CN113960211A - 一种血清中维生素k的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血清中维生素K的测定方法。本发明综合考虑血清中维生素K萃取效率的影响所有影响因素，在液相色谱测定之前设计了前处理步骤；经过多次实验验证，本发明在流动相乙腈、乙酸乙酯、甲醇混合液中加入乙酸、乙酸钠和氯化锌，以催化维生素K同系物的母核萘醌环产生荧光。本发明与现有技术相比：同样的标准品，响应值相差2.5倍，噪音基本不变，即灵敏度提高2.5倍。且本发明在优化的色谱条件下，维生素K1、K2得到了良好的分离，标准品的检测限达到0.1μg/L。

Description

一种血清中维生素K的测定方法
技术领域
本发明涉及一种测定血清中维生素K的方法,属于维生素检测技术领域。
背景技术
维生素 K 除了作为凝血必需的辅酶因子外，近年来越来越多的研究显示它在细胞信号转导、骨骼代谢等方面都发挥着重要作用。维生素K在酶促羧化反应中起辅助作用,例如谷氨酸羧化酶-谷氨酸残基形成蛋白质中的-羧谷氨酸；维生素K还可以降低血管钙化和骨质疏松的风险(基质Gla蛋白，骨钙素)，与“钙化段”相关。
维生素K1(vitaminK1 )是一种脂溶性维生素，为黄色至橙黄色的透明粘稠液体，广泛存在于绿色植物中。作为肝脏凝血酶原形成的必需物质，维生素K2是一系列具有不同异戊二烯链的甲萘醌，溶于正己烷、乙酸乙酯等非极性溶剂，血液中的维生素K大多呈脂肪结合态，极少以游离状态存在，考虑到维生素K的存在状态，选择血清作为检测样本，分析其在人体内的含量水平、分布特征，以进一步探讨不同形态维生素 K 的生理功能、生物活性以及安全补充限量等提供可能。
近年来，维生素类物质的检测方法报道较多，如紫外检测法、荧光法、电化学法和质谱法等。维生素K的相关报道较少。目前，国内尚未有血清中维生素 K检测的相关标准，相关检测方法报道也较少，食品中维生素K的检测方法主要包括高效液相色谱－紫外检测法、毛细管电泳法、高效液相色谱－质谱法等，前处理采取的方法有直接萃取法和薄层纯化法，面对的样品主要是原料药、食品添加剂等基质较为干净、含量较高的样品。
维生素 K 的不饱和酮结构共轭体系较小，不能产生荧光，但能通过衍生法使维生素 K 同系物的母核萘琨环产生荧光，以提高其在高效液相色谱荧光检测器上的响应值，从而达到检测目的。另外，维生素K在血清中含量极少，且易受强酸、氧化剂、碱及光的作用而分解。并且，基质复杂、含量较低，大多以脂肪结合态存在，直接萃取或超滤等方法，萃取不完全、杂质干扰大，无法满足血清中维生素K高通量、高灵敏度检测的要求。因此有必要建立一种血清中维生素K的测定方法，以检测不同人群血清中维生素K的分型、含量水平、分布特征。
发明内容
本发明的目的是提供一种血清中维生素K的测定方法，以弥补现有技术的不足。
本发明在现有的食品中维生素K1 检测技术之上基础上，重点针对基质复杂、含量水平相对较低、以脂肪结合态存在的血清样品为研究对象，探讨适宜的样品提取技术和色谱分离技术，以保证检测方法的灵敏性和准确性。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种血清中维生素K的测定方法，包括以下步骤：
（1）获取待检测血清样本；
（2）将血清样本进行检测前处理，且准备空白实验样本；
（3）液相色谱测定：检测仪器为液相色谱配荧光检测器，色谱条件为：
a.色谱柱：ZORBAX C18柱，或等效色谱柱；
b.流动相:乙腈+乙酸乙酯+甲醇+氯化锌+乙酸钠
d.流速：1mL/min；
e.柱温：30℃
f.进样量：50μL；
g.激发波长248nm，发射波长：418nm；
（4）标准曲线制作；
（5）对照标准曲线，计算血清维生素K含量。
进一步的，所述步骤（1）中，空腹静脉血，取血方法依据WS/T 225以及检测方法要求的采集方法；采集的血液样品经4000r/min离心10min，分离血清血浆，使用不同采血管分装；样品于2℃～8℃可稳定7天，-20℃可稳定12个月；若标本不能及时检测，建议适量分装后于-70℃存放标本，仅一次冻融；样品于检测前避光解冻至室温。
进一步的，所述步骤（2）具体为：确移取解冻至室温的试样，加入脂肪酶，混合后进行恒温振荡酶解，加入乙醇、50%氢氧化钾溶液，混合后加入正己烷，提取后离心，取上清液于一离心管中，下层再经正己烷重复提取，合并正己烷层于该离心管中，氮干，流动相复溶过膜后，进行液相色谱测定；将血清用紫外灯照射后，去除维生素K，按该前处理方法做空白试验。
