CN114740107A - 基于gc-ms或gc-ms/ms测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法 - Google Patents

基于gc-ms或gc-ms/ms测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于GC‑MS或GC‑MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，属于气质联用检测短链脂肪酸技术领域；先配制不同浓度的含有11种短链脂肪酸的混合标准工作液，加入酸液和内标，进行GC‑MS检测，获得相应的线性回归方程；然后取人或动物的粪便、血浆或尿液样本，加入酸液预处理；先后加入第一萃取液，第二萃取液和内标，冰上涡旋振荡，冰水浴超声，离心取上清液，进行GC‑MS或GC‑MS/MS检测，与线性回归方程比对，获得11种短链脂肪酸的含量。本发明提供的定量检测方法能够快速准确的对生物样本中SCFAs含量较高的肠道内容物如粪便及血浆、尿液中痕量SCFAs的精准检测，样本用量少、检测灵敏度高、适用广泛的优点。

Description

基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪 酸含量的方法
技术领域
本发明属于气质联用检测短链脂肪酸技术领域，特别是基于GC-MS或 GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法。
背景技术
短链脂肪酸(SCFAs)是结肠上皮细胞重要的能量来源，作为配体能够激活特异性蛋白偶联受体，调节上皮细胞的增殖和分化；对炎症性肠病、结直肠癌、2- 型糖尿病、肥胖和心血管疾病具有明显的保护作用。技术人员发现，粪便等肠道微生物群中短链脂肪酸含量较高，可以通过采集生物粪便样本，利用气相色谱- 质谱联用等技术进行短链脂肪酸检测。
现有技术中，中国专利申请CN105651908A提供了一种基于GC-MS定量肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸的方法，以小鼠肠道内容物及粪便为样本，通过冻干，乙酸乙酯萃取，加入衍生化试剂MTBSTFA进行衍生化处理，最后使用GC-MS技术得到质谱图，与NIST、WILY等谱库提供的质谱图对照，对样本中化合物进行定性分析；以11种短链脂肪酸特征离子峰的峰面积与相应的内标特征离子峰m/z 116的峰面积之比为纵坐标y，短链脂肪酸浓度为横坐标 x绘制曲线，得到样本中11种短链脂肪酸定量检测的结果。中国专利申请CN111239267A提供了一种基于GC-MS检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，将淋巴组织研磨离心得到淋巴提取液，加入内标物，再加入五氟溴卞衍生化反应；使用正己烷萃取后利用GC-MS对萃取液中的乙酸、丙酸和丁酸进行检测。这2篇专利中采用衍生化方式提取SCFAs，前处理繁琐，耗时长。
中国专利申请CN112014491A提供了一种短链脂肪酸的检测方法，配制不同浓度的短链脂肪酸标准品混合液，加入内标，采用气相色谱-质谱联用仪测试，求出线性回归方程；往测试样本中加入酸液及含内标的甲基叔丁基醚提取液进行提取，得到分离液，利用气相色谱-质谱联用仪测试所述分离液；将测试结果代入线性回归方程计算测试样品的短链脂肪酸含量。然而，该技术采用甲基叔丁基醚作为萃取剂，一是甲基叔丁基醚毒性较大，对于大批量样本前处理，对实验人员不友好；二是单独使用甲基叔丁基醚，能得到的色谱峰型一般，检测灵敏度也一般。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，采用甲基叔丁基醚和正己烷两步萃取法直接提取SCFAs并结合GC-MS进行检测，前处理简单，耗时短，提取更充分，回收率高；相比于单独使用甲基叔丁基醚提取SCFAs，更加安全可靠；采用正己烷复溶，更有利于保护色谱柱和质谱仪器。具体通过以下技术实现。
基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，包括以下步骤：
S1、配制不同浓度的含有11种短链脂肪酸的混合标准工作液，加入酸液和内标，进行GC-MS或GC-MS/MS检测，以11种短链脂肪酸的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，短链脂肪酸的浓度为横坐标，获得相应的线性回归方程；
S2、取人或动物的粪便、血浆或尿液样本，加入酸液进行预处理；然后加入第一萃取液，涡旋、振荡；再加入第二萃取液，涡旋、振荡；再加入内标，在冰上涡旋振荡，冰水浴中超声处理，离心取上清液；所述第一萃取液为体积比1:1 的甲基叔丁基醚、正己烷混合液，所述第二萃取液为正己烷；
