CN114994218B - 液相色谱串联质谱检测干血斑中4种脂溶性维生素的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
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Abstract
本发明提供了一种液相色谱串联质谱检测干血斑中4种脂溶性维生素的检测试剂盒及其检测方法，通过先用水湿润干血斑，然后加入含有乙醇的内标工作液使蛋白变性，释放出与蛋白结合的脂溶性维生素，再经由甲醇、乙腈和异丙醇组成的提取剂超声提取，氮气吹干，高浓度甲醇水复溶后即可进行检测，液相色谱串联质谱采用APCI离子源进行检测，前处理方法简便高效，并采用兔红细胞和2％BSA作为空白基质配制高线性关系的标准曲线，解决了内源性物质缺少空白基质的临床检测难题，仅需20微升末梢血制备干血斑即可进行高度精准、灵敏和稳定的检测，解决婴幼儿采血困难问题，满足临床需求。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，具体而言，涉及一种液相色谱串联质谱检测干血斑中4种脂溶性维生素的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
脂溶性维生素是指不溶于水，溶于脂肪和油脂的维生素。他们在食物中多与脂质共存，可随脂质吸收进入人体并在人体内储存。常见的脂溶性维生素有维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E等。维生素A(视黄醇)具有维持正常视力、预防和治疗干眼病、促进生长发育、增加机体对传染病的抵抗力等作用；缺乏时可引起夜盲症、角膜干燥症、皮肤干燥、脱屑等疾病。维生素D是具有抗佝偻病活性的脂溶性类固醇衍生物，代谢物25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3是其在人体内的主要储存形式，能调节人体内钙和磷的代谢并促进其吸收利用；青少年缺乏可引起佝偻症、成年人缺乏可得软骨症、骨质疏松等。维生素E又名生育酚，常见的有α、β、γ和δ四种，其中α-生育酚的生理活性最高，具有抗衰老、抗氧化作用、抗凝血作用、增强免疫力、改善末稍血液循环、防止动脉硬化的作用；长期缺乏可引起巨细胞性溶血性贫血、生殖机能障碍等疾病。由于脂溶性维生素在人体内的排泄率不高，因此摄入量过多时易引起中毒现象，若摄入量过少则缓慢出现缺乏症状。由于脂溶性维生素可以储存在组织中，当摄入剂量较高时也可能发生中毒现象，如关节疼痛、皮肤干燥、恶心呕吐甚至厌食。
脂溶性维生素的检测可评估患者体内的脂溶性维生素的营养状况。对脂溶性维生素缺乏或过量的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。目前国内外已报道了很多血清中脂溶性维生素的测定方法，常见的方法有：分光光度法、免疫层析法、气相色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法等。液相色谱-串联质谱法为测定脂溶性维生素的首选方法，它具有特异性好、灵敏度高的特点。成人一般可通过静脉采血得到至少100微升的血清(约300-500微升静脉全血)进行检测。婴幼儿因其特殊性无法进行静脉采血，临床迫切需要一种采血量少、操作简便的微创采血方法，干血斑样本恰好可以满足临床的这一需求。
现有的干血斑测定脂溶性维生素的方法，通常前处理过程较复杂，如CN108195984A和CN111983244A都需要两次提取再合并检测；CN111983244A的第二种提取液为正己烷，同样属于危险化学品，存在购买，运输和储存的问题，前处理过程中还需将孵化样品于-20℃冷冻10-20min，要求实验室必须有冷冻冰箱，操作要求较高，不利于临床的推广和使用；CN106770802B则需要采用多个3.2毫米直径的干血斑，前处理时间长，流动相需要添加全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种，都属于离子