实施例中，所述待测血清样本、沉淀剂和萃取剂的体积比为1：3～5：7～9。

在其中一些实施例中，萃取后离心所得上清液与所述复溶液的体积比为6～8：1。

在其中一些实施例中，所述沉淀的过程包括漩涡震荡5～10min和室温孵育10～15min；所述萃取的过程包括漩涡震荡10～15min；所述复溶的过程包括漩涡震荡5～10min。

在其中一些实施例中，配制标准曲线工作溶液时加入空白基质，所述的空白基质为2～6wt％牛血清蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明方法采用高效液相色谱-质谱联用，结合特定的样品前处理步骤、液相色谱条件和质谱检测条件，实现了一种特异性强、灵敏度高、抗基质干扰能力好、具有很好的重现性的血清中维生素K₁检测方法。尤其本方法的灵敏度相比于已报道的方法更高(定量限更低)，能覆盖更广泛的人群样本检测，特别是针对凝血功能异常的患者，有利于开展临床上对血清中VK₁含量进行监测，可以用于诊断VK₁相关的疾病，为临床治疗提供服务。

本发明的前处理步骤可以去除大部分极性较强的杂质，净化效果好，提取回收率高。并且，将内标溶解在沉淀剂中作为内标工作液一次性加入，将加内标和蛋白沉淀操作步骤合并，节省操作步骤，且不影响蛋白沉淀效果和提取回收率。

本发明的前处理试剂中(沉淀剂、萃取剂和复溶液)，所添加的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和雌三醇复配能在目标物萃取及转移过程中起到保护作用，有利于提高检测灵敏度和目标物的响应信号，增强处理后样本的稳定性，避免样本不稳定带来的操作问题，减少VK₁以及内标在萃取以及转移过程中的损失，减少样本量；复溶液中使用甲醇作为溶剂，对目标物溶解性好，离子化效率高，VK₁绝对响应值更高，且不存在溶剂效应。

对于前处理过程中未能去除的杂质和性质相似的代谢物，本发明进一步对液相色谱流动相种类、梯度洗脱、空白基质等进行优化，降低基质干扰，消除基质效应，不仅实现了血清样本中VK₁的有效分离和定量，还能实现对多种脂溶性维生素的色谱分离，可扩展应用到准确定量分析。

在上述基础上，本发明进一步对质谱条件进行了优化，克服了VK₁极性较弱、检测灵敏度低的缺陷，实现低样本用量(100μL)就可以达到高灵敏度(定量限低至0.038ng/mL，即84.4pmol/L)的效果。

附图说明

图1为实施例1中1例血清样本中VK₁的总离子流色谱图；

图2为VK₁的线性回归曲线；

图3为前处理过程中未加入保护剂处理的VK₁检测色谱图；

图4为前处理过程中加入保护剂处理的VK₁检测色谱图；

图5为组A的色谱图；

图6为组B的色谱图；

图7为组C的色谱图；

图8为样本中VK₁及其他脂溶性维生素色谱图；

图9为混合血清紫外照射前的色谱图；

图10为混合血清紫外照射60h后的色谱图；

图11为BSA空白基质的色谱图。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

(1)溶液配制：

雌三醇储备液的配制：称取一定量雌三醇固体，用无水乙醇溶解，制备得到浓度为1.0mg/mL的雌三醇储备液。

内标中间液的配制：用无水乙醇稀释维生素K₁内标(D₇-VK₁)储备液，得到浓度为10.0μg/mL的内标中间液。

沉淀剂的配制：分别吸取40μL-80μL的内标中间液及400μL-800μL的雌三醇储备液于500mL容量瓶中，再加入0.1g-0.5g BHT，用无水乙醇定容得到沉淀剂。