进一步的，所述步骤（3）中，检测仪器为液相色谱配荧光检测器， C18柱，柱长150mm，内径4.6mm,粒径5μm或等效色谱柱，锌粉还原柱，50×6mm，流动相：乙腈（含乙酸乙酯20%，甲醇10%，0.5g/L氯化锌，0.1mL/L乙酸，0.15g/L乙酸钠）；流速：1.5mL/min；检测波长：激发波长为248nm，发射波长为418nm；进样量：50μL。
进一步的，所述步骤（4）中，标准系列工作溶液浓度含维生素K1和四烯甲萘醌、七烯甲萘醌分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，按步骤（3）标准优化的色谱条件进样分析，以各组分的浓度的为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。其中，维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌检出限分别为0.20ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL，最低定量限分别为1.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL。
本发明的优点和技术效果：
本发明综合考虑血清中维生素K萃取效率的影响所有影响因素，在液相色谱测定之前设计了前处理步骤；经过多次实验验证，本发明在流动相中加入乙酸、乙酸钠和氯化锌，以催化维生素K同系物的母核萘醌环产生荧光。本发明与现有技术相比：同样的标准品，响应值相差2.5倍，噪音基本不变，即灵敏度提高2.5倍。且本发明在优化的色谱条件下，维生素K1、K2得到了良好的分离，标准品的检测限达到0.1μg/L。
实验结果表明：在线性范围1.0ng/mL～20.0ng/mL内，线性关系良好(r≥0.995)；三个水平添加（2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL）回收率为80.0%～97.6%；对加标样品进行6次独立测定，其相对标准偏差均小于5%；维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌的最低定量限分别为1.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL。该方法操作简单，结果准确，重复性好，可用于血清中维生素K的定性定量分析。
附图说明
图1 维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌标准品色谱图。
图2 空白样品色谱图。
图3 空白加标（10ng/mL）样品色谱图。
图4 血清样品色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例并结合附图对本发明进一步解释和说明。
实施例1：
一种血清中维生素K的测定方法，包括以下步骤：
（1）取样：空腹静脉血，取血方法依据WS/T 225以及检测方法要求的采集方法。采集的血液样品经4000r/min离心10min，分离血清血浆，使用不同采血管分装。样品于2℃～8℃可稳定7天，-20℃可稳定12个月。若标本不能及时检测，建议适量分装后于-70℃存放标本，仅一次冻融。样品于实验前避光解冻至室温。
（2）前处理：准确移取解冻至室温的试样200μL于10mL离心管中，加入0.04g脂肪酶，涡旋混合2min～3min，置于37℃±2℃恒温水浴振荡器中振荡酶解3h，加入0.3mL乙醇，加0.02mL50%氢氧化钾溶液，涡旋混合1min，加0.2mL正己烷，涡旋提取1min，6000r/min离心3min，取上清液于另一10mL离心管中，下层用0.2mL正己烷重复提取2次，合并正己烷层于10mL离心管中，40℃避光氮吹至干，用200μL流动相复溶，过0.22μm有机系滤膜，装入盛有内插管的样品小瓶中，液相色谱测定。
空白实验：将血清用紫外灯照射72小时后，去掉维生素K，按前处理方法做空白试验。
（3）液相测定：检测仪器为液相色谱配荧光检测器，色谱条件：
a.色谱柱：ZORBAX C18柱，柱长250mm，内径4.6mm,粒径5μm 或等效色谱柱，锌粉还原柱，50×6mm
b.流动相:450mL乙腈+450mL乙酸乙酯+100mL甲醇+1.5g氯化锌+0.5g乙酸钠