S3、取步骤S2的上清液进行GC-MS或GC-MS/MS检测，与步骤S1中相应的线性回归方程进行比对，获得11种短链脂肪酸的含量。
优选地，11种短链脂肪酸分别为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、甲基戊酸、己酸、2-甲基己酸、正庚酸和正辛酸。
更优选地，使用GC-MS检测时，步骤S1中，不同浓度的含有11种短链脂肪酸混合标准工作液的配制方法为：
分别移取11种短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、 4-甲基戊酸、己酸、2-甲基己酸、正庚酸、正辛酸)的标准品，用第一萃取液分别配制成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00mM的含11种短链脂肪酸的混合标准工作液；
使用GC-MS/MS检测时，步骤S1中不同浓度的含有11种短链脂肪酸混合标准工作液的配制方法为：分别移取11种短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、4-甲基戊酸、己酸、2-甲基己酸、正庚酸、正辛酸)的标准品，用第一萃取液分别配制成0.01、0.05、0.20、1.00、5.00、10.00μM的含 11种短链脂肪酸的混合标准工作液。
更优选地，步骤S1中，分别取不同浓度的含有11种短链脂肪酸的混合标准工作液200μL，分别加入10μL的5M的酸液和50μL的0.5mM的内标进行GC-MS 检测，或者分别加入10μL的5M的酸液和50μL的50μM的内标进行GC-MS/MS 检测。
优选地，步骤S2具体为：取30-50mg固体样本或30-50μL液体样本，加入 10μL 5M的酸液，然后加入100μL第一萃取液，涡旋、振荡；再加入100μL第二萃取液，涡旋、振荡；再加入50μL内标，6500rpm冰上涡旋振荡10min，冰水浴中超声处理10min；最后4℃、12000rpm离心10min，-20℃静置30min。
更优选地，步骤S2中，涡旋、振荡的转速为5000-7000rpm，时间为5-10min。
优选地，步骤S3中，气相色谱分析条件为：采用毛细管色谱柱HP-INNOWAX 分离，规格为30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度260℃，进样量1μL，分流比 10:1；载气：氦气，柱流量1mL/min；色谱柱初始温度50℃，以5℃/min速率升温至150℃，再以10℃/min升温至250℃，保持2min；
使用GC-MS检测时，质谱条件为：采用单四级杆质谱，SIM采集模式，电子电离EI源，离子化电压为70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；传输线温度280℃；溶剂延迟时间6min；以空白为背景，质谱图均为扣除背景的结果；
使用GC-MS/MS检测时，质谱条件为：采用三重四级杆质谱，MRM采集模式，电子电离EI源，离子化电压为70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；传输线温度260℃；溶剂延迟时间6min；以空白为背景，质谱图均为扣除背景的结果。
更优选地，使用GC-MS检测时的SIM采集模式如下表1所示：
表1 11种短链脂肪酸和内标的SIM采集参数
Figure BDA0003565226570000031
Figure BDA0003565226570000041
使用GC-MS/MS检测时的MRM采集模式如下表2所示：
表2 11种短链脂肪酸和内标的MRM采集参数
Figure BDA0003565226570000042
优选地，所述酸液为浓度5M的盐酸溶液。
优选地，所述内标是将3-甲基戊酸用所述第一萃取液定容得到的溶液。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
1、本发明提供的定量检测方法能够快速准确的对生物样本中SCFAs含量较高的肠道内容物如粪便及血浆、尿液中痕量SCFAs的精准检测，具有样本用量少(仅需不超过50μL或50mg)、检测灵敏度高、适用广泛的优点。
2、本发明利用甲基叔丁基醚和正己烷为萃取液，采用两步萃取法直接提取SCFAs，样本无需衍生化处理，极大提高了检测效率；能高效提取目标物和最大化去除多余杂质，对短链脂肪酸的提取更充分，回收率高；相比单独使用醚类安全性更高。
3、结合高灵敏度离子源的三重四级杆气质联用技术，极大地提高了检测灵敏度，适用于精准医疗。
附图说明
图1为不同色谱纯试剂对SCFAs的提取效率对比图；
图2为实施例1的SIM采集模式下，标准品中11种SCFAs及内标的总离子流色谱图；
图3为实施例1的SIM采集模式下，人粪便中11种SCFAs及内标的总离子流色谱图；