对试剂，存在色谱柱平衡时间相对较长，保留时间重现性差、基线不稳、温控要求高等问题；CN110174476A也需要用到1-3个干血斑，需要用到两种萃取液，第二种萃取液为乙酸乙酯、叔丁基甲醚、二氯甲烷、正己烷、环己烷中的至少一种，属于危险化学品，购买，运输，储存都较为不便，最为关键的一点是该方法维生素A、25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的定量下限分别为1000、100和100ng/mL，均超越了儿童的正常参考范围上限，无法检测儿童脂溶性维生素A和D的缺乏和正常状态。另外，采用现有的干血斑测定脂溶性维生素方法时，标准曲线的线性关系都不好，甚至不成线性，会严重影响干血斑中脂溶性维生素检测的准确性。
因此迫切需要一种前处理方法简单、采血量少、回收率高、分析时间短、成本低、人工工作量小的检测干血斑中脂溶性维生素的方法，从而使液相色谱串联质谱检测干血斑中脂溶性维生素的方法更加简便高效，并能保证检测结果的准确性和稳定性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种液相色谱串联质谱检测干血斑中4种脂溶性维生素的检测试剂盒及其检测方法，通过先用水湿润干血斑，然后加入含有乙醇的内标工作液使蛋白变性，释放出与蛋白结合的脂溶性维生素，再经由甲醇、乙腈和异丙醇组成的提取剂超声提取，氮气吹干，高浓度甲醇水复溶后即可进行检测，液相色谱串联质谱采用APCI离子源进行检测，前处理方法简便高效，并采用兔红细胞和2％BSA作为空白基质配制高线性关系的标准曲线，解决了内源性物质缺少空白基质的临床检测难题，仅需20微升末梢血制备干血斑即可进行高度精准、灵敏和稳定的检测，解决婴幼儿采血困难问题，满足临床需求。
一方面，本发明提供了一种液相色谱串联质谱检测干血斑中脂溶性维生素的检测试剂盒，所述试剂盒包括内标工作液、提取剂、复溶液和水，所述内标工作液由乙醇配制，所述乙醇用于释放与蛋白结合的脂溶性维生素。
本发明所述的脂溶性维生素包括维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和维生素E。
本发明经大量研究证明，干血斑加入含有乙醇的内标工作液后再进行提取时效果更佳，重现性更好，其原因是脂溶性维生素在循环血液中主要和特异性脂溶性维生素结合蛋白或白蛋白偶联，如25-羟基维生素D在循环血液中主要和特异性维生素D结合蛋白或白蛋白偶联，仅有0.03％的25-羟基维生素D以游离形式存在，虽然直接用提取剂也能提取大部分被蛋白结合的25-羟基维生素D，但直接提取并不能使25-羟基维生素D充分释放，所以前处理过程中如果先使用乙醇等有机溶液使蛋白质发生变性，将维生素D等脂溶性维生素提前从结合蛋白上释放出来后再进行提取，能显著提升提取回收率，使检测结果更加准确和稳定。
本发明还考察了多种有机溶剂如乙腈、甲醇丙酮和异辛烷等，对使蛋白质变性释放脂溶性维生素的效果，发现经乙醇处理后，脂溶性维生素的提取回收率更高，制备的标准曲线的线性关系更好，标准曲线相关系数R均大于0.99，加标回收率均符合要求，使检测结果准确度更高。
在一些方式中，所述内标工作液包括内标、BHT(2,6-二叔丁基对甲酚)和乙醇，所述BHT和乙醇组成的内标稀释液制备方法为：6.25mg BHT溶于50mL乙醇中，混匀后超声得到0.625mg/mL的BHT溶液。
进一步地，所述提取剂包括甲醇、乙腈和异丙醇。
本发明对比了多种不同提取剂的提取效果，研究证明，采用甲醇、乙腈和异丙醇混合制备的提取剂提取时，对脂溶性维生素的提取效果更好，检测灵敏度更高。
进一步地，所述提取剂中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为10(5-10):85(85-90):5(5-10)。