d.流速：1mL/min；
e.柱温：30℃
f.进样量：50μL；
g.激发波长248nm，发射波长：418nm
在该色谱条件下，维生素K1、K2得到了良好的分离，标准品的检测限达到0.1μg/L。
（4）标准曲线制备：标准系列工作溶液浓度含维生素K1和四烯甲萘醌、七烯甲萘醌分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，按标准优化的色谱条件进样分析，以各组分的浓度的为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，。
实验结果表明：在线性范围1.0ng/mL～20.0ng/mL内，线性关系良好(r≥0.995)；三个水平添加（2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL）回收率为80.0%～97.6%；对加标样品进行6次独立测定，其相对标准偏差均小于5%；维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌检出限分别为0.20ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL，最低定量限分别为1.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL。
（5）计算血清样品中的维生素K的含量。
最终，得到的测定结果图如图1-4所示，图1是维生素VK1、四烯甲萘醌（MK-4）、七烯甲萘醌（MK-7）标准品色谱图；图2是空白样品色谱图；图3是空白加标（10ng/mL）样品色谱图；图4是血清样品色谱图，由图可以看出，通过本发明提供的色谱方法，能够有效鉴别出维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌，且通过图4，也能看出血清样本中三者的有效检出。实际实验结果表明，在11分钟内能够完成维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌的检测；且最低血清用量200微升。
上述方法的验证步骤：利用液质方法进行验证，具体色谱条件：
1、仪器：液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(Agilent6460)
2、色谱条件：
a.色谱柱：Poroshell EC-C18 120,100×3.0mm，2.7μm
b.流动相：A甲醇B乙腈
流动相梯度：流动相梯度：0～0.5min，A 10％；0.50～12min，A 10％～80％；12.5min～15min， A 10％；
c.流速：0.400mL/min
d.柱温：40℃
e.进样量：5μL；
3、质谱条件：
离子源：电喷雾离子源，正离子模式
毛细管电压：3500V
离子源温度：3000℃
扫描模式：多反应监测
多反应监测条件如下：
Figure RE-GDA0003400467110000051
经验证，本发明提供的液相色谱条件能够有效达到分离鉴定维生素K(维生素K1、四烯甲萘 醌、七烯甲萘醌)的目的。
实施例2：以实施例1提供的血清中维生素K的测定方法为基础，进行具体实验验证。
1 材料与方法
维生素K1(C31H46O2，CAS号：84-80-0)、四烯甲萘醌(C31H40O2，CAS号：863-61-6)、七烯甲萘醌(C46H64O2，CAS号：2124-57-4)均购自Sigma公司，脂肪酶(酶活力≥100U/mg)上海麦克林公司，乙腈(C2H3N)、甲醇（CH3OH)、正己烷(C6H14)、乙酸乙酯(C4H8O2)、冰乙酸(CH3COOH)、乙醇(C2H5OH)均为色谱纯，氯化锌(ZnCl2)、无水乙酸钠（CH3COONa）、氢氧化钾(KOH)为分析纯。
安捷伦1260型高效液相色谱仪配荧光检测器(美国安捷伦公司)，METTLERXS205DU(感量0.01mg，购自Mettler-Toledo公司)和204系列电子分析天平(感量0.1mg，购自Mettler-Toledo公司)，Heidolph Multi Reax涡旋振荡器(购自Heidolph公司)，3-18K型冷冻离心机（德国Sigma公司），mini-Q型超纯水制备器（美国MILLIPORE公司）。
血清来自5名健康志愿者(年龄18～50岁)，遵循自愿原则。
实验方法