图4为实施例1的SIM采集模式下，小鼠粪便中11种SCFAs及内标的总离子流色谱图；
图5为MRM采集模式下，标准品中11种SCFAs及内标的总离子流色谱图；
图6为MRM采集模式下，人尿液样本中11种SCFAs及内标的总离子流色谱图；
图7为MRM采集模式下，人血浆样本中11种SCFAs及内标的总离子流色谱图；
图8为人粪便样本定量结果图；
图9为小鼠粪便样本定量结果图；
图10为人血浆样本定量结果图；
图11为人尿液样本定量结果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
为达到对生物样本(粪便、血清、尿液样本)中的短链脂肪酸提取效率最优，本发明对有机溶剂甲基叔丁基醚、正己烷、二氯甲烷、丙酮，以及两步萃取液(第一步，甲基叔丁基醚：正己烷(体积比1:1)，第二步：正己烷等色谱纯试剂 (Two-step extractionsolution))进行提取优化。
图1为分别采用上述5种色谱纯试剂对同一健康成年人的粪便样提取的 SCFAs峰面积响应图，5种色谱纯试剂均提取到乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸等短链脂肪酸。经对比分析发现，采用甲基叔丁基醚与正己烷两步萃取法提取到的短链脂肪酸的峰面积响应高于甲基叔丁基醚；丙酮和甲醇提取后的样本有挂壁现象，说明提取不充分；二氯甲烷提取后的粪便样在提取液的上方，不利于取样；正己烷提取后萃取液中短链脂肪酸响应不高，说明单独采用正己烷提取效率不高。
因此本发明采用甲基叔丁基醚和正己烷两步萃取法。
实施例1：测定人、小鼠粪便样本中短链脂肪酸的含量
1、仪器：
Agilent气相色谱质谱联用仪7890A-5975C(美国Agilent Technology公司)；
小型台式冷冻离心机Heraeus Fresco 17(美国Thermo Fisher公司)；
漩涡混合器Vortex-genie 2(美国Scientific Industries公司)；
超声波清洗机SB-5200D(中国宁波新芝公司)；
可调移液器(Eppendorf，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL)。
2、标准品：
乙酸标准品(DR.E)；丙酸标准品(CNW)；异丁酸标准品(DR.E)；丁酸标准品(Nu-chek)；异戊酸标准品(DR.E)；戊酸标准品(Nu-chek)；4-甲基戊酸标准品(DR.E)；正己酸标准品(DR.E)；2-甲基己酸标准品(TCI)；正庚酸标准品(DR.E)；正辛酸标准品(CNW)；3-甲基戊酸标准品(Panphy)。
3、试剂：
甲基叔丁基醚(色谱纯，美国Fisher公司)；盐酸(分析纯，国药)；第一萃取液(甲基叔丁基醚和正己烷，体积比1:1，以下简称编号MIX01)；第二萃取液(正己烷，色谱纯，美国Fisher公司)。
4、实验材料：
人粪便样本由武汉生物样本库有限公司自行采集；小鼠粪便样本来自于华中科技大学生命科学与技术学院。
5、标准工作溶液：
包括11种短链脂肪酸和1种内标的混标储备液的配制及系列标准工作溶液的配制，内标为3-甲基戊酸，标准工作溶液配制的具体过程如下：
内标(工作液)：移取24.99μL 3-甲基戊酸，以MIX01定容至4mL，得到内标溶液储备液，用MIX01逐级稀释，得到内标工作液浓度为0.5mM；
混标储备液：分别移取57.24μL乙酸、14.90μL丙酸、18.57μL异丁酸、18.30 μL丁酸、22.07μL异戊酸、21.77μL戊酸、25.18μL4-甲基戊酸、25.07μL己酸、 28.37μL2-甲基己酸、28.37μL正庚酸、31.69μL正辛酸，以MIX01定容至4mL，得到同时含有11种短链脂肪酸的混标储备液；
系列标准工作溶液：分别准确移取适量体积的11种短链脂肪酸的混标储备液，用MIX01作溶剂，配制成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00mM的同时含11种短链脂肪酸的混合标准溶液；取各浓度级别的混合标准品溶液 200μL，再分别加入10μL的5M的HCL溶液和50μL的0.5mM的内标工作液，得到11种短链脂肪酸的系列标准工作溶液。
6、样本前处理：
(1)空白样本处理
取100μL的MIX01、100μL的正己烷至1.5mL离心管(预先加入10μL的 5M HCl溶液)，加入50μL的内标溶液，在冰上涡旋振荡(转速6500rpm，10min)，然后在冰水浴中28kHz左右超声10min，再将样本离心10min(4℃、12000rpm)， -20℃静置30min，上GC-MS检测。
(2)人、小鼠粪便样本处理