采用混合提取剂中甲醇：乙腈：异丙醇的体积比为(5-10):(85-90):(5-10)时，脂溶性维生素的标准曲线线性关系以及灵敏度最佳，且加标回收率均满足要求。这是因为脂溶性维生素中VA极性相对较强，需要极性相对较强的有机溶剂如乙腈进行提取，因此混合溶剂中使用了较大比例的乙腈，使用乙腈提取还因为磷脂在乙腈中的溶解度很小，可以减少基质效应；提取剂使用了较小比例的甲醇，是因为与单纯使用乙腈相比，两者的混合可以获得更好的沉淀效果和重现性，其中甲醇：乙腈比例为(5-10):(85-90)时效果最佳；维生素E具有很强的非极性，易溶于各种有机溶剂，因此在混合溶剂中添加了较小比例的异丙醇，添加后VE的提取效率增加，重现性也得到了很好的保证。
进一步地，所述提取剂中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为10:85:5。
进一步地，所述复溶液为90％的甲醇水。
采用高浓度甲醇水进行复溶，能显著提升维生素E的提取效率，原因为VE为脂溶性维生素，溶于甲醇等有机试剂中，不溶于水，因此需要使用高比例有机相的复溶液进行复溶。
进一步地，还包括标准品、质控品、液相色谱流动相和耗材，所述标准品为：含有标准浓度的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和维生素E中的任意一种或多种的溶液，采用兔红细胞和2％BSA作为基质配制；所述质控样品为：含有低中高三个不同水平浓度的兔红细胞和牛2％BSA基质样品。
现有的干血斑检测脂溶性维生素过程中，标准曲线的线性关系都不好，甚至不成线性，会严重影响干血斑中脂溶性维生素检测的准确性。
本发明通过采用动物红细胞和2％BSA混合来制备全血，从而用于制备干血斑的空白全血基质。研究证明，采用兔红细胞和2％BSA混合制备的兔全血，用作干血斑的空白全血基质时，配置的标准曲线线性关系和加标回收率更符合要求。
进一步地，所述兔红细胞体积和2％BSA的体积为4：6。
另一方面，本发明提供了一种干血斑空白基质，包括兔红细胞和2％BSA。
再一方面，本发明提供了一种干血斑中脂溶性维生素的检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备干血斑样品；
(2)湿润干血斑；
(3)添加内标工作液，所述内标工作液由乙醇配制；
(4)添加提取剂，超声提取；
(5)氮气吹干，添加复溶液复溶；
(6)液相色谱串联质谱检测。
进一步地，步骤(2)所述湿润干血斑，是指用水湿润干血斑；步骤(4)所述提取剂包括甲醇、乙腈和异丙醇，所述甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为(5-10):(85-90):(5-10)。
进一步地，所述提取剂中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为10:85:5。
干血斑润湿后再进行提取，提取的灵敏度更好，重现性更佳，明显优于不加水直接进行提取。因为干血斑滤纸为纤维素材料，加入适量水后可以使滤纸发生膨胀，使小分子物质从纤维素链间游离出来，从而提高提取效率。
超声提取虽然对于维生素A和25-羟基维生素D的提取效果影响不大，但有利于提高维生素E的提取效果，因此当需要同时检测维生素E时，优选使用超声提取。
进一步地，步骤(5)所述复溶液为90％的甲醇水。
进一步地，步骤(1)所述干血斑样品包括标准品干血斑和质控品干血斑，所述标准品干血斑采用兔红细胞和牛血清白蛋白作为基质配制；步骤(6)所述液相色谱串联质谱采用APCI离子源进行检测。
本发明在试验初期使用ESI离子源进行检测，发现VE的标准曲线不成线性，加标回收率不符合要求(要求为85％-115％之间)，后改用APCI离子源进行检测，VE的标准曲线线性R均大于0.99，加标回收率均符合要求。其原因可能是APCI离子源比较适合分析中等极性或者弱极性的化合物，在某种程度上，它的选择性会更好，背景干扰较小，不容易受基质的干扰。
再一方面，本发明提供了一种干血斑空白基质的制备方法，所述方法包括以下步骤：(a)兔全血静止分层后除去上层血浆，剩余血细胞倒入容器中混匀；(b)向容器中加入与移去血浆层等体积的PBS缓冲液，摇匀，离心，制得兔红细胞溶液；(c)加入2％BSA溶液，其中兔红细胞溶液体积：2％BSA溶液体积为4：6，混匀。