标准溶液的配制
标准贮备液（1mg/mL）：准确称取0.01g（精确至0.0001g）维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌标准品于10mL容量瓶中，用乙腈-乙酸乙酯溶液溶解并定容，此溶液浓度为10mg/mL，-18℃避光保存，有效期三个月。
混合标准中间液(100μg/mL)：准确吸取维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌标准贮备溶液各10.00mL，混合于100mL容量瓶中，加乙腈-乙酸乙酯溶液至刻度，摇匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中，在-18℃下避光保存，保存期2个月。
混合标准标准使用液(1.00μg/mL)：准确吸取标准中间液1.00mL于100mL容量瓶中，加乙腈-乙酸乙酯溶液至刻度，摇匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中，在-18℃下避光保存，保存期1周。
标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌混合标准标准使用液10µL、20µL、50µL、100µL、200µL于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，混匀，此标准系列工作溶液浓度含维生素K1和四烯甲萘醌、七烯甲萘醌分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，临用时配置。
样品处理方法
空腹静脉血，取血方法依据WS/T 225以及检测方法要求的采集方法。采集的血液样品经4000r/min离心10min，分离血清血浆，使用不同采血管分装。样品于2℃～8℃可稳定7天，-20℃可稳定12个月。若标本不能及时检测，建议适量分装后于-70℃存放标本，仅一次冻融。样品于实验前避光解冻至室温。
准确移取解冻至室温的试样1mL于10mL离心管中，加入0.2g脂肪酶，涡旋混合2min～3min，置于37℃±2℃恒温水浴振荡器中振荡酶解3h，加入1.5mL乙醇，加0.1mL50%氢氧化钾溶液，涡旋混合1min，加1mL正己烷，涡旋提取1min，6000r/min离心3min，取上清液于另一10mL离心管中，下层用1mL正己烷重复提取2次，合并正己烷层于10mL离心管中，40℃避光氮吹至干，用1mL流动相复溶，过0.22μm有机系滤膜，液相色谱测定。
空白实验：将血清用紫外灯照射72小时后，去掉维生素K，按1.2.2的步骤做空白试验。
色谱条件
安捷伦ZORBAX C18柱，柱长150mm，内径4.6mm,粒径5μm或等效色谱柱，锌粉还原柱，50×6mm，流动相：乙腈（含乙酸乙酯20%，甲醇10%，0.5g/L氯化锌，0.1mL/L乙酸，0.15g/L乙酸钠）；流速：1.5mL/min；检测波长：激发波长为248nm，发射波长为418nm；进样量：50μL。
方法学考察
（1）方法的线性试验
线性范围是指灵敏度保持不变时样品的最大量和最小量区间，反映在检测器响应曲线上就是保持直线线段的样品量变化范围。标准系列工作溶液浓度含维生素K1和四烯甲萘醌、七烯甲萘醌分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，按标准优化的色谱条件进样分析，以各组分的浓度的为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
线性范围与检出限
标准工作溶液线性回归方程，线性相关系数见表1，相关系数均大于0.995，满足试验要求。如表2，按S/N=3时的溶液浓度为检出限（LOD），可推算出这维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌检出限分别为0.20ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL。按10次测定的S/N平均值>10的浓度为最低定量限（LOQ），得出维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌的最低定量限分别为1.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL。