萃取剂的配制：吸取400μL-800μL的雌三醇储备液至500mL容量瓶，再加入0.1g-0.5g BHT，用正己烷定容得到萃取剂。

复溶液的配制：加入0.1g-0.5g BHT和400μL-800μL的雌三醇储备液至500mL容量瓶，用纯甲醇定容得到复溶液。

4％BSA溶液配制：称取一定量牛血清蛋白(BSA)固体，用去离子水溶解，得到4％(w/w)BSA溶液。

VK₁标准品中间液Ⅰ：用无水乙醇将1.0mg/mL的VK₁标准品储备液稀释成浓度为10.0μg/mL的中间液Ⅰ。

VK₁标准品中间液Ⅱ：以4％BSA作为空白曲线基质将中间液Ⅰ稀释成50.0ng/mL的中间液Ⅱ。

(2)样品前处理方法：

1)移取100μL血清样本，加入400μL沉淀剂，漩涡震荡5～10min；

2)室温孵育10～15min；加入800μL萃取剂，漩涡震荡10～15min；

3)然后在转速为10000～12000rpm下离心5～10min；

4)吸取上层萃取液700μL转至2.0mL离心管中，室温氮气吹干；

5)向吹干离心管中加入100μL复溶液，漩涡震荡5～10min，在转速为10000-12000rpm、25℃离心3min；

6)取上清液转移至棕色进样瓶，作为待测样品，待上机检测。

(3)待测样品中VK₁的检测

将待测样品使用液相色谱-质谱仪进行检测：

1、液相色谱条件：色谱柱采用Asentis Express C18(5cm*2.1mm，2.7μm)；流动相A(有机相)为含有2.5mM甲酸铵甲醇溶液，流动相B(水相)为含有0.1％甲酸～2.5mM甲酸铵水溶液；洗针液为体积分数50％的甲醇水溶液，采用梯度洗脱模式，液相梯度如表1所示。柱温为45℃，进样量为20μL。

表1 液相洗脱梯度

步骤	分析时间(min)	流速(mL/min)	流动相A％	流动相B％
					1	0	0.5	73	27
2	0.5	0.5	73	27
					3	4	0.5	86	14
4	4.01	0.5	89	11
					5	9	0.5	100	0
6	10.5	0.5	100	0
					7	10.6	0.5	73	27
8	12	0.5	73	27

2、质谱检测采用AB Sciex API 5500三重四极杆质谱仪，大气压化学电离源(APCI)，正离子扫描模式，多反应监测模式(MRM)。质谱条件包括：气帘气为40.0psi；碰撞气为5.0psi；雾化电流为3.0μA；雾化气为30.0psi；离子源温度为450.0℃。MRM扫描模式具体质谱参数如表2所示。

表2 质谱参数

(4)血清中VK₁的定性、定量检测

以样品中VK₁两个离子对与标准品的化合物保留时间(Rt为8.72min)进行比对作为定性依据。用内标标准曲线法定量，VK₁的峰面积与D₇-VK₁峰面积的比值为纵坐标，VK₁的浓度与D₇-VK₁的浓度比值为横坐标，加权方式为权重1/x，绘制标准曲线，即可对实际样本进行定量计算。

(5)待测样品检测

采用上述方法，对1例血清样本中的VK₁进行了含量测定，检测总离子流色谱图如图1所示。从图中可看出，VK₁的色谱峰(Rt为8.72min)峰型对称，响应合适，分离效果很好。

(6)方法学验证

1、线性关系和定量限：

以4wt％BSA溶液为空白基质，对VK₁标准品中间液Ⅱ(50ng/mL)进行稀释，配制得到浓度分别为0.038ng/mL、0.076ng/mL、0.15ng/mL、0.30ng/mL、0.60ng/mL、1.21ng/mL、2.42ng/mL、4.83ng/mL、9.66ng/mL的一系列标准工作曲线溶液。按样品前处理方法每天将上述每个浓度的曲线样本平行处理2个，检测3天，计算各浓度样本的平均值、RSD和回收率，结果见表3。图2为VK₁的线性回归曲线(回归方程为：y＝0.14729x+0.00143，R＝0.99905)。结果表明VK₁在线性范围0.038ng/mL～9.66ng/mL(84.36pmol/L～21445pmol/L)内各浓度点RSD＜20％，回收率均在85％～115％之内，且具有良好的线性关系。VK₁定量限为0.038ng/mL(84.36pmol/L)，检出限为0.0100ng/mL(22.2pmol/L)。