再一方面，本发明提供了一种干血斑空白基质用于制备降低液相色谱串联质谱检测干血斑中脂溶性维生素过程中的基质效应的试剂的用途，其特征在于，所述干血斑空白基质包括兔红细胞和2％BSA。
进一步地，所述兔红细胞体积和2％BSA的体积为4：6。
本发明提供的液相色谱串联质谱检测干血斑中脂溶性维生素的方法具有以下有益效果：
(1)采血量少，创伤小，一个干血斑仅需20微升末梢血，可以解决婴幼儿采血困难的技术问题；
(2)检测准确度和灵敏度更高，结果更稳定，重现性高，同时检测维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E，可以解决临床婴幼儿脂溶性维生素检测的需求，为临床提供更精准的检测结果；
(3)前处理方法简便高效，回收率更高，分析时间仅需5min，所用试剂均为常规检测试剂，方便易得，成本低廉；
(4)采用兔红细胞和牛血清白蛋白等常规易得的试剂作为空白基质配制标准曲线，方便易得，且保证了标准曲线的准确性及可靠性，解决了内源性物质缺少空白基质的临床检测难题，为后续其他干血斑方法提供了空白基质的制备方法。
附图说明
图1是实施例1中标准样品检测色谱图；
图2是实施例1中临床样品检测色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中使用的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1：样品制备、前处理、检测、分析
基本流程：婴幼儿采集末梢血制成干血斑以后，取一个干血斑样本，加入内标和提取溶剂超声提取15min，离心取全部上清液，氮气吹干，100μL复溶液复溶，取20μL进样分析。样品通过色谱分离后，不同的脂溶性维生素在不同洗脱时间出峰，采用质谱多反应检测模式(MRM)检测4种脂溶性维生素的含量。以4种脂溶性维生素标准品浓度为横坐标，以与4种脂溶性维生素其各自内标峰面积比为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线，并绘制标准曲线图。实际样本根据标准曲线计算含量。具体如下：
一、空白基质制备：
取正常兔全血，静止分层后除去上层血浆，剩余血细胞倒入离心管中混匀；向离心管中加入与移去血浆层等体积的PBS缓冲液，轻轻摇匀后3000rpm离心5min，去除上层PBS缓冲液；重复该步骤三次，加入使用PBS配制的2％BSA溶液(血细胞体积：BSA体积为4：6)，混合完成后BSA终浓度为2％。手动上下颠倒混匀约20次，即得用于制备干血片的空白全血基质。
二、样品制备
1、标准曲线与质控样品的配置
将维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和维生素E标准品配制成混合溶液，作为标准工作液和质控工作液的储备液，再分别与制备好的空白全血基质和人全血按不同体积比混合，配制标准曲线和质控样品。
4种脂溶性维生素在标准品中具有7个系列浓度(S1～S7)，如表1所示：
表1、4种脂溶性维生素在标准品中的7个系列浓度(S1～S7)
4种脂溶性维生素在质控品中具有低(L)、中(M)、高(H)三个系列浓度，表2所示：
表2、4种脂溶性维生素在质控品中的三个系列浓度
| ng/ml | 维生素A | 25羟基维生素D2 | 25羟基维生素D3 | 维生素E |
| L | 300 | 10 | 10 | 4000 |
| M | 750 | 25 | 25 | 10000 |
| H | 1200 | 40 | 40 | 16000 |
2、内标溶液的配制
(1)内标稀释液配置：2，6-二叔丁基对甲酚6.25mg溶解于50mL乙醇溶液中，混合均匀。
(2)内标准品工作液的配制：
配制混合内标准品工作液，维生素A-d6、25-羟基维生素D2-d3、25-羟基维生素D3-d6和维生素E-d6的浓度分别为50、12.5、10和500μg/mL。
(3)内标工作液的配制：
配制内标稀释液：6.25mg BHT溶于50mL乙醇中，混匀后超声得到0.625mg/mL的BHT溶液。
内标工作液的配制具体见表3。