表1 维生素K1、K2标准回归曲线
线性方程 相关系数
维生素K<sub>1</sub> y = 1.3105x -0.2016 0.999
四烯甲萘醌 y = 1.2875x -0.0407 0.999
七烯甲萘醌 y = 3.4903x -0.2010 0.995
表2检出限和定量限
检测限（μg/Lg） 定量限（μg/L） S/N
VK<sub>1</sub> 0.20 1.0 62
MK-4 0.20 1.0 51
MK-7 0.50 2.0 37
（2）方法的精密度试验
取试样6份，每份1mL，添加10ng/mL的标准物质，进行前处理后，按所述色谱条件测定，分别计算维生素K1、K2（四烯甲萘醌、七烯甲萘醌）的精密度。
由表3可见，三个化合物的精密度均小于5%，实验数据稳定，精密度较高。
表3维生素K1、K2的相对标准偏差
维生素K1 四烯甲萘醌 七烯甲萘醌
1 13.25 11.08 10.06
2 13.14 10.93 9.77
3 13.06 10.26 10.25
4 13.41 10.19 10.13
5 13.22 11.27 10.46
6 13.29 10.48 9.82
平均值 13.23 10.70 10.08
RSD/% 1.10 4.23 2.59
（3）方法的灵敏度试验
将血清用紫外灯照射72小时后，去掉维生素K，再分别在10分空白血清中添加维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌，使其浓度分别达到1.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL，按1.2.2的步骤处理，按1.2.3的色谱条件测定，S/N=3时的溶液浓度为检出限（LOD），可推算出这维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌检出限，按10次测定的S/N平均值>10的浓度计算最低定量限（LOQ）。
（4）准确度实验
样品分别添加（2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL）维生素K1、四烯甲萘醌、七烯甲萘醌进行三水平加标回收实验确定方法的准确度。
由表4可知，样品进行三个水平的加标测定，回收率在80.0%～97.6%之间。本方法可适用于血清中维生素K1、K2的定性定量分析。
表4 维生素K1、K2的加标回收率实验
Table 4 standard addition recovery rate experiment of vitamin K1 & K2
组分 本底值/(ng/mL) 加标值/(ng/mL) 测定值/(ng/mL) 回收率/%
2 5.01 88.0
维生素K1 3.25 5 7.92 93.4
10 13.01 97.6
2 4.68 91.0
四烯甲萘醌 2.86 5 7.56 94.0
10 11.05 81.9
2 2.87 80.0
七烯甲萘醌 1.27 5 6.06 95.8
10 10.98 97.1
2 结果与分析
（1）前处理方法的优化
通过分析研究发现，维生素K极易与脂肪结合，在血清中是以脂肪结合态存在，直接萃取法、固相萃取纯化法、超滤法等方法很难将脂肪结合态的维生素K1、K2分离提取出来，导致检验结果偏低。综合考虑血清中维生素K萃取效率的影响所有影响因素，实验设计了如下前处理步骤：取1mL血清，用脂肪酶酶解后，加水、乙醇、氢氧化钾溶液，皂化后用正己烷提取，氮吹去掉正己烷，用流动相复溶，进HPLC测定。进行了5因素4水平的正交试验，优化了各前处理过程的影响因素，见表5。
表5维生素K的正交实验结果表
Table 1 Orthogonal test results of vitamin K
所在列 1 2 3 4 5
因素 脂肪酶g 水mL 时间h 乙醇mL 50%KOHmL 峰面积
实验1 0 0 0.5 0 0 3.4
实验2 0 0.5 1 0.5 0.05 29.4
实验3 0 1 2 1 0.1 24.3
实验4 0 1.5 3 1.5 0.2 29.2
实验5 0.05 0 1 1 0.2 33.2
实验6 0.05 0.5 0.5 1.5 0.1 31
实验7 0.05 1 3 0 0.05 0
实验8 0.05 1.5 2 0.5 0 1.4
实验9 0.1 0 2 1.5 0.05 36.7