表3 线性数据

2、精密度试验：

收集混合病人血清样本或病人基质加标得到低、中、高不同浓度水平(浓度分别在0.30ng/mL、1.5ng/mL、6.5ng/mL附近)的样本，每个浓度同一天各平行处理12份，进行批内精密度实验，如表4结果表明三个不同浓度水平VK₁的精密度RSD都在2.6％～3.3％之间，表明该方法的批内精密度良好。

取上述混合病人血清样本或加标得到的低、中、高不同浓度水平(浓度分别在0.30ng/mL、1.5ng/mL、6.5ng/mL附近)的样本各20份，每个浓度每天测定两组，连续10天进行相同的前处理和检测，如表4结果表明三个不同浓度的血清样本中VK₁的精密度RSD都在4.3％～6.2％之间，表明该方法的批间精密度良好。

表4 批内、批间精密度实验结果

3、加标回收率：

收集病人血清样本混合成低、中、高不同浓度(浓度分别在0.30ng/mL、0.90ng/mL、2.10ng/mL附近)的混合血清基质，分别加不同浓度标准品溶液进行加标回收率实验；加标前后的样品，按照本实施例中方法平行处理3次，计算加标样品结果回收率。结果如表5所示，表明此方法在高中低三个不同浓度水平范围的回收率在93.1％～108.2％之间，满足回收率要求，方法准确。

表5 加标回收率结果

实施例2 样品前处理过程的优化

VK₁在光照条件下不稳定，在紫外光照射以及碱性条件下易被分解。同时由于VK₁脂溶性较强，易被吸附在前处理过程中使用的耗材(离心管、进样瓶等)上。因此，减少前处理过程中VK₁在的损失，对于获得准确定量结果以及提升灵敏度都非常关键。在本发明中，通过向前处理过程中的试剂添加保护剂(抗氧化剂BHT)，减少对光不稳定带来的降解。同时为避免VK₁被塑料离心管或者玻璃瓶吸附，还添加类固醇激素(雌三醇)，通过竞争吸附保护待测目标物。

对比同一个样本前处理过程中，在沉淀剂、萃取剂及复溶液中是否添加保护剂(BHT和雌三醇)对VK₁的影响，平行处理三次结果均表明前处理过程中添加保护剂(BHT以及雌三醇)检测得到的VK₁响应信号更高(如图3～4所示)，说明加入保护剂能够一定程度保护VK₁，有利于提高VK₁的检测灵敏度和稳定性。

综上述结果，最终选择了在前处理过程中，所有使用的沉淀剂、萃取剂、复溶液中都加入BHT和雌三醇保护目标物VK₁。

实施例3 样本处理后稳定性测试

因VK₁对光敏感不稳定，在处理过程中和处理后的稳定性都特别重要。收集病人样本混合成高低不同浓度(浓度在6.9ng/mL、0.8ng/mL附近)的混合血清，按照优化后的方法前处理过程中加入保护剂处理，分别将高、低混合血清样本各平行处理10份，将处理后的高、低浓度待测样分别混合在一起，然后用棕色玻璃进样瓶各分装成8份，在进样盘(15℃)条件下保存，分别于0、2、4、8、12、24、36、48h各测定3次，验证样本处理后的保存稳定性；以0h检测结果为参考靶值，其它不同存放时间点的检测结果与0h结果相比。如表6结果表明，回收率均在85％～115％之间，且3次平行测定的CV均在10％以内，说明样品在处理过程中加入保护剂后，在进样盘条件下可稳定放置至少48h。