表3、4种脂溶性维生素内标工作液配置
在保证比例不变的前提下，可以适当调节体积。
三、样品前处理
样品包括待测临床样本人血斑、标准曲线样品、质控样品，均采用如下方法处理：
(1)打6-8mm血斑一片于2mL离心管中，加入50-75μL超纯水浸润血斑，加入50-75μL内标工作液和250-300μL提取剂(甲醇、乙腈和异丙醇混合液，体积比为10:85:5)，超声15min；
(2)15000rpm离心10min；
(3)取400μL上清液于新的96孔板中，40℃氮气吹干；
(4)加100μL复溶液(90％甲醇)复溶，1000rpm震荡10min，样品待测。
其中，临床样本的采集：使用新生儿血液收集卡，滤纸片上需标记受检者姓名、性别、年龄和采样日期。末梢采血时弃去第一滴血。第二滴血点在滤纸片中央的圆圈内，每孔需要20μL全血。采血后将滤纸片至少自然阴干4小时(在潮湿气候下至少24小时)，避免阳光和紫外线直射。阴干后置于密封样本袋中保存。
四、样品检测
取30μL样品进液相色谱质谱联用系统分析，具体分析条件如下：
液相色谱串联质谱系统：凯莱谱CalQuant-S；色谱柱：Phenomenex KinetexPhenyl-Hexyl(2.6μm,50×3.0mm)；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸甲醇-5％异丙醇；流速：0.5mL/min；柱温：40℃；进样器温度：2-8℃；进样量：30μL。洗脱梯度如表4。
表4、洗脱梯度
| 时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A％ | 流动相B％ |
| 0.00 | 0.50 | 50.0 | 50.0 |
| 0.50 | 0.50 | 50.0 | 50.0 |
| 0.60 | 0.50 | 17.0 | 83.0 |
| 2.90 | 0.50 | 15.0 | 85.0 |
| 3.00 | 0.50 | 7.0 | 93.0 |
| 4.40 | 0.50 | 7.0 | 93.0 |
| 4.50 | 0.50 | 50.0 | 50.0 |
| 5.00 | 0.50 | 50.0 | 50.0 |
4种维生素的保留时间如下：维生素A为2.43min，25羟基维生素D2为2.46min，25羟基维生素D3为2.34min，维生素E为4.33min。
液相色谱上分离出的4种脂溶性维生素进入到质谱进行检测，利用采用大气压力化学离子源(APCI)和多反应监测扫描模式(MRM)检测4种脂溶性维生素的含量，并绘制标准曲线图。
质谱检测条件：大气压化学电离(APCI)源，正离子模式；放电电流：5μA；温度：450℃；雾化气：60psi；辅助加热气：50psi；气帘气：25psi；多反应监测(MRM)扫描方式离子对信息如表5所示：
表5、离子对信息及参数
五、数据处理及分析
对4种脂溶性维生素的标准曲线采用加权最小二乘法(权重因子l/conc2)进行线性回归得到本分析方法的线性范围，横坐标为4种脂溶性维生素标准品浓度，纵坐标为4种脂溶性维生素标准品峰面积与其各自内标峰面积的比，具有代表性的标准曲线及相关系数见表6。
表6标准曲线回归方程及相关系数
样品经超高压液相色谱分离后，不同的脂溶性维生素在不同洗脱时间出峰，并且被质谱选择反应监控模式检测到，从而检测其含量，标准曲线及临床样本色谱图分别见图1和图2。
采用本实施例提供的方法检测干血斑中的4种脂溶性维生素，能显著提升4种脂溶性维生素的检测灵敏度，维生素A的检测下限达到150ng/mL，25羟基维生素D2的检测下限达到2.5ng/mL，25羟基维生素D3的检测下限达到5ng/mL，维生素E的检测下限达到500ng/mL。
六、准确度、精密度、加标回收率
1、准确度和精密度
4种脂溶性维生素准确度和精密度通过分析分布在线性范围内的低，中，高3个浓度点的质控品得到。接受标准为测定值均值和理论值间的准确度在85％～115％之间，精密度由变异系数(CV％)表示，精密度(CV)≤15％符合要求。精密度三批测试，低中高三个浓度准确度在92.6％～107.24％之间，批间精密度(CV)在3.78％～9.14％之间，符合要求。