称取50mg的粪便样本至1.5mL离心管中(预先加入10μL的5M HCl溶液)，先加入100μL的MIX01溶剂，涡旋、振荡(6500rpm，时间为5min)；再加入 100μL的正己烷提取SCFAs，涡旋、振荡(6500rpm，时间为5min)；然后加入50μL的内标溶液，以6500rpm转速在冰上涡旋振荡10min，冰水浴中28kHz 左右超声10min，再将样本离心10min(4℃、12000rpm)，-20℃静置30min，上GC-MS检测。
7、GC-MS仪器分析条件：
毛细管色谱柱：HP-INNOWAX(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度260℃，进样量1μL，分流比10:1；柱流量1mL/min；色谱柱初始温度50℃，以5℃/min 速率升温至150℃，再以10℃/min升温至250℃，保持2min；载气：氦气(纯度99.999％)；
离子化方式：电子轰击源(EI)，离子化电压为70eV；SIM采集模式，采集参数如下表3所示；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；传输线温度280℃；溶剂延迟时间：6min；以空白为背景，所有质谱图均为扣除背景的结果。
表3 11种短链脂肪酸和内标的SIM采集参数
Figure BDA0003565226570000071
Figure BDA0003565226570000081
8、GC-MS分析结果：
在优化的实验条件下，采用SIM模式检测得到标准品、人粪便样本、小鼠粪便样本中11种SCFAs的总离子流色谱图如图2-4所示。
图2-4中的附加标记说明：1、乙酸，2、丙酸，3、异丁酸，4、丁酸，5、异戊酸，6、戊酸，7、3-甲基戊酸(内标物)，8、4-甲基戊酸，9、己酸，10、 2-甲基己酸，11、正庚酸，12、正辛酸。
SIM采集模式下，以11种SCFAs的峰面积与内标峰面积之比对浓度进行线性回归得到线性回归方程。根据3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)计算得到检出限LOD和定量限LOQ，如表4所示。
表4 SIM采集模式的11种短链脂肪酸的线性方程、线性范围、相关系数R2、LODs和LOQs
Figure BDA0003565226570000082
在人粪便样本中分别加入0.50、2.00、5.00mM的3个不同浓度水平的SCFAS 质控样本，每个浓度水平平行实验6次，考察方法的回收率及稳定性如表5所示；并连续测定7天，计算日内及日间相对标准偏差。方法学验证结果表明，11种SCFAs的线性关系良好(R2>0.99)，回收率为89.40-110.72％，日内RSD(n＝6) 不大于5.67％，日间RSD(n＝6)不大于7.23％，表明方法准确可靠，精密度良好，均符合2018版FDA生物样本分析方法验证指南中对回收率、精密度和准确度的要求。
表5 SIM采集模式的11种SCFAs的平均回收率及批内、批间相对标准偏差
Figure BDA0003565226570000091
通过绘制的内标曲线，得到人粪便样本、小鼠粪便样本中11种短链脂肪酸定量检测结果(n＝6)，如图8和图9所示。
实施例2：测定人血浆、尿液中短链脂肪酸的含量
1、仪器：
Agilent三重四级杆气相色谱质谱联用仪8890-7010B(美国Agilent Technology公司)；
小型台式冷冻离心机Heraeus Fresco 17(美国Thermo Fisher公司)；
漩涡混合器Vortex-genie 2(美国Scientific Industries公司)；
超声波清洗机SB-5200D(中国宁波新芝公司)；
可调移液器(Eppendorf，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL)。
2、标准品：与实施例1相同。
3、试剂：与实施例1相同。
4、实验材料：人血浆、尿液样本由武汉生物样本库有限公司自行采集获得。
5、标准工作溶液：
包括11种短链脂肪酸和1种内标的混标储备液的配制及系列标准工作溶液的配制，内标为3-甲基戊酸，标准工作溶液配制的具体过程如下：
内标(工作液)：移取24.99μL3-甲基戊酸，以MIX01定容至4mL，得到内标溶液储备液，用MIX01逐级稀释，得到内标工作溶液浓度为50μM；
混标储备液：与实施例1相同；
系列标准工作溶液：分别准确移取适量体积的11种短链脂肪酸的混标储备液，用MIX01作溶剂，配制成0.01、0.05、0.20、1.00、5.00、10.00μM的同时含11种短链脂肪酸的混合标准溶液，取各浓度级别的混合标准品溶液200μL，再分别加入10μL的5M的HCL溶液和50μL的50μM内标溶液，得到11种短链脂肪酸的系列标准工作溶液。
6、样本前处理：
(1)空白样本处理：与实施例1相同。
(2)人血浆、尿液样本处理：