表6 处理后样品放置于进样盘(15℃)的稳定性试验数据

实施例4 不同复溶液种类对VK₁检测的影响

由于在色谱质谱方法中，一般采用优化确定的色谱条件初始流动相作为复溶液，将前处理后的样本进行复溶后上机检测，主要是为了避免出现溶剂效应。但由于VK₁极性较弱，且在水相中难溶，同时为了最大程度的保证其离子化效率，本实施例对复溶液的种类进行了研究，比较了两种不同的复溶液体系：纯甲醇溶液(复溶液1)和73％有机相-27％水相(复溶液2，实施例1中流动相初始比例)。

收集病人样本混合成不同浓度水平(浓度分别在0.35ng/mL、3.5ng/mL附近)的血清样本，分别按实施例1中前处理方法，平行处理三批次后进行测定(结果如表7所示)。

表7 不同复溶液的比较

结果表明采用复溶液2(流动相初始比例溶液)作为复溶液，VK₁及其内标D₇-VK₁的峰面积均较低，其可能是目标物VK₁及其内标未能完全溶解导致离子化效率降低。因此，本发明优选采用纯甲醇作为复溶液体系，VK₁的峰面积更高，且不存在溶剂效应。

实施例5 流动相条件筛选

由于血液样本基质复杂，经过前处理纯化处理后，仍然会有一些杂质会干扰目标物VK₁的测定，有些理化性质相似的化合物还会共流出影响VK₁离子化效率。而有效的分离杂质和目标物有利于改善基质效应。因此，本发明设计了三组不同的流动相，考察流动相对目标物或者杂质的保留行为，对比不同的流动相组成对目标物VK₁的色谱分离效果。

组A：有机相为2.5mM甲酸铵甲醇溶液，水相为含0.1v/v％甲酸的2.5mM甲酸铵水溶液；

组B：有机相为纯甲醇溶液，水相为纯水溶液；

组C：有机相为纯甲醇溶液，水相为含0.1％甲酸的2.5mM甲酸铵水溶液。

组A、B、C的色谱结果分别如图5～7所示。所选流动相基本都能将目标物实现色谱分离。但是，组A的流动相(有机相为2.5mM甲酸铵甲醇溶液，水相为含0.1％甲酸的2.5mM甲酸铵水溶液)和梯度洗脱程序，不仅能有效将杂质和目标物进行完全分离，且目标物出峰附近的色谱图中背景噪音较低。同时，该流动相和梯度程序条件下，本方法还能实现多种脂溶性维生素(维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K₁)的色谱分离(如图8所示)，抗干扰性强，特异性高，可扩展为多种脂溶性维生素的定量方法。

实施例6 空白基质选择和评估

对于色谱质谱定量方法的建立以及基质效应的评估，配置标准曲线的空白基质选取十分关键和重要。一方面能够尽量模拟实际样品基质条件，另一方面所选基质不能存在明显的基质效应，不影响准确定量。本发明拟建立人体血清样本中VK₁的检测方法，最佳的曲线基质应为人体空白血清基质。但VK₁在人体血液中本身存在，即使根据VK₁在紫外光照条件下不稳定、易被分解的原理，经过试验，将混合病人血清需放置在紫外灯下常温照射至少60h后，VK₁本底才能去除干净(如图9、图10所示)，预处理耗时较长。但是，本发明通过选择牛血清白蛋白作为替代基质，经测定发现其VK₁本底含量可忽略(如图11所示)。因此，基于BSA在节省预处理时间上的优势，我们采取BSA基质开展后续实验。