2、加标回收率
取正常人全血样本，平均分成四份，其中三份样本分别按低中高浓度加入4种脂溶性维生素标准品混匀。四份样本同时进行样品前处理计算加标回收率。接受标准为加标回收率需要在85.0％～115％之间。经测试，4种脂溶性维生素三个浓度的加标回收率在92.9％～108％之间，符合要求。
实施例2：干血斑是否润湿对检测结果的影响
本实施例按照实施例1提供的方法，取标准曲线最低浓度点(S1)制备干血斑，在干血斑提取部分分别比较了针对每个干血斑进行直接提取和用水润湿后再提取的差异，共分5组：1、不加水；2、加20μL超纯水；3、加50μL超纯水；4、加75μL超纯水；5、加100μL超纯水。再经前处理和高效液相色谱串联质谱检测，考察是否加水以及不同的加水量对脂溶性维生素的加标回收率及CV％(重复三次)的影响。由于对维生素A和维生素E的影响较明显，这里以维生素A和维生素E的加标回收率、CV％(重复三次)及检测灵敏度进行举例证明；考察结果如表7和8所示。
表7、干血斑是否润湿对检测维生素A结果的影响
表8、干血斑是否润湿对检测维生素E结果的影响
由表7和表8可见，与有机溶剂直接提取相比，先用水润湿再提取的VA、VE灵敏度可提高2倍左右。干血斑不用水润湿直接提取VA、VE的变异系数CV％大于25％，用水润湿后再提取的变异系数CV％小于10％。
因此，干血斑润湿后再进行提取明显优于不加水直接进行提取。具体表现为干血斑润湿后再进行提取的灵敏度更好，重现性更佳。其可能原因为：干血斑滤纸为纤维素材料，加入适量水后可以使滤纸发生膨胀，从而使小分子物质从纤维素链间游离出来，从而提高提取效率。
另外，加水量的多少也会对提取效果产生影响，优选采用加50～75μL超纯水。
实施例3：内标稀释液中加乙醇对检测结果的影响
本实施例按照实施例1提供的方法，取标准曲线最低浓度点(S1)制备干血斑，50μL超纯水润湿干血斑，再分别采用不同的内标稀释液配制内标工作液，比较干血斑中加入不同内标稀释液对检测结果的影响。内标工作液的配制如表9、10所示，考察不同内标稀释液对脂溶性维生素的加标回收率、检测准确度，以及制备的标准曲线线性的影响。由于对4种维生素的影响情况类似，这里以维生素D的加标回收率、CV％(重复三次)及标准曲线线性进行举例证明；考察结果如表9、10所示。
表9、不同内标稀释液对检测25羟基维生素D2结果的影响
表10、不同内标稀释液对检测25羟基维生素D3结果的影响
由表9和表10可以看出，干血斑加入含有乙醇的内标稀释液配制的内标后再进行提取时效果更佳，重现性更好，标准曲线相关系数R均大于0.99，加标回收率均符合要求(85％-115％之间)。其原因为：25-羟基维生素D在循环血液中主要和特异性维生素D结合蛋白或白蛋白偶联，仅有0.03％的25-羟基维生素D以游离形式存在，虽然直接用提取剂也能提取部分被蛋白结合的25-羟基维生素D，但直接提取并不能使25-羟基维生素D充分释放，所以前处理过程中还需要使用乙醇等有机溶液先使蛋白质发生变性，将25-羟基维生素D从结合蛋白上释放出来再进行提取，能进一步提高提取效率。
同时还比较了不同有机溶剂(乙醇、甲醇、乙腈和20％甲醇丙酮)制备的内标稀释液，含乙醇的内标稀释液的干血斑提取效果最佳。
实施例4：不同提取剂对检测结果的影响
本实施例按照实施例1提供的方法，取标准曲线最低浓度点(S1)制备干血斑，50μL超纯水润湿干血斑，添加采用BHT和乙醇配制的内标工作液，再分别采用不同提取剂进行提取，比较不同提取剂对检测结果的影响。提取剂的选择如表11～14所示，测得S1样品中4种脂溶性维生素的峰面积及重现性(CV％)如表11～14所示。
表11、不同提取剂对检测维生素A结果的影响
表12、不同提取剂对检测25羟基维生素D2结果的影响
表13、不同提取剂对检测25羟基维生素D3结果的影响
表14、不同提取剂对检测维生素E结果的影响