实验10 0.1 0.5 3 1 0 34.5
实验11 0.1 1 0.5 0.5 0.2 2.8
实验12 0.1 1.5 1 0 0.1 0
实验13 0.2 0 3 0.5 0.1 55.4
实验14 0.2 0.5 2 0 0.2 1.2
实验15 0.2 1 1 1.5 0 26.7
实验16 0.2 1.5 0.5 1 0.05 13.7
均值1 21.575 32.175 12.725 1.15 16.5
均值2 16.4 24.025 22.325 22.25 19.95
均值3 18.5 13.45 15.9 26.425 27.675
均值4 24.25 11.075 29.775 30.9 16.6
极差 7.85 21.1 17.05 29.75 11.175 　
根据上述试验结果，前处理条件确定为：1mL血清，加0.2g脂肪酶，37°酶解3h后，加1.5mL乙醇、0.2mL50%氢氧化钾溶液皂化，涡旋混合3min，分别用1mL正己烷萃取3次，离心取上清液，合并正己烷层，40°氮吹至干，用1mL流动相复溶，过0.22μm滤膜，进HPLC分析。
（2）液相条件的优化
现有技术中通过衍生法使维生素K同系物的母核萘琨环产生荧光，提高其在高效液相色谱荧光检测器上的响应值；而柱后衍生-液相色谱荧光检测器法通常流动相含有四氢呋喃或二氯甲烷。国家标准中流动相使用的四氢呋喃，四氢呋喃对身体危害较大；二氯甲烷对反相色谱系统的脱气包具有强烈的腐蚀性，长期大量使用会造成脱气包渗漏。
本申请经过多种实验验证，分别试验了甲醇+二氯甲烷，乙腈+乙酸乙酯，乙腈+乙酸乙酯+甲醇的不同组成及比例的流动相，在流动相中加入乙酸、乙酸钠和氯化锌，以催化维生素K同系物的母核萘醌环产生荧光。本文对比现有技术方法，同样的标准品，响应值相差2.5倍，噪音基本不变，即灵敏度提高2.5倍。
上述实施例验证了，本发明提供的测定方法操作简单，结果准确，重复性好，能够用于血清中维生素K的定性定量分析。本发明通过优化血清中维生素K1、K2的提取条件及蛋白质、脂肪等生物大分子的去除条件，建立了血清中维生素K1、K2提取净化的前处理方法。通过优化液相色谱分离条件，建立维生素K1、K2的液相色谱荧光检测方法。通过对线性范围、检出限、定量限、精密度、准确性等方法学验证，证明了本方法的准确性和可靠性，为后续检测不同人群血清中维生素K的分型、含量水平、分布特征及相关标准的制定奠定了基础。

Claims (5)

1.一种血清中维生素K的测定方法，其特征在于，该测定方法包括以下步骤：
（1）获取待检测血清样本；
（2）将血清样本进行检测前处理，且准备空白实验样本；
（3）液相色谱测定：检测仪器为液相色谱配荧光检测器，色谱条件为：
a.色谱柱：C18柱或等效色谱柱；
b.流动相: 乙腈、乙酸乙酯、甲醇混合液；
c.激发波长248nm，发射波长：418nm；
（4）制作标准曲线；
（5）对照标准曲线，计算血清维生素K含量。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中，空腹静脉血，取血方法依据WS/T 225以及检测方法要求的采集方法；采集的血液样品经离心后分离血清血浆。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：确移取解冻至室温的试样，加入脂肪酶，混合后进行恒温振荡酶解，加入乙醇、50%氢氧化钾溶液，混合后加入正己烷，提取后离心，取上清液于一离心管中，下层再经正己烷重复提取，合并正己烷层于该离心管中，氮干，流动相复溶过膜后，进行液相色谱测定；将血清用紫外灯照射后，去除维生素K，按该前处理方法做空白试验。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（3）中，选择 C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm或等效色谱柱，锌粉还原柱，规格在50×6mm。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤（3）中，流动相为乙腈混合液，以体积百分数计，含乙酸乙酯20%、甲醇10%，以及0.5g/L氯化锌、0.1mL/L乙酸和0.15g/L乙酸钠；流速：1.5mL/min；进样量：50μL。
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