基质效应评估：收集六个不同来源的病人样本(A1-A6)，样本本底浓度范围在0.5～1.5ng/mL；同时使用4wt％BSA将实施例1中VK₁标准品中间液Ⅱ稀释配制成浓度分别为0.3ng/mL(L)、3.0ng/mL(H)的VK₁标准溶液；分别将标准溶液L、H和六个不同来源的病人基质样本按1:1比例进行混合，得到混合样本AL和AH；将标准溶液、病人样本和混合样本各平行处理三次，前处理结束后，将得到的待测样品转移至液相进样瓶中，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪(LC-MS/MS)进行检测，通过VK₁以及同位素内标D₇-VK₁的峰面积，计算相应的比值(VK₁/D₇-VK₁峰面积之比)。通过混合样品(AL、AH)的VK₁/D₇-VK₁比值与理论值(六个不同来源的病人样本A1-A6与低、高浓度的标准工作溶液响应的均值)的差异均小于20％，说明基质效应可忽略，结果如表8，表9所示。

表8 基质效应结果(样本混合前)

表9 基质效应结果(样本混合后)

综上所述，本发明方法采用高效液相色谱-质谱联用，结合特定的样品前处理步骤、液相色谱条件和质谱检测条件，实现了一种特异性强、灵敏度高、抗基质干扰能力好、具有很好的重现性的血清中维生素K₁检测方法。尤其本方法的灵敏度相比于已报道的方法更高(定量限更低)，能覆盖更广泛的人群样本检测，特别是针对凝血功能异常的患者，有利于开展临床上对血清中VK₁含量进行监测，可以用于诊断VK₁相关的疾病，为临床治疗提供服务。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种血清中维生素K₁的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述液相色谱分离的色谱条件包括：

色谱柱：Asentis Express C18；

流动相：有机相为2.5±0.3mM甲酸铵甲醇溶液，水相为含0.1±0.02 v/v%甲酸的2.5±0.3mM甲酸铵水溶液；采用梯度洗脱，流速为0.5±0.1mL/min；

所述梯度洗脱包括：

0~0.5 min：有机相70%~75%，水相25%~30%；

0.5~4 min：有机相70%~75%→84~87%，水相25%~30%→13%~16%；

4~4.01 min：有机相84~87%→88~90%，水相13%~16%→10~12%；

4.01~9 min：有机相88~90%→98~100%，水相10~12%→0~2%；

9~10.5 min：有机相98~100%，水相0~2%；

10.5 ~10.6 min：有机相98~100%→70%~75%，水相0~2%→25%~30%；

10.6 ~12 min：有机相70%~75%，水相25%~30%；

质谱检测：将高效液相色谱分离后的样品进行质谱检测；

所述质谱检测采用AB Sciex API 5500三重四极杆质谱仪；

所述质谱检测的条件包括：

离子源：大气压化学电离源，正离子扫描模式，多反应监测模式；气帘气为40.0±5psi；碰撞气为5.0±0.5 psi；雾化电流为3.0±0.5 µA；雾化气为30.0±5 psi；离子源温度为450.0±20℃；

维生素K₁的定性离子对为：451.4/199.2；维生素K₁的定量离子对为：451.4/187.2；D₇-VK₁内标离子对为458.5/194.1。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述液相色谱分离的色谱条件包括：

洗针液：体积分数40~60%的甲醇水溶液；

柱温：40~50℃；

进样量：20±5μL。

3.根据权利要求1或2所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，

所述沉淀剂中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.2~1.0mg/mL，雌三醇的浓度为0.8~1.6µg/mL，内标D₇-VK₁的浓度为0.8~1.6ng/mL；

所述萃取剂中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.2~1.0mg/mL，雌三醇的浓度为0.8~1.6µg/mL；

所述复溶液中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.2~1.0mg/mL，雌三醇的浓度为0.8~1.6µg/mL。

4.根据权利要求3所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述待测血清样本、沉淀剂和萃取剂的体积比为1：3~5：7~9；和/或，萃取后离心所得上清液与所述复溶液的体积比为6~8：1。

5.根据权利要求1或2所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述沉淀的过程包括漩涡震荡5~10 min和室温孵育10~15 min；所述萃取的过程包括漩涡震荡10~15min；所述复溶的过程包括漩涡震荡5~10 min。

6.根据权利要求1或2所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，配制标准曲线工作溶液时加入空白基质，所述的空白基质为2~6wt%牛血清蛋白。