由表11～14可以看出，采用混合提取溶剂(10％甲醇+85％乙腈+5％异丙醇)时4种脂溶性维生素线性以及灵敏度最佳，且加标回收率均满足要求。这是因为4种脂溶性维生素中VA极性相对较强，因此需要极性相对较强的有机溶剂如乙腈，因此混合溶剂中使用了较大比例的乙腈，使用乙腈沉淀还因为磷脂在乙腈中的溶解度很小，可以减少基质效应；使用了较小比例的甲醇是因为与单纯使用乙腈相比，两者的混合可以获得更好的沉淀效果和重现性，在本方法中甲醇：乙腈比例为(5-10):(85-90)时效果最佳；维生素E具有很强的非极性，易溶于各种有机溶剂，因此在混合溶剂中添加了较小比例的异丙醇，添加后VE的提取效率增加，重现性也得到了很好的保证。
实施例5：内标工作液中不含乙醇，而提取剂中含有乙醇对检测结果的影响
本实施例按照实施例1提供的方法，取标准曲线最低浓度点(S1)制备干血斑，50μL超纯水润湿干血斑，添加内标工作液，再分别采用是否含有乙醇的提取剂进行提取，比较乙醇的添加顺序对检测结果的影响。乙醇的添加顺序如表15所示，由于对4种维生素的影响情况类似，这里以25羟基维生素D2的加标回收率、CV％(重复三次)及标准曲线线性进行举例证明；考察结果如表15所示。
表15、不同内标稀释液对检测25羟基维生素D2结果的影响
由表15可以看出，乙醇的添加顺序对干血斑样品的前处理效果有显著影响，只有当先经含有乙醇的内标稀释液处理后，才能使25-羟基维生素D2从结合蛋白上释放出来，再经提取剂处理，从而提高前处理效果；而如果将乙醇直接加入到提取剂中后，则无法充分发挥乙醇使蛋白变性的效果，25-羟基维生素D2的提取效率明显降低。
实施例6：不同提取方式对检测结果的影响
本实施例按照实施例1提供的方法，取标准曲线最低浓度点(S1)制备干血斑，50μL超纯水润湿干血斑，添加采用BHT和乙醇配制的内标工作液，再采用10％甲醇+85％乙腈+5％异丙醇作为提取剂进行提取，提取方式分别采用超声提取和振荡提取，比较不同提取方式对检测结果的影响，检测结果如表16所示。
表16、不同提取方式对检测维生素A结果的影响
由表16可以看出，超声提取和振荡提取对VA和25-羟基维生素D的提取效率影响不大，检测结果准确度均在85％-115％之间；VE超声提取的效果优于振荡提取的效果。因此，仅检测VA和25-羟基维生素D时，可以选择超声提取或者振荡提取；需要检测VE时，推荐使用超声进行提取。
实施例8：不同复溶液对检测结果的影响
本实施例按照实施例1提供的方法，取标准曲线最低浓度点(S1)制备干血斑，50μL超纯水润湿干血斑，添加采用BHT和乙醇配制的内标工作液，再采用10％甲醇+85％乙腈+5％异丙醇作为提取剂进行超声提取，经离心和氮气吹干后，分别采用不同复溶液进行复溶，由于不同复溶液对维生素E的检测结果影响最明显，本实施例考察不同复溶液对检测维生素E结果的影响，结果如表17所示。
表17、不同复溶液对检测维生素E结果的影响
由表17可以看出，采用不同复溶液，对检测维生素E的提取效率存在显著影响，本实施例在试验初期使用了50％的甲醇水进行复溶，VE响应偏低，后来调整为90％的甲醇水进行复溶，VE响应提高了80倍。其原因可能是因为VE为脂溶性维生素，溶于甲醇等有机试剂中，不溶于水，因此需要使用高比例有机相的复溶液进行复溶。
实施例9：采用不同离子源对检测结果的影响
本实施例按照实施例1提供的方法，取标准曲线最低浓度点(S1)制备干血斑，经样品前处理后，在质谱检测过程中，分别采用不同离子源，考察不同离子源对检测脂溶性维生素结果的影响，由于对4种脂溶性维生素的影响情况类似，这里以维生素E的加标回收率、CV％(重复三次)及标准曲线线性进行举例证明；结果如表18所示。
表17、不同复溶液对检测维生素E结果的影响
由表18可以看出，在检测时分别比较了采用ESI离子源与APCI离子源进行检测时对维生素E的检测结果有着显著影响。本实施例在试验初期使用ESI离子源进行检测，但VE的标准曲线不成线性，加标回收率不符合要求(准确度不在85％-115％之间)。改用APCI离子源进行检测后，VE的标准曲线线性R均大于0.99，加标回收率均符合要求(准确度在85％-115％之间)。其原因可能是APCI源比较适合分析中等极性或者弱极性的化合物，在某种程度上，它的选择性会更好，背景干扰较小，不容易受基质的干扰。