取50μL的人血浆、尿液样本至1.5mL离心管中(预先加入10μL的5M HCl 溶液)，先加入100μL的MIX01溶剂，涡旋、振荡(6500rpm，时间为5min)；再加入100μL的正己烷提取SCFAs，涡旋、振荡(6500rpm，时间为5min)；然后加入50μL的内标溶液，以6500rpm转速在冰上涡旋振荡10min，冰水浴中28kHz左右超声10min，再将样本离心10min(4℃、12000rpm)，-20℃静置30min，上GC-MS/MS检测。
7、GC-MS/MS仪器分析条件：
毛细管色谱柱：HP-INNOWAX(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度260℃，进样量1μL，分流比10:1；柱流量1mL/min；色谱柱初始温度50℃，以5℃/min 速率升温至150℃，再以10℃/min升温至250℃；载气：氦气(纯度99.999％)；碰撞气：氮气(纯度99.999％)；
离子化方式：电子轰击源(EI)，离子化电压为70eV；MRM采集模式，采集参数如表6；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；传输线温度260℃；溶剂延迟时间：6min；以空白为背景，所有质谱图均为扣除背景的结果。
表6 11种短链脂肪酸和内标的MRM采集参数
Figure BDA0003565226570000111
8、GC-MS/MS分析结果
在优化的实验条件下，采用MRM模式检测得到标准品和人血浆、尿液中 11种SCFAs的总离子流色谱图如图5-7所示。
图5-7中的附图标记：1、乙酸，2、丙酸，3、异丁酸，4、丁酸，5、异戊酸，6、戊酸，7、3-甲基戊酸(内标物)，8、4-甲基戊酸，9、己酸，10、2-甲基己酸，11、正庚酸，12、正辛酸。
MRM采集模式下，以11种SCFAs的峰面积与内标峰面积之比对浓度进行线性回归得到线性回归方程。根据3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10) 计算得到检出限LOD和定量限LOQ，如表7所示。
表7 MRM采集模式的11种SCFAs的线性方程、线性范围、相关系数R2、LODs和LOQs
短链脂肪酸 线性方程 相关系数 线性范围(μM) 检出限(nM) 定量限(nM)
乙酸 Y＝4.2724X+1.6864 0.997 0.05-50 1.0170 3.3900
丙酸 Y＝0.7888X+0.1737 0.998 0.01-10 1.0490 3.4970
异丁酸 Y＝0.7320X+0.0114 0.999 0.01-10 1.0162 3.3870
丁酸 Y＝1.7945X+0.0406 0.999 0.01-10 1.0080 3.3600
异戊酸 Y＝1.0434X+0.0070 0.999 0.01-10 1.0322 3.4410
戊酸 Y＝1.8076X+0.0179 0.999 0.01-10 1.0203 3.4010
4-甲基戊酸 Y＝0.6023X+0.0030 0.999 0.01-10 1.0300 3.4340
己酸 Y＝3.2267X+0.0373 0.999 0.01-10 1.0030 3.3430
2-甲基己酸 Y＝1.8865X+0.0112 0.999 0.01-10 1.0231 3.4100
正庚酸 Y＝0.2869X+0.0008 0.999 0.01-10 1.0337 3.4460
正辛酸 Y＝1.1111X+0.0404 0.996 0.01-10 1.0439 3.4800
在人尿液样本中分别加入0.20、5.00、10.00μM的3个不同浓度水平的SCFAs 质控样本，每个浓度水平平行实验6次，考察方法的回收率及稳定性如表8所示，并连续测定7天，计算日内及日间相对标准偏差。方法学验证结果表明，11种 SCFAs的线性关系良好(R2>0.99)，回收率为83.21-112.24％，日内RSD(n＝6) 不大于5.81％，日间RSD(n＝6)不大于7.43％，表明方法准确可靠，精密度良好。
表8 MRM采集模式的11种SCFAs的平均回收率及批内、批间相对标准偏差
Figure BDA0003565226570000121
通过绘制的内标曲线，得到人血浆、尿液样本中11种短链脂肪酸定量检测结果(n＝6)，如图10和图11所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制不同浓度的含有11种短链脂肪酸的混合标准工作液，加入酸液和内标，进行GC-MS或GC-MS/MS检测，以11种短链脂肪酸的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，短链脂肪酸的浓度为横坐标，获得相应的线性回归方程；
S2、取人或动物的粪便、血浆或尿液样本，加入酸液进行预处理；然后加入第一萃取液，涡旋、振荡；再加入第二萃取液，涡旋、振荡；再加入内标，在冰上涡旋振荡，冰水浴中超声处理，离心取上清液；所述第一萃取液为体积比1:1的甲基叔丁基醚、正己烷混合液，所述第二萃取液为正己烷；
S3、取步骤S2的上清液进行GC-MS或GC-MS/MS检测，与步骤S1中相应的线性回归方程进行比对，获得11种短链脂肪酸的含量。
2.根据权利要求1所述的基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，11种短链脂肪酸分别为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、甲基戊酸、己酸、2-甲基己酸、正庚酸和正辛酸。
3.根据权利要求2所述的基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，使用GC-MS检测时，步骤S1中不同浓度的含有11种短链脂肪酸混合标准工作液的配制方法为：分别移取11种短链脂肪酸的标准品，用第一萃取液分别配制成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00mM的含11种短链脂肪酸的混合标准工作液；
使用GC-MS/MS检测时，步骤S1中不同浓度的含有11种短链脂肪酸混合标准工作液的配制方法为：分别移取11种短链脂肪酸的标准品，用第一萃取液分别配制成0.01、0.05、0.20、1.00、5.00、10.00μM的含11种短链脂肪酸的混合标准工作液。
4.根据权利要求3所述的基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤S1中，分别取不同浓度的含有11种短链脂肪酸的混合标准工作液200μL，分别加入10μL的5M的酸液和50μL的0.5mM的内标进行GC-MS检测，或者分别加入10μL的5M的酸液和50μL的50μM的内标进行GC-MS/MS检测。
5.根据权利要求1所述的基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤S2具体为：取30-50mg固体样本或30-50μL液体样本，加入10μL 5M的酸液，然后加入100μL第一萃取液，涡旋、振荡；再加入100μL第二萃取液，涡旋、振荡；再加入50μL内标，6500rpm冰上涡旋振荡10min，冰水浴中超声处理10min；最后4℃、12000rpm离心10min，-20℃静置30min。
6.根据权利要求5所述的基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤S2中，涡旋、振荡的转速为5000-7000rpm，时间为5-10min。
7.根据权利要求1所述的基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤S3中，气相色谱分析条件为：采用毛细管色谱柱HP-INNOWAX分离，规格为30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度260℃，进样量1μL，分流比10:1；载气：氦气，柱流量1mL/min；色谱柱初始温度50℃，以5℃/min速率升温至150℃，再以10℃/min升温至250℃，保持2min；
使用GC-MS检测时，质谱条件为：采用单四级杆质谱，SIM采集模式，电子电离EI源，离子化电压为70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；传输线温度280℃；溶剂延迟时间6min；以空白为背景，质谱图均为扣除背景的结果；
使用GC-MS/MS检测时，质谱条件为：采用三重四级杆质谱，MRM采集模式，电子电离EI源，离子化电压为70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；传输线温度260℃；溶剂延迟时间6min；以空白为背景，质谱图均为扣除背景的结果。
8.根据权利要求6所述的基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤S3中，使用GC-MS检测时的SIM采集模式为：
Figure FDA0003565226560000021
Figure FDA0003565226560000031
使用GC-MS/MS检测时的MRM采集模式为：
Figure FDA0003565226560000032
9.根据权利要求1-7任一项所述的基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述酸液为浓度5M的盐酸溶液。
10.根据权利要求1-7任一项所述的基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述内标是将3-甲基戊酸用所述第一萃取液定容得到的溶液。
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