实施例10：采用不同空白基质对检测结果的影响
由于人全血购买困难，不宜大批量使用，因此需要选择基质效应更低的动物血来替代。本实施例按照实施例1提供的方法，取标准曲线最低浓度点(S1)制备干血斑，在空白基质的选择方面分别比较了牛全血、猪全血及兔全血的影响。以上几种全血均按照以下步骤制备空白基质：全血样本静止分层后除去上层血浆，剩余血细胞倒入离心管中混匀。加入与移去血浆层等体积的1*PBS缓冲液，轻轻摇匀后3000rpm离心5min，去除上层PBS缓冲液。重复该步骤三次，加入使用PBS配制的2％BSA溶液(血细胞体积：BSA体积为4：6)，混合完成后BSA终浓度为2％。手动上下颠倒混匀约20次，即得用于制备干血片的空白全血基质。分别考察不同空白基质对脂溶性维生素的基质效应，由于本发明的全血是采用血细胞加BSA配制而成的，因此本实施例在考察不同全血的基质效应时，还同时考察了不同浓度的BSA的基质效应，不同全血的基质效应结果如表18～21所示，采用不同浓度的BSA配制兔全血用作空白基质，其基质效应结果如表22～25所示。
表18、不同空白基质对检测维生素A结果的影响
表19、不同空白基质对检测25羟基维生素D2结果的影响
表20、不同空白基质对检测25羟基维生素D3结果的影响
表21、不同空白基质对检测维生素E结果的影响
表22、不同浓度的BSA对检测维生素A结果的影响
表23、不同浓度的BSA对检测25羟基维生素D2结果的影响
表24、不同浓度的BSA对检测25羟基维生素D3结果的影响
表25、不同浓度的BSA对检测维生素E结果的影响
由表18～21可以看出，相比其他全血，兔全血对干血斑中脂溶性维生素的基质效应明显更低。由表22～25可以看出，不同浓度的BSA配制兔全血，对脂溶性维生素的基质效应也明显不同，采用2％的BSA制备兔全血空白基质，可以进一步降低基质效应。
本实施例还采用兔全血空白基质分别配置标准曲线，结果表明，以兔全血处理后配置的标准曲线线性和加标回收率均符合要求。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (1)
1.一种高度精准检测干血斑中4种脂溶性维生素的方法，其特征在于，由以下步骤组成：
（1）制备干血斑样品，所述干血斑样品由20μL全血制备；
（2）用50~70μL超纯水湿润干血斑；
（3）添加50~75μL内标工作液，所述内标工作液采用2,6-二叔丁基对甲酚和乙醇配制；配制方法：2,6-二叔丁基对甲酚6.25mg溶解于50mL乙醇溶液中，混合均匀；
（4）添加250~300μL提取剂，所述提取剂为甲醇、乙腈和异丙醇的混合液，所述甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为10:85:5，超声提取；
（5）氮气吹干，添加100μL复溶液复溶，所述复溶液为90%的甲醇水；
（6）液相色谱串联质谱检测，所述液相色谱串联质谱采用APCI离子源进行检测；色谱柱：Phenomenex Kinetex Phenyl-Hexyl，2.6μm, 50×3.0mm；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸甲醇-5%异丙醇；流速：0.5mL/min；柱温：40℃；进样器温度：2-8℃；进样量：30μL，洗脱梯度如下表：
；
质谱检测条件：大气压化学电离源，正离子模式；放电电流：5μA；温度：450℃；雾化气：60psi；辅助加热气：50psi；气帘气：25psi；多反应监测扫描方式离子对信息如下表所示：
；
所述4种脂溶性维生素为维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和维生素E；所述高度精准检测是指维生素A的检测下限达到150ng/mL，25-羟基维生素D2的检测下限达到2.5ng/mL，25-羟基维生素D3的检测下限达到5ng/mL，维生素E的检测下限达到500ng/mL